தற்போதைய முகவரி: OX11 0DE, UK, டைமண்ட் கட்டிடம், ஹார்வெல் அறிவியல் மற்றும் புத்தாக்கப் பூங்கா, டயட்கோட், ஆக்ஸ்ஃபோர்ட்ஷயர், UK, டைமண்ட் லைட் சோர்ஸ் கோ., லிமிடெட்., மின்னணு உயிரியல் படமாக்கல் மையம்.
வினை மைய ஒளி அறுவடை வளாகம் 1 (RC-LH1) என்பது ஊதா நிற ஒளித்தாவர பாக்டீரியாக்களின் மைய ஒளிச்சேர்க்கைக் கூறு ஆகும். ரோடோப்சூடோமோனாஸ் பாலுஸ்ட்ரிஸிலிருந்து பெறப்பட்ட RC-LH1 வளாகத்தின் இரண்டு கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி அமைப்புகளை நாங்கள் அறிமுகப்படுத்தினோம். RC-LH114-W வளாகத்தின் 2.65-Å பிரிதிறன் அமைப்பானது, RC-ஐச் சுற்றியுள்ள 14 துணை அலகு LH1 வளையங்களைக் கொண்டுள்ளது, இது W புரதத்தால் தடைசெய்யப்படுகிறது. அதேசமயம், W புரதம் இல்லாத வளாகமானது, RC-ஆல் சூழப்பட்ட முழுமையான RC அமைப்பைக் கொண்டுள்ளது. இந்த அமைப்புகளின் ஒப்பீடு, RC-LH1 வளாகத்தில் குயினோனின் இயக்கவியல் பற்றிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது. இதில், RC QB தளத்தில் குயினோன் பிணைக்கப்படும்போது ஏற்படும் முன்னர் தீர்மானிக்கப்படாத உருவமைப்பு மாற்றங்கள் மற்றும் துணை குயினோன் பிணைப்புத் தளங்களின் இருப்பிடம் ஆகியவை அடங்கும், இவை குயினோன்களை RC-க்குக் கடத்த உதவுகின்றன. W புரதத்தின் தனித்துவமான அமைப்பு, LH1 வளையம் மூடுவதைத் தடுத்து, அதன் மூலம் குயினோன்/குயினோலோன் பரிமாற்றத்தை விரைவுபடுத்துவதற்கான ஒரு வழியை உருவாக்குகிறது.
ஒளிச்சேர்க்கையால் வழங்கப்படும் ஆற்றல் பூமியில் உள்ள ஏறக்குறைய அனைத்து உயிர்களையும் நிலைநிறுத்த முடியும், மேலும் இது சூரிய உயிரி தொழில்நுட்பத்திற்கு பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டுள்ளது. உலகளாவிய ஒளிச்சேர்க்கையை ஊக்குவிக்கும் அதே வேளையில், ஊதா நிற ஒளி ஊட்ட பாக்டீரியாக்கள் பல்வேறு ஆற்றல் முறைகளையும் வளர்சிதை மாற்றத் திறன்களையும் வெளிப்படுத்துகின்றன. அவை ஒளிச்சேர்க்கையைத் தவிர்த்து இருளில் பிற ஊட்ட பாக்டீரியாக்களாக வளர முடியும், நைட்ரஜன் மற்றும் கார்பன் டை ஆக்சைடை நிலைநிறுத்த முடியும், ஹைட்ரஜனை உற்பத்தி செய்ய முடியும், மற்றும் நறுமணச் சேர்மங்களைச் சிதைக்க முடியும் (1-3). இந்த செயல்முறைகளுக்கு ஆற்றலை வழங்குவதற்காக, ஒளியானது விரைவாகவும் திறமையாகவும் வேதியியல் ஆற்றலாக மாற்றப்பட வேண்டும். ஒளி-பிடிப்பு ஆன்டெனா வளாகம் ஒளியை உறிஞ்சி, பிடிக்கப்பட்ட ஆற்றலை வினை மையத்திற்கு (RC) மாற்றும்போது இந்த செயல்முறை தொடங்குகிறது, இதன் மூலம் மின்னூட்டப் பிரிப்பு தொடங்குகிறது (4 – 7). ஊதா நிற ஒளி ஊட்ட பாக்டீரியாக்களில் ஒளிச்சேர்க்கையின் அடிப்படை அலகு வகை 2 வினை மையத்தால் ஆனது, இது ஒளி-அறுவடை வளாகம் 1 (LH1) ஆல் சூழப்பட்டு, வினை மையம்-LH1 மைய வளாகத்தை உருவாக்குகிறது. LH1 வளைந்த αβ ஹெட்டிரோடைமர்களின் வரிசையால் ஆனது, அவற்றில் ஒவ்வொன்றும் இரண்டு பாக்டீரிய குளோரோபில் (BChl) a மூலக்கூறுகளையும் ஒன்று அல்லது இரண்டு கரோட்டினாய்டுகளையும் பிணைக்கிறது (8-12). மிகவும் எளிமையான LH1 ஆன்டெனா, RC-ஐ (9-13) ஒரு மூடிய வளையத்தில் சூழ்ந்திருக்கும் 16 அல்லது 17 αβ ஹெட்டிரோடைமர்களைக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் மற்ற மையக் கலவைகளில், டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் பெப்டைடுகள் சுற்றியுள்ள LH1-இன் தொடர்ச்சியைத் தடுக்கின்றன, இதன் மூலம் RC மற்றும் சைட்டோக்ரோம் bc1 கலவைக்கு (11, 13-15) இடையில் குயினோல்/குயினோன் பரவலை ஊக்குவிக்கின்றன. ஊதா நிற ஒளித்தாவரமான ரோடோப்சூடோமோனாஸ் (Rps.) ஒளிச்சேர்க்கையை ஆதரிக்கும் ஆற்றல் மற்றும் எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்தைப் புரிந்துகொள்ளக்கூடிய ஒரு மாதிரி உயிரினமாகும். Rps.-இன் முதல் படிக அமைப்பு, பாலுஸ்ட்ரிஸ் RC-LH1 கலவையின் மாதிரியாகும், இது 15 ஹெட்டிரோடைமெரிக் LH1 வளையங்களால் சூழப்பட்ட RC ஆகும், அவை "புரோட்டீன் W" (14) எனப்படும் அறியப்படாத புரதத்தால் குறுக்கிடப்படுகின்றன. புரோட்டீன்-W பின்னர் RPA4402 என அடையாளம் காணப்பட்டது, இது மூன்று கணிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்சுகளை (TMH) (16) கொண்ட, பண்பறியப்படாத 10.5kDa புரதமாகும். RC-L, M (pufL, pufM) மற்றும் LH1α, β (pufA, pufB) துணை அலகுகளைக் குறியிடும் மரபணுக்களுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் பெயரிடல் முறையுடன் ஒத்திசைவாக இருப்பதற்காக, புரதம் W-ஐக் குறியிடும் rpa4402 மரபணுவை pufW என மறுபெயரிட நாங்கள் முன்மொழிகிறோம். சுவாரஸ்யமாக, புரதம்-W ஆனது RC-LH1-இல் சுமார் 10% மட்டுமே காணப்படுகிறது, இது Rps. palustris இரண்டு வெவ்வேறு RC-LH1 தொகுப்புகளை உருவாக்குகிறது என்பதை வெளிப்படுத்துகிறது. இங்கே, இரண்டு மையத் தொகுப்புகளின் உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட கிரையோ-EM (கிரையோ-EM) கட்டமைப்புகளை நாங்கள் அறிக்கையிடுகிறோம்; ஒன்று புரதம் W மற்றும் 14 αβ ஹெட்டிரோடைமர்களுடன் கூடியது, மற்றொன்று புரதம் W இல்லாமலும், மூடப்பட்ட 16 ஹெட்டிரோடைமர் LH1 வளையத்துடனும் உள்ளது. எங்கள் கட்டமைப்பு, Rps. palustris-இன் RC-LH1 தொகுப்பைப் பற்றிய புரிதலில் ஒரு படிநிலை மாற்றத்தைக் குறிக்கிறது, ஏனெனில் நாங்கள் ஒவ்வொரு மாறுபாட்டின் ஒருபடித்தான தொகுதியையும் பகுப்பாய்வு செய்துள்ளோம், மேலும் ஒவ்வொரு பெப்டைடு மற்றும் பிணைக்கப்பட்ட நிறமிகள், தொடர்புடைய லிப்பிடுகள் மற்றும் குயினோன்களைத் தெளிவாகக் குறிப்பிடுவதற்குப் போதுமான தெளிவுத்திறனைக் கொண்டுள்ளோம். இந்தக் கட்டமைப்புகளின் ஒப்பீடு, இதுவரை வேறு எந்த RC-LH1 கூட்டு அமைப்பிலும் காணப்படாத மூன்று TMH புரதங்கள்-W, குயினோன்/குயினோலோன் பரிமாற்றத்தை விரைவுபடுத்துவதற்காக ஒரு குயினோன் வழித்தடத்தை உருவாக்குகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. பல பாதுகாக்கப்பட்ட லிப்பிட் மற்றும் குயினோன் பிணைப்புத் தளங்கள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் குயினோன் மற்றும் RC இணைந்த பிறகு ஏற்படும் ஒரு புதிய உருவமைப்பு மாற்றத்தை நாங்கள் வெளிப்படுத்தியுள்ளோம்; இது ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட ஒளிச்சேர்க்கை உயிரினங்களின் ஒளித்தொகுப்பு அமைப்பு II (PSII) RC-க்கு பொருத்தமானதாக இருக்கலாம். எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள், ஊதா நிற ஒளிச்சேர்க்கை பாக்டீரியாவின் RC-LH1 மையக் கூட்டு அமைப்பில் உள்ள குயினோன்/குயினோலோன் பிணைப்பு மற்றும் பரிமாற்றத்தின் இயக்கவியல் குறித்த புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன.
Rps. palustris-ல் காணப்படும் இரண்டு சிக்கலான அமைப்புகளைப் பற்றிய விரிவான ஆய்வை எளிதாக்கும் பொருட்டு, ஒவ்வொரு RC-LH1-ஐயும் உயிர்வேதியியல் முறைகள் மூலம் தனிமைப்படுத்துகிறோம். புரதம் W-குறைபாடுள்ள சிக்கலான அமைப்பு (இனி ΔpufW எனக் குறிப்பிடப்படுகிறது) pufW மரபணு இல்லாத திரிபிலிருந்து (16) சுத்திகரிக்கப்பட்டது, மேலும் ஒரே ஒரு RC-LH1 சிக்கலான அமைப்பை மட்டுமே உற்பத்தி செய்ய முடியும். புரதம் W-ஐக் கொண்ட சிக்கலான அமைப்பு ஒரு திரிபினால் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது. இந்த திரிபின் புரதம் W அதன் C-முனையில் 10x His குறிச்சொல்லுடன் மாற்றியமைக்கப்படுகிறது, இதனால் புரதம் W-ஐக் கொண்ட சிக்கலான அமைப்பை, உலோகத்தை நிலைநிறுத்துவதன் மூலம் புரதம் W இல்லாத பெரும்பாலானவற்றுடன் திறம்பட இணைக்க முடியும். இந்த சிக்கலான அமைப்பு பிணைப்பு நிறப்பிரிகை (IMAC) மூலம் திறம்பட பிரிக்கப்படுகிறது (16).
படம் 1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, இரண்டு கூட்டுக்கட்டமைப்புகளும் ஒரு LH1 ஆன்டெனாவால் சூழப்பட்ட மூன்று துணை அலகுகளைக் கொண்ட RC-ஐ (RC-L, RC-M மற்றும் RC-H) கொண்டுள்ளன. புரோட்டீன்-W இல்லாத கூட்டுக்கட்டமைப்பின் 2.80-Å அமைப்பானது, RC-ஐ முழுமையாகச் சூழ்ந்துள்ள ஒரு மூடிய LH1 வளையத்தை உருவாக்கும் 16 αβ ஹெட்டிரோடைமர்களைக் காட்டுகிறது; இது இனிமேல் RC-LH116 கூட்டுக்கட்டமைப்பு எனக் குறிப்பிடப்படுகிறது. புரோட்டீன்-W-ஐக் கொண்ட கூட்டுக்கட்டமைப்பின் 2.65Å அமைப்பானது, புரோட்டீன்-W-ஆல் குறுக்கிடப்பட்ட 14-ஹெட்டிரோடைமர் LH1-ஐக் கொண்டுள்ளது; இது இனிமேல் RC-LH114-W எனக் குறிப்பிடப்படுகிறது.
(A மற்றும் B) சேர்மத்தின் மேற்பரப்பு பிரதிநிதித்துவம். (C மற்றும் D) கோல்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட பிணைக்கப்பட்ட நிறமிகள். (E மற்றும் F) சைட்டோபிளாஸ்மிக் மேற்பரப்பில் இருந்து கவனிக்கப்பட்ட வளாகங்கள், பெப்டைடுகள் மற்றும் LH1 துணை அலகுகளை கார்ட்டூன்களில் சித்தரிக்கின்றன, மேலும் புரதம்-W இடைவெளியில் இருந்து கடிகார திசையில் எண்ணிடப்பட்டுள்ளன [Rba எண்ணிடலுடன் ஒத்துப்போகிறது. ஸ்பேராய்டஸ் வளாகம் (13)]. LH1-α க்கு, புரத துணை அலகின் நிறம் மஞ்சள்; LH1-β க்கு, புரத துணை அலகின் நிறம் நீலம்; புரதம்-W க்கு, புரதம் சிவப்பு; RC-H க்கு, அது சயான்; RC-L க்கு, அது ஆரஞ்சு; RC-M க்கு, மெஜந்தா. துணைக்காரணிகள் கோல்களால் குறிப்பிடப்படுகின்றன, பச்சை நிறம் BChl மற்றும் BPh a மூலக்கூறுகளைக் குறிக்கிறது, ஊதா நிறம் கரோட்டினாய்டுகளைக் குறிக்கிறது, மற்றும் மஞ்சள் நிறம் UQ10 மூலக்கூறுகளைக் குறிக்கிறது. (G மற்றும் H) RC-LH114-W கூட்டுப்பொருள் (G) மற்றும் RC-LH116 கூட்டுப்பொருள் (H) ஆகியவற்றின் சமமான பகுதியில் உள்ள புரதம்-W இடைவெளியின் பெரிதாக்கப்பட்ட தோற்றம். துணைக்காரணிகள் இடைவெளியை நிரப்பும் வடிவத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன, பிணைக்கப்பட்ட குயினோன் நீல நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (G)-இல் புரதம்-W இடைவெளி ஒரு நீல நிற புள்ளியிட்ட கோட்டால் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் (H)-இல் LH116 வளையத்தில் குயினோன்/குயினோலோல் பரவும் சிறிய துளைகள் ஒரு கருப்பு நிற புள்ளியிட்ட கோட்டால் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டுள்ளன.
படம் 1 (A மற்றும் B) ஆனது, LH1αβ ஹெட்டிரோடைமர்களின் திறந்த அல்லது மூடிய வரிசைகளால் சூழப்பட்ட RC-ஐக் காட்டுகிறது, அவற்றில் ஒவ்வொன்றும் இரண்டு BChl மற்றும் ஒரு கரோட்டினாய்டைப் பிணைக்கிறது (படம் 1, C மற்றும் D). முந்தைய ஆய்வுகள் Rps என்பது LH1 காம்ப்ளக்ஸ் என்பதைக் காட்டியுள்ளன. ஸ்பைருலினா சாந்தினின் உயிர் தொகுப்புப் பாதையில், இந்த இனங்கள் கரோட்டினாய்டுகளின் கலப்புத் தொகுதிகளைக் கொண்டுள்ளன (17). இருப்பினும், ஸ்பைரோபைராக்சாந்தின் ஆதிக்கம் செலுத்தும் கரோட்டினாய்டு ஆகும், மேலும் அதன் அடர்த்தி திருப்திகரமாக உள்ளது. எனவே, அனைத்து LH1 பிணைப்புத் தளங்களிலும் ஸ்பைராக்சாந்தினை மாதிரியாகக் கொள்ள நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம். ஆல்பா மற்றும் பீட்டா பாலிபெப்டைடுகள் குறுகிய சவ்வு வெளிப்புறப் பகுதிகளைக் கொண்ட ஒற்றை TMH-கள் ஆகும் (படம் 1, A, B, E, மற்றும் F). C-முனையில் 17 எச்சங்களின் அடர்த்தி காணப்படவில்லை என்றாலும், இரண்டு காம்ப்ளக்ஸுகளிலும் ஆல்பா பாலிபெப்டைடு Met1 முதல் Ala46 வரை பிளவுபட்டது. RC-LH116-ல் β பாலிபெப்டைடு Gly4-லிருந்து Tyr52 ஆகவும், RC-LH114-W-ல் Ser5-லிருந்து Tyr52 ஆகவும் ஒடுக்கப்பட்டது. 3 அல்லது 4 N-முனை அல்லது 13 C-முனை எச்சங்களின் அடர்த்தி எதுவும் காணப்படவில்லை (படம் S1). இயல்புவகை திரிபிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட கலப்பு RC-LH1 தொகுப்பின் நிறை நிறமாலையியல் பகுப்பாய்வு, விடுபட்ட பகுதியானது இந்தப் பெப்டைடுகளின் வேற்றுப் பிளவின் விளைவாகும் என்பதைக் காட்டியது (படம் S1 மற்றும் S2). α-Met1-இன் N-முனை ஃபார்மைலேற்றமும் காணப்பட்டது (f). இந்தப் பகுப்பாய்வு, α-பெப்டைடு fMet1 முதல் Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 வரையிலான எச்சங்களையும், β-பெப்டைடு Ser2 முதல் Ala53 வரையிலான எச்சங்களையும் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டியது, இது குறைந்த வெப்பநிலை EM அடர்த்தி வரைபடத்துடன் நன்கு ஒத்துப்போகிறது.
α-His29 மற்றும் β-His36 ஆகியவற்றின் ஒருங்கிணைப்பு BChls-ஐ நேருக்கு நேர் வைக்கிறது; ஒவ்வொரு αβ ஹெட்டிரோடைமரும் அதன் அண்டை அயலாருடன் இணைந்து RC எக்சைட்டான் இணைக்கப்பட்ட நிறமி வரிசையைச் சுற்றி ஒரு திறந்த வளையத்தை (RC-LH114-W) அல்லது ஒரு மூடிய வளையத்தை (RC-LH116) உருவாக்குகிறது (படம் 1, C மற்றும் D). RC-LH114-W-இன் 877 nm பட்டையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​RC-LH116-இன் 880 nm உறிஞ்சுதல் சிவப்பு நகர்வு 3 nm ஆகும் (படம் 2A). இருப்பினும், வட்ட இருவண்ண நிறமாலை கிட்டத்தட்ட ஒரே மாதிரியாக உள்ளது (படம் 2B), இது திறந்த மற்றும் மூடிய வளையங்களுக்கு இடையே தெளிவான வேறுபாடு இருந்தாலும், BChls-இன் உள்ளூர் சூழல் மிகவும் ஒத்ததாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த உறிஞ்சுதல் சிவப்பு நகர்வானது, மூடிய வளையத்தில் குறைக்கப்பட்ட வெப்ப இயக்கம் மற்றும் அதிகரித்த நிலைத்தன்மை (18, 19), மூடிய வளையத்தால் ஏற்படும் நிறமி இணைப்பில் ஏற்படும் மாற்றம் (20, 21), அல்லது இந்த இரண்டு விளைவுகளின் கலவை (11) ஆகியவற்றின் விளைவாக இருக்கலாம்.
(A) புற ஊதா/கண்ணுக்குப் புலப்படும்/அண்மை அகச்சிவப்பு உட்கவர் நிறமாலை, இதன் சிகரங்கள் அவற்றுடன் தொடர்புடைய நிறமிகளைக் கொண்டு குறிக்கப்பட்டு, 775 nm-இல் உள்ள BPh சிகரத்திற்கு இயல்பாக்கப்பட்டுள்ளன. (B) 805 nm-இல் உள்ள BChl உட்கவர்விற்கு இயல்பாக்கப்பட்ட வட்ட இருவண்ண நிறமாலை. (C மற்றும் D) RC-LH114-W கூட்டுப்பொருள் (C) மற்றும் RC-LH116 கூட்டுப்பொருள் (D) ஆகியவற்றின் கால-தீர்மான உட்கவர் நிறமாலைகளிலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ΔA நிறமாலைகள். சிறந்த ஒப்பீட்டிற்காக, அனைத்து நிறமாலைகளும் 0.2 ps-இல் −A-இன் ∆A-க்கு இயல்பாக்கப்பட்டுள்ளன. (E) பல்வேறு செறிவுகளில் UQ2 முன்னிலையில் கதிர்வீச்சுக்குப் பிறகு சைட்டோக்ரோம் c2 ஆக்ஸிஜனேற்றத்தின் வீதம் (மூலத் தரவுகளுக்கு படம் S8-ஐப் பார்க்கவும்). (F) குறைந்த, நடுத்தர அல்லது அதிக செறிவுள்ள ஒளியின் கீழ் (முறையே 10, 30 அல்லது 300μMm-2 s-1) வளர்க்கப்பட்ட செல்களில், தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட கூட்டுப்பொருளில் உள்ள புரதம் W மற்றும் RC-L துணை அலகுகள் மற்றும் பிரிக்கப்பட்ட சவ்வு விகிதம். SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோஃபோரெசிஸ் மற்றும் இம்யூனோஅஸ்ஸே மூலம் புரதத்தின் அளவைத் தீர்மானிக்கவும் (மூலத் தரவுகளுக்கு படம் S9-ஐப் பார்க்கவும்). தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட RC-LH114-W கூட்டுப்பொருளுடன் ஒப்பிட்டு விகிதத்தைத் தீர்மானிக்கவும். அந்தக் கூட்டுப்பொருளில் உள்ள RC-L மற்றும் புரதம்-W ஆகியவற்றின் ஸ்டோக்கியோமெட்ரிக் விகிதம் 1:1 ஆகும்.
RC-LH114-W-இன் உருமாற்றப்பட்ட αβ14 வளையத்தில் நிலை 1-இல் உள்ள BChls (படம் 1, A, C, மற்றும் E), RC-LH116-இல் உள்ள அதற்கு இணையான BChls-ஐ விட (படம் 1, B, D, மற்றும் F, மற்றும் படம் S3) RC முதன்மை கொடையாளிக்கு (P) 6.8Å அருகில் உள்ளன; இருப்பினும், இவ்விரு அணைவுச் சேர்மங்களின் நிலைமாறும் உட்கிரகிப்பு இயக்கவியல், RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116-க்கு, LH1-இலிருந்து RC-க்கான கிளர்ச்சி ஆற்றல் பரிமாற்ற நேர மாறிலிகள் முறையே 40 ±4 மற்றும் 44±3 ps (படம் 2, C மற்றும் D, படம் S4 மற்றும் அட்டவணை S2) என்பதைக் காட்டுகின்றன. மேலும், RC-க்குள் நிகழும் மின்னணுப் பரிமாற்றத்திலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு எதுவும் இல்லை (படம் S5 மற்றும் அது தொடர்பான துணை உரை). LH1 மற்றும் RC-P-க்கு இடையேயான ஆற்றல் பரிமாற்ற நேரத்தின் நெருங்கிய ஒத்திருப்பு, இரண்டு LH1 வளையங்களிலும் உள்ள பெரும்பாலான BChl-களின் ஒத்த தூரம், கோணம் மற்றும் நிலை ஆற்றல் ஆகியவற்றால் ஏற்படுகிறது என்று நாங்கள் சந்தேகிக்கிறோம். குறைந்தபட்ச தூரத்தை அடைவதற்காக LH1 ஆற்றல் வடிவத்தை ஆராய்வது, உகந்ததல்லாத தளங்களிலிருந்து RC-க்கு நேரடி ஆற்றல் பரிமாற்றத்தை விட வேகமானது அல்ல என்று தெரிகிறது. கட்டமைப்புப் பகுப்பாய்விற்காக, RC-LH114-W-இல் உள்ள திறந்த-வளைய LH1 வளையம் குறைந்த வெப்பநிலை நிலைகளில் முக்கியமற்ற வெப்ப இயக்கத்திற்கு உள்ளாகலாம், மேலும் RC 1-இன் நிலையில் உள்ள βBChl-களின் நிறமியாக்கத் தூரத்திலிருந்து அறை வெப்பநிலையில் ஒரு நீண்ட αβ14 வளைய அமைப்பு உள்ளது.
RC-LH116 கூட்டுப்பொருள் 32 BChl-களையும் 16 கரோட்டினாய்டுகளையும் கொண்டுள்ளது, மேலும் அதன் ஒட்டுமொத்த அமைப்பானது Thermochromatium (Tch.) pidpidum [புரோட்டீன் டேட்டா பேங்க் (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 திரிபு ( PDB ID 7C9R) (12) மற்றும் பச்சை பாசி (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்டதைப் போலவே உள்ளது. சீரமைப்பிற்குப் பிறகு, αβ ஹெட்டிரோடைமர்களின் நிலைகளில், குறிப்பாக 1-5, 15 மற்றும் 16 ஆகியவற்றில் சிறிய விலகல்கள் மட்டுமே காணப்பட்டன (படம் S6). புரோட்டீன்-W-ன் இருப்பு LH1-ன் அமைப்பில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. அதன் மூன்று TMH-கள் குறுகிய வளையங்களால் இணைக்கப்பட்டுள்ளன, இதில் N-முனையானது கூட்டுப்பொருளின் லுமென் பக்கத்திலும், C-முனையானது சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்திலும் அமைந்துள்ளன (படம் 1A மற்றும் 3, A முதல் D வரை). புரோட்டீன்-W பெரும்பாலும் நீர் விலக்கும் தன்மை கொண்டது (படம் 3B), மேலும் TMH2 மற்றும் TMH3 ஆகியவை LH1αβ-14 உடன் இடைவினை புரிந்து ஒரு சவ்விடைப் பரப்பை உருவாக்குகின்றன (படம் 3, B மற்றும் E முதல் G வரை). இந்த இடைமுகம், சவ்விடைப் பகுதியில் உள்ள Phe, Leu மற்றும் Val எச்சங்களால் முக்கியமாக ஆனது. இந்த எச்சங்கள் நீர் விலக்கும் அமினோ அமிலங்கள் மற்றும் αβ-14 நிறமிகளுடன் அடுக்கப்பட்டுள்ளன. சில முனைவுள்ள எச்சங்களும் இந்த இடைவினைக்குப் பங்களிக்கின்றன; அவற்றுள், சிக்கலான குழியின் மேற்பரப்பில் உள்ள W-Thr68 மற்றும் β-Trp42 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பும் அடங்கும் (படம் 3, F மற்றும் G). சைட்டோபிளாசத்தின் மேற்பரப்பில், Gln34 ஆனது αβ-14 கரோட்டினாய்டுகளின் கீட்டோ குழுவிற்கு அருகில் அமைந்துள்ளது. கூடுதலாக, n-டோடெசில் β-d-மால்டோசைடு (β-DDM) மூலக்கூறு கண்டறியப்பட்டது, மேலும் அதன் நீர் விலக்கும் வால் புரோட்டீன்-W மற்றும் αβ-14 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான இடைமுகம் வரை நீண்டுள்ளது, மற்றும் அதன் கொழுப்பு வால் உடற்பகுதியில் அமைந்திருக்கலாம். புரதம் W மற்றும் RCH ஆகியவற்றின் C-முனைப் பிரிப்புப் பகுதிகள் மிகவும் நெருக்கமாக உள்ளன, ஆனால் குறிப்பிட்ட இடைவினைகளை உருவாக்கும் வரம்பிற்குள் இல்லை என்பதையும் நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 1, A மற்றும் E). இருப்பினும், இந்த இரண்டு புரதங்களின் பிரிக்கப்படாத C-முனை அமினோ அமிலங்களில் இடைவினைகள் இருக்கலாம், அவை RC-LH114-W கூட்டு அமைப்பின் உருவாக்கத்தின் போது புரதம்-W-ஐ ஈர்ப்பதற்கான ஒரு வழிமுறையை வழங்கக்கூடும்.
(A) கார்ட்டூன் வடிவத்தில் LH1αβ14 உடன் இடைமுகத்தை எதிர்கொள்ளும் புரதம்-W, ஒரு தடி வடிவ பக்கச் சங்கிலியைக் (சிவப்பு) கொண்டுள்ளது, இது நிலைமின்னழுத்த வரைபடத்தின் ஒரு பகுதியில் (0.13 விளிம்பு மட்டத்துடன் கூடிய ஒளிபுகும் சாம்பல் மேற்பரப்பு) காட்டப்பட்டுள்ளது. (B) புரதம்-W ஒரு நீர்வெறுப்பு நிற மேற்பரப்பால் குறிப்பிடப்படுகிறது. முனைவுள்ள மற்றும் மின்னூட்டம் பெற்ற பகுதிகள் சயான் நிறத்திலும், நீர்வெறுப்புப் பகுதிகள் வெள்ளை நிறத்திலும், மற்றும் அதிக நீர்வெறுப்புப் பகுதிகள் ஆரஞ்சு நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளன. (C மற்றும் D) கார்ட்டூனில் குறிப்பிடப்பட்ட புரதம்-W, அதன் திசையமைவு (A)-இல் உள்ளதைப் போன்றது (C), மற்றும் 180° சுழற்றப்பட்டது (D). வரிசைமுறையில் உள்ள நிலையின்படி, வேறுபடுத்தக்கூடிய எச்சங்கள் ஒரு வானவில் வண்ணத் திட்டத்தைப் பின்பற்றுகின்றன, இதில் N-முனை நீலமாகவும் C-முனை சிவப்பாகவும் உள்ளது. (E) (A)-இல் உள்ள அதே பார்வையில் புரதம்-W, மற்றும் புரதம்-W:LH1 இடைமுகத்தில் உள்ள எச்சங்கள் இணைக்கப்பட்ட குறிகளுடன் கூடிய தடிகளால் குறிப்பிடப்படுகின்றன. (F) கார்ட்டூன் சித்தரிப்பில் புரோட்டீன்-W ஆனது (E) மற்றும் LH1αβ14-ஐப் பொறுத்தும், பட்டை சித்தரிப்பில் இடைமுக எச்சங்களைப் பொறுத்தும் 90° சுழற்றப்பட்டுள்ளது. பீட்டா பாலிபெப்டைடிலிருந்து தொங்கும் எச்சங்கள் குறியிடப்பட்டுள்ளன. துணைக்காரணியானது படம் 1-இன் நிறத்துடன் பொருந்தும் ஒரு பட்டையாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது, சிதைக்கப்பட்ட β-DDM சாம்பல் நிறத்திலும், ஆக்ஸிஜன் சிவப்பு நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளன. (G) (F)-இல் உள்ள காட்சியானது 180° சுழற்றப்பட்டுள்ளது, இதில் குறியிடப்பட்ட ஆல்பா பாலிபெப்டைடின் முக்கிய எச்சங்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன.
புரோட்டீன்-W ஒரு αβ ஹெட்டிரோடைமரை (படம் 1F-இல் 15-ஆவது) இடமாற்றம் செய்கிறது, இதன் மூலம் வளைய மூடுதலைத் தடுத்து முதல் மூன்று αβ ஹெட்டிரோடைமர்களைச் சாய்க்கிறது. படலத்தின் செங்குத்துக்கோட்டைப் பொறுத்து முதல் αβ-1 ஹெட்டிரோடைமரின் அதிகபட்ச சாய்வுக் கோணம் 25° முதல் 29° வரை இருந்தது (படம் 1, A மற்றும் E) எனக் காணப்பட்டது; இது RC A ஷார்ப் கான்ட்ராஸ்ட்-LH116-இல் உள்ள αβ-1-இன் 2° முதல் 8° வரையிலான சாய்வினால் உருவானது (படம் 1, B மற்றும் F). இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது ஹெட்டிரோடைமர்கள் முறையே 12° முதல் 22° வரையிலும் மற்றும் 5° முதல் 10° வரையிலும் சாய்ந்துள்ளன. RC-யின் ஸ்டெரிக் தடையின் காரணமாக, αβ-1-இன் சாய்வானது இரண்டாவது ஜோடி αβ-ஐ (இது படம் 1F-இல் உள்ள 16-வது αβ-க்கு ஒத்திருக்கிறது) உள்ளடக்கவில்லை, இதனால் LH1 வளையத்தில் ஒரு தெளிவான இடைவெளி உருவாகிறது (படம் 1, A மற்றும் E). இரண்டு αβ ஹெட்டிரோடைமர்கள் இல்லாததாலும், அதனுடன் நான்கு BChl மற்றும் இரண்டு கரோட்டினாய்டுகள் இழக்கப்பட்டதாலும், எந்த கரோட்டினாய்டுகளும் முறுக்கப்பட்ட αβ-1 துணை அலகில் பிணைவதில்லை. இதன் விளைவாக, 13 வெஜிடேரியன் கரோட்டினாய்டுகளையும் 28 BChl-களையும் கொண்ட ஒரு LH114-W வளையம் உருவாகிறது. αβ1 முதல் 7 வரையிலான பகுதிகளில் உள்ள இரண்டு சிக்கலான அமைப்புகளின் உள்ளூர் தெளிவுத்திறன் மதிப்பீடுகள், LH1 வளையத்தின் மற்ற பகுதிகளை விடக் குறைவாக உள்ளன. இது RC QB தளத்திற்கு அருகிலுள்ள LH1 துணை அலகின் உள்ளார்ந்த நெகிழ்வுத்தன்மையைப் பிரதிபலிக்கக்கூடும் (படம் 4).
RC-LH114-W (A மற்றும் B) மற்றும் RC-LH116 (C மற்றும் D) ஆகியவற்றின் படங்கள், படம் 1-இன் அதே மேல் தோற்றம்/பக்கவாட்டுத் தோற்றம் (A மற்றும் B) (A மற்றும் C) மற்றும் குழி மேற்பரப்பிலிருந்து (B மற்றும் D) காட்டப்பட்டுள்ளன. வண்ணக் குறியீடுகள் வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
1:14 என்ற ஸ்டோக்கியோமெட்ரிக் விகிதத்தைக் கொண்ட ஒரே ஒரு சிறப்பியல்பு மைய வளாகம் ரோடோகாக்கஸ் ஸ்பேராய்டிஸ் (Rba.) RC-LH1-PufX டைமர் (13) ஆகும். இருப்பினும், புரதம் W மற்றும் PufX ஆகியவற்றுக்கு வெளிப்படையான ஹோமாலஜி இல்லை, மேலும் அவை அந்தந்த LH1 கட்டமைப்புகளில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகின்றன. PufX என்பது ஒரு ஒற்றை TMH ஆகும், இது ஒரு N-முனை சைட்டோபிளாஸ்மிக் டொமைனைக் கொண்டுள்ளது, இது Rps. palustris LH116αβ-16 க்கு ஒத்த நிலையில் RC-H துணை அலகின் (13) சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்துடன் தொடர்பு கொள்கிறது. PufX, RC-LH1 மற்றும் சைட்டோக்ரோம் bcl வளாகத்திற்கு இடையில் குயினோன்/குயினோலோன் பரிமாற்றத்திற்கான ஒரு சேனலை உருவாக்குகிறது மற்றும் அனைத்து Rba. ஸ்பேராய்டிஸ் மைய வளாகத்திலும் (13) உள்ளது. மோனோமர்-மோனோமர் இடைமுகம் Rba. RC-LH114-W-இல், புரதம் W-இன் பிணைப்பு நிலையில் ஸ்பேராய்டுகளின் RC-LH1-PufX டைமர் அமைந்துள்ளது, மேலும் PufX மற்றும் புரதம்-W-ஆல் தூண்டப்பட்ட இடைவெளி ஒரு சமமான நிலையில் உள்ளது (படம் S7A). RC-LH114-W-இல் உள்ள இடைவெளியானது, புரதம் W அல்லது PufX உடன் தொடர்பில்லாத பெப்டைடுகளால் உருவாக்கப்பட்ட சூடோமோனாஸ் ரோசியா LH1-இன் கருதுகோள் குயினோன் சேனலுடனும் (8) சீரமைக்கப்பட்டுள்ளது (படம் S7B). கூடுதலாக, ஒரு γ துணை அலகை (7) நீக்குவதன் மூலம் உருவாக்கப்பட்ட Blc. மரகதப் பச்சை LH1-இல் உள்ள குயினோன் சேனல் இதேபோன்ற நிலையில் அமைந்துள்ளது (படம் S7C). வெவ்வேறு புரதங்களால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்டாலும், RC-LH1 சிக்கலில் ஒரு பொதுவான நிலையில் இந்தக் குயினோன்/குயினோலோல் சேனல்கள் தோன்றுவது ஒருங்கு பரிணாம வளர்ச்சிக்கு ஒரு எடுத்துக்காட்டாகத் தெரிகிறது, இது புரதம் W-ஆல் உருவாக்கப்பட்ட இடைவெளி ஒரு குயினோன் சேனலாகச் செயல்படக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
புரதங்களில் உள்ளது போல, இரண்டு டொமைன்களையும் ஒரு புரதத் துளை வழியாக இணைப்பதற்குப் பதிலாக, LH114-W வளையத்தில் உள்ள இடைவெளி, RC-LH114-W கலவையின் உள்வெளிக்கும் மொத்த சவ்வுக்கும் இடையில் ஒரு தொடர்ச்சியான சவ்வுப் பகுதியை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது (படம் 1G). RC-LH116 கலவையானது ஒரு மூடிய Tch. ஊசி போன்ற கலவையைப் (22) போன்றது (படம் 1H). குறுகிய புரதக் கால்வாய் வழியாகப் பரவுவதை விட, சவ்வு வழியாக குயினோனின் பரவல் வேகமாக இருப்பதால், திறந்த LH114-W வளையம், மூடிய LH116 வளையத்தை விட வேகமான RC மாற்றத்தை அனுமதிக்க முடியும், மேலும் RC-க்குள் குயினோனின் பரவல் மிகவும் கட்டுப்படுத்தப்படலாம். RC வழியாக குயினோன்களின் மாற்றத்தை புரதம் W பாதிக்கிறதா என்பதைச் சோதிக்க, நாங்கள் ஒரு குறிப்பிட்ட செறிவில் உள்ள யூபிகுயினோன் 2 (UQ2) (குறுகிய ஐசோபிரீன் வால் கொண்ட இயற்கை UQ10 இன் அனலாக்) மீது ஒரு சைட்டோக்ரோம் ஆக்சிஜனேற்ற சோதனையைச் செய்தோம் (படம் 2E). கீலேட்டட் குயினோனின் இருப்பு, தோற்ற மைக்கேலிஸ் மாறிலியைத் துல்லியமாகக் கண்டறிவதைத் தடுத்தாலும் (RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 ஆகியவை முறையே 0.2±0.1μM மற்றும் 0.5±0.2μM-க்கு ஏற்றவை), RC-LH114-W-இன் பெரும வீதம் (4.6±0.2 e-RC-1 s-1), RC-LH116-ஐ (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) விட 28±5% அதிகமாக உள்ளது.
ஆரம்பத்தில், புரோட்டீன்-W மையக் கலவையின் சுமார் 10% இல் இருப்பதாக நாங்கள் மதிப்பிட்டோம் (16); இங்கே, குறைந்த-ஒளி, நடுத்தர-ஒளி மற்றும் அதிக-ஒளி வளர்ச்சி செல்களின் ஆக்கிரமிப்பு விகிதங்கள் முறையே 15±0.6%, 11±1% மற்றும் 0.9±0.5% ஆகும் (படம் 2F). நிறை நிறமாலையியல் ஒப்பீட்டில், ஹிஸ்டிடின் குறிச்சொல்லைச் சேர்ப்பது காட்டு வகை விகாரங்களுடன் ஒப்பிடும்போது புரோட்டீன்-W இன் சார்பு மிகுதியைக் குறைக்கவில்லை (P = 0.59) என்று காட்டியது, எனவே இந்த அளவுகள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட புரோட்டீன்-W இன் செயற்கையான விளைவு அல்ல (படம் S10). இருப்பினும், RC-LH1 கலவையில் புரோட்டீன்-W இன் இந்த குறைந்த ஆக்கிரமிப்பு சில RC-க்களை விரைவான விகிதத்தில் புரள அனுமதிக்கலாம், இதன் மூலம் RC-LH116 கலவையில் மெதுவான குயினோன்/குயினோலோன் பரிமாற்றத்தைக் குறைக்கலாம். அதிக ஒளி ஆக்கிரமிப்பு விகிதம் சமீபத்திய டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் தரவுகளுடன் முரண்படுவதை நாங்கள் கவனித்தோம், இது வலுவான ஒளியின் கீழ் pufW மரபணு வெளிப்பாடு அதிகரிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் S11) (23). pufW டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கும் RC-LH1 காம்ப்ளக்ஸில் புரதம்-W இணைப்பிற்கும் இடையிலான வேறுபாடு குழப்பமானது மற்றும் புரதத்தின் சிக்கலான ஒழுங்குமுறையை பிரதிபலிக்கக்கூடும்.
RC-LH114-W-இல், 6 கார்டியோலிபின் (CDL), 7 பாஸ்பாடிடைல்கோலின் (POPC), 1 பாஸ்பாடிடைல்கிளிசரால் (POPG) மற்றும் 29 β-DDM மூலக்கூறுகள் ஒதுக்கப்பட்டு மாதிரியாக்கப்பட்டுள்ளன. RC-LH116 (படம் 5, A மற்றும் B). இந்த இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும், CDL பெரும்பாலும் சிக்கலான அமைப்பின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்திலும், POPC, POPG மற்றும் β-DDM ஆகியவை பெரும்பாலும் லுமினல் பக்கத்திலும் அமைந்துள்ளன. RC-LH114-W சிக்கலான அமைப்பின் αβ-1 முதல் αβ-6 வரையிலான பகுதியில் இரண்டு லிப்பிட் மற்றும் டிடர்ஜென்ட் மூலக்கூறுகள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன (படம் 5A), மற்றும் RC-LH116-இன் அதற்கு இணையான பகுதியில் ஐந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன (படம் 5B). சிக்கலான அமைப்பின் மறுபுறத்தில், முக்கியமாக CDL போன்ற அதிக லிப்பிடுகள், RC மற்றும் αβ-7 முதல் αβ-13 வரை குவிந்திருப்பது கண்டறியப்பட்டது (படம் 5, A மற்றும் B). கட்டமைப்பு ரீதியாகத் தீர்க்கப்பட்ட மற்ற லிப்பிடுகள் மற்றும் டிடர்ஜென்ட்கள் LH1 வளையத்திற்கு வெளியே அமைந்துள்ளன, மேலும் நன்கு தீர்க்கப்பட்ட அசைல் சங்கிலிகள் LH1 துணை அலகுகளுக்கு இடையில் நீண்டுள்ளன; இவை RC-LH114-W-இல் தற்காலிகமாக β-DDM என்றும், RC-இல் β-DDM மற்றும் POPC-LH116 ஆகியவற்றின் கலவை என்றும் வரையறுக்கப்பட்டுள்ளன. நமது கட்டமைப்பில் கீலேட்டிங் லிப்பிடுகள் மற்றும் டிடர்ஜென்ட்களின் ஒத்த நிலைகள், அவை உடலியல் ரீதியாகப் பொருத்தமான பிணைப்புத் தளங்கள் என்பதைக் குறிக்கின்றன (படம் S12A). Tch-இல் உள்ள சமமான மூலக்கூறுகளின் நிலைகளும் நல்ல நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன. ஜென்டில் மற்றும் ட்ரவ். ஸ்ட்ரெய்ன் 970 RC-LH1s (படம் S12, B முதல் E வரை) (9, 12) மற்றும் லிப்பிட் தலைக் குழுவின் ஹைட்ரஜன்-பிணைப்பு எச்சங்கள் வரிசை சீரமைப்பில் (படம் S13) மிகவும் நல்ல பாதுகாப்பைக் காட்டின, இது RC உடன் பிணைக்கும் பாதுகாக்கப்பட்ட CDL (24) என்பதைக் குறிக்கிறது, இந்த தளங்கள் RC-LH1 வளாகத்தில் பாதுகாக்கப்படலாம்.
(A மற்றும் B) படம் 1-இல் உள்ள வண்ணத் திட்டத்தைப் பயன்படுத்தி, RC-LH114-W (A) மற்றும் RC-LH116 (B) பெப்டைடுகள் சித்திரங்களாகவும், நிறமிகள் கோல்களாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளன. லிப்பிடுகள் சிவப்பு நிறத்திலும், டிடர்ஜென்ட்கள் சாம்பல் நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளன. RC QA மற்றும் QB தளங்களுடன் பிணைக்கப்பட்ட UQ மஞ்சள் நிறத்திலும், தனிமைப்படுத்தப்பட்ட UQ நீல நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளது. (C மற்றும் D) (A) மற்றும் (B)-இல் உள்ள அதே காட்சிகள், லிப்பிடுகள் நீக்கப்பட்டுள்ளன. (E முதல் G வரை) RC-LH116-இலிருந்து Q1(E), Q2(F) மற்றும் Q3(G) ஆகியவற்றின் பெரிதாக்கப்பட்ட காட்சி, ஒன்றையொன்று பாதிக்கும் பக்கச் சங்கிலிகளுடன். ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் கருப்பு நிறத் தடித்த கோடுகளாகக் காட்டப்பட்டுள்ளன.
RC-LH116-ல், மின்னூட்டப் பிரிப்புச் செயல்பாட்டில் எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்தில் பங்கேற்கும் RC QA மற்றும் QB UQ ஆகிய இரண்டும் அவற்றின் பிணைப்புத் தளங்களில் சிதைக்கப்படுகின்றன. இருப்பினும், RC-LH114-W-ல், QB குயினோன் பிரித்தறியப்படவில்லை, மேலும் இது கீழே விரிவாக விவாதிக்கப்படும். QA மற்றும் QB குயினோன்களுக்குக் கூடுதலாக, இரண்டு கீலேட்டட் UQ மூலக்கூறுகள் (RC மற்றும் LH1 வளையங்களுக்கு இடையில் அமைந்துள்ளன) அவற்றின் நன்கு பிரித்தறியப்பட்ட தலைக் குழுக்களின்படி (முறையே Q1 மற்றும் Q2-ல் அமைந்துள்ளன) RC-LH114-W கட்டமைப்பில் ஒதுக்கப்பட்டுள்ளன. (படம் 5C). இரண்டு ஐசோபிரீன் அலகுகள் Q1-க்கு ஒதுக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் அடர்த்தி வரைபடம் Q2-இன் முழுமையான 10 ஐசோபிரீன் வால்களைப் பிரித்தறிகிறது. RC-LH116-இன் கட்டமைப்பில், மூன்று கீலேட்டட் UQ10 மூலக்கூறுகள் (Q1 முதல் Q3 வரை, படம் 5D) பிரித்தறியப்பட்டன, மேலும் அனைத்து மூலக்கூறுகளும் வால் முழுவதும் தெளிவான அடர்த்தியைக் கொண்டுள்ளன (படம் 5, D முதல் G வரை). இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும், Q1 மற்றும் Q2-இன் குயினோன் தலைக் குழுக்களின் நிலைகள் சிறந்த நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன (படம் S12F), மேலும் அவை RC உடன் மட்டுமே தொடர்பு கொள்கின்றன. Q1, RC-LH114-W-இன் W இடைவெளியின் நுழைவாயிலில் அமைந்துள்ளது (படம் 1G மற்றும் 5, C, D மற்றும் E), மற்றும் Q2, QB பிணைப்பு தளத்திற்கு அருகில் அமைந்துள்ளது (படம் 5, C, D மற்றும் F). பாதுகாக்கப்பட்ட L-Trp143 மற்றும் L-Trp269 எச்சங்கள் Q1 மற்றும் Q2-க்கு மிக அருகில் உள்ளன மற்றும் சாத்தியமான π-அடுக்குதல் தொடர்புகளை வழங்குகின்றன (படம் 5, E மற்றும் F, மற்றும் படம் S12). Q1-இன் தொலைவு ஆக்ஸிஜனிலிருந்து 3.0 Å தொலைவில் உள்ள L-Gln88, ஒரு வலுவான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பை வழங்குகிறது (படம் 5E); இந்த எச்சம் மிகவும் தொலைவான உறவைத் தவிர (படம் S13) அனைத்து RC-களிலும் பாதுகாக்கப்பட்டுள்ளது. பெரும்பாலான மற்ற RC-களில் L-Ser91, Thr-க்கு பதிலாகப் பாதுகாப்பாக மாற்றீடு செய்யப்பட்டுள்ளது (படம் S13), இது Q1-இன் மெத்தில் ஆக்ஸிஜனிலிருந்து 3.8 ஆங்ஸ்ட்ராம் தொலைவில் உள்ளது, மேலும் இது பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை வழங்கக்கூடும் (படம் 5E). Q3 ஒரு குறிப்பிட்ட இடைவினையைக் கொண்டிருப்பதாகத் தெரியவில்லை, ஆனால் அது RC-M துணை அலகுக்கும் LH1-α துணை அலகு 5 முதல் 6-க்கும் இடையேயான ஹைட்ரோஃபோபிக் பகுதியில் அமைந்துள்ளது (படம் 5, D மற்றும் G). Q1, Q2 மற்றும் Q3 அல்லது அருகிலுள்ள கீலேட்டட் குயினோன்கள் Tch. Gentle, Trv. Strain 970 மற்றும் Blc ஆகியவற்றிலும் கண்டறியப்பட்டுள்ளன. ஐரிஸ் அமைப்பு (9, 10, 12), RC-LH1 கூட்டுப்பொருளில் ஒரு பாதுகாக்கப்பட்ட துணை குயினோன் பிணைப்புத் தளம் இருப்பதைக் காட்டுகிறது (படம் S12G). RC-LH116-இல் உள்ள ஐந்து சிதைந்த UQ-க்கள், உயர் செயல்திறன் திரவ நிறப்பிரிகை (HPLC) மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு அணைவின் 5.8±0.7 என்ற மதிப்புடன் நன்கு ஒத்துப்போகின்றன; அதேசமயம், RC-LH114-W-இல் உள்ள மூன்று சிதைந்த UQ-க்கள், அளவிடப்பட்ட மதிப்பான 6.2±0.3-ஐ (படம் S14) விடக் குறைவாக இருப்பது, அதன் கட்டமைப்பில் பிரிக்கப்படாத UQ மூலக்கூறுகள் இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
போலி-சமச்சீர் L மற்றும் M பாலிபெப்டைடுகள் ஒவ்வொன்றும் ஐந்து TMH-களைக் கொண்டுள்ளன மற்றும் ஒரு BChl டைமர், இரண்டு BChl மோனோமர்கள், இரண்டு பாக்டீரியோஃபேஜ் (BPh) மோனோமர்கள், ஒரு ஹீம் அல்லாத இரும்பு மற்றும் ஒன்று அல்லது இரண்டு UQ10 மூலக்கூறுகளை இணைக்கும் ஒரு ஹெட்டிரோடைமரை உருவாக்குகின்றன. முனைய கீட்டோன் குழுவில் உள்ள ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் மற்றும் Rps-இல் அதன் அறியப்பட்ட குவிப்பு ஆகியவற்றின் மூலம், கரோட்டினாய்டுகள் M-துணை அலகில் இணைக்கப்படுகின்றன, இது சிஸ்-3,4-டீஹைட்ரோஓரோடோபின் என்று பெயரிடப்பட்டுள்ளது. இனங்கள் (25). RC-H-இன் வெளிப்புற சவ்வு டொமைன் ஒரு ஒற்றை TMH மூலம் சவ்வில் நங்கூரமிடப்பட்டுள்ளது. ஒட்டுமொத்த RC அமைப்பு, தொடர்புடைய இனங்களின் (Rba போன்றவை) மூன்று துணை அலகு RC-ஐப் போன்றது. ஸ்பேராய்டுகள் (PDB ID: 3I4D). BChl மற்றும் BPh-இன் மேக்ரோவளையங்கள், கரோட்டினாய்டு முதுகெலும்பு மற்றும் ஹீம் அல்லாத இரும்பு ஆகியவை இந்த அமைப்புகளின் பிரித்தறியும் வரம்பிற்குள் மேற்பொருந்துகின்றன; அதேபோல் QA தளத்தில் உள்ள UQ10 தலைக் குழுவும், RC-LH116-இல் உள்ள QB குயினோனும் மேற்பொருந்துகின்றன (படம் S15).
வெவ்வேறு QB தள ஆக்கிரமிப்பு விகிதங்களைக் கொண்ட இரண்டு RC கட்டமைப்புகள் கிடைப்பது, QB குயினோன் பிணைப்புடன் வரும் நிலையான இணக்க மாற்றங்களை ஆராய்வதற்கான ஒரு புதிய வாய்ப்பை வழங்குகிறது. RC-LH116 சிக்கலில், QB குயினோன் முழுமையாகப் பிணைக்கப்பட்ட "அண்மை" நிலையில் (26) அமைந்துள்ளது, ஆனால் RC-LH114-W-இன் பிரிப்பில் QB குயினோன் இல்லை. RC-LH114-W-இல் QB குயினோன் இல்லை, இது ஆச்சரியமாக இருக்கிறது, ஏனெனில் கட்டமைப்பு ரீதியாகத் தீர்க்கப்பட்ட QB குயினோனைக் கொண்ட RC-LH116 சிக்கலை விட இந்த சிக்கல் அதிக செயல்பாடுடையது. இரண்டு LH1 வளையங்கள் சுமார் ஆறு குயினோன்களைச் செலேட் செய்தாலும், மூடிய RC-LH116 வளையத்தில் ஐந்து கட்டமைப்பு ரீதியாகத் தீர்க்கப்பட்டுள்ளன, அதே நேரத்தில் திறந்த RC-LH114-W வளையத்தில் மூன்று மட்டுமே கட்டமைப்பு ரீதியாக வரையறுக்கப்பட்டுள்ளன. இந்த அதிகரித்த கட்டமைப்புச் சீர்குலைவு, RC-LH114-W QB தளங்களின் வேகமான பதிலீடு, அந்தச் சேர்மத்தில் குயினோன்களின் வேகமான இயக்கவியல், மற்றும் LH1 வளையத்தைக் கடப்பதற்கான அதிகரித்த சாத்தியக்கூறு ஆகியவற்றைப் பிரதிபலிக்கக்கூடும். RC-LH114-W-இன் RC QB தளத்தில் UQ இல்லாதது, மிகவும் சிக்கலான மற்றும் அதிக செயல்பாடுள்ள ஒரு சேர்மத்தின் விளைவாக இருக்கலாம் என்றும், UQ சுழற்சியின் குறிப்பிட்ட கட்டத்தில் (QB தளத்திற்கான நுழைவாயில் மூடப்பட்டுள்ளது) RC-LH114-W-இன் QB தளம் உடனடியாக உறைந்துவிட்டது என்றும், இது இந்தச் செயல்பாட்டின் வடிவத்தைப் பிரதிபலிக்கிறது என்றும் நாங்கள் கருதுகிறோம்.
QB இல்லாமல், L-Phe217 ஆனது UQ10 பிணைப்புக்கு ஒவ்வாத ஒரு நிலைக்குச் சுழல்கிறது, ஏனெனில் அது வாலின் முதல் ஐசோபிரீன் அலகுடன் ஒரு இடஞ்சார்ந்த மோதலை ஏற்படுத்தும் (படம் 6A). கூடுதலாக, வெளிப்படையான முக்கிய வடிவமைப்பு மாற்றங்கள் தெளிவாகத் தெரிகின்றன, குறிப்பாக ஹெலிக்ஸ் de (TMH D மற்றும் E-க்கு இடையிலான வளையத்தில் உள்ள குறுகிய சுருள்), இதில் L-Phe217 ஆனது QB பிணைப்புப் பைக்கு மாற்றப்படுகிறது மற்றும் L-Tyr223 (படம் 6A) சுழன்று M-Asp45 கட்டமைப்புடனான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பை உடைத்து QB பிணைப்புத் தளத்தின் நுழைவாயிலை மூடுகிறது (படம் 6B). ஹெலிக்ஸ் de அதன் அடிப்பகுதியில் சுழல்கிறது, L-Ser209-இன் Cα 0.33Å அளவுக்கு மாற்றப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் L-Val221Cα 3.52Å அளவுக்கு மாற்றப்படுகிறது. TMH D மற்றும் E-இல் காணக்கூடிய மாற்றங்கள் எதுவும் இல்லை, அவை இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும் ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்தக்கூடியவை (படம் 6A). நமக்குத் தெரிந்தவரை, இயற்கையான RC-யில் QB தளத்தை மூடும் முதல் அமைப்பு இதுவே ஆகும். முழுமையான (QB-உடன் பிணைக்கப்பட்ட) அமைப்புடன் ஒப்பிடுகையில், குயினோன் ஒடுக்கப்படுவதற்கு முன்பு, அது குயினோனுக்குள் நுழைவதற்கு ஒரு உருவமைப்பு மாற்றம் தேவைப்படுகிறது என்பது தெரிகிறது. L-Phe217 சுழன்று குயினோன் தலைக் குழுவுடன் ஒரு π-அடுக்கு இடைவினையை உருவாக்குகிறது, மேலும் சுருள் வெளிப்புறமாக நகர்கிறது. இது L-Gly222-இன் எலும்புக்கூடும் L-Tyr223-இன் பக்கச் சங்கிலியும் ஒரு நிலையான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு அமைப்புடன் ஒரு ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு வலையமைப்பை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது (படம் 6, A மற்றும் C).
(A) ஹோலோகிராம் (L சங்கிலி, ஆரஞ்சு/M சங்கிலி, மெஜந்தா) மற்றும் அப்போ (சாம்பல்) கட்டமைப்பின் ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்தும் கார்ட்டூன், இதில் முக்கிய எச்சங்கள் ஒரு தடி போன்ற வடிவத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன. UQ10 ஒரு மஞ்சள் பட்டையால் குறிக்கப்படுகிறது. புள்ளியிடப்பட்ட கோடு முழு கட்டமைப்பிலும் உருவாகும் ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளைக் குறிக்கிறது. (B மற்றும் C) அப்போலிப்போபுரோட்டீன் மற்றும் முழு வளைய கட்டமைப்பின் மேற்பரப்பு பிரதிநிதித்துவம், முறையே L-Phe217 இன் பக்கச் சங்கிலி ஆக்ஸிஜனை நீல நிறத்திலும் மற்றும் L-Tyr223 ஐ சிவப்பு நிறத்திலும் சிறப்பித்துக் காட்டுகிறது. L துணை அலகு ஆரஞ்சு நிறத்தில் உள்ளது; M மற்றும் H துணை அலகுகளுக்கு வண்ணம் தீட்டப்படவில்லை. (D மற்றும் E) அப்போலிப்போபுரோட்டீன் (D) மற்றும் முழு (E) RC QB தளங்கள் [முறையே (A) ஆல் வண்ணமிடப்பட்டது] மற்றும் தெர்மோபிலஸ் தெர்மோபிலஸ் PSII (பச்சை, பிளாஸ்டிக் குயினோனுடன் நீலம்; PDB ID: 3WU2) சீரமைப்பு (58).
எதிர்பாராத விதமாக, LH1 இல்லாத QB-குறைபாடுள்ள RC-களின் பல கட்டமைப்புகள் கிடைத்தாலும், இந்த ஆய்வில் காணப்பட்ட உருவமைப்பு மாற்றங்கள் இதற்கு முன்னர் அறிவிக்கப்படவில்லை. இவற்றில் Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) மற்றும் Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்ட QB குறைப்பு கட்டமைப்புகள் அடங்கும், இவை அனைத்தும் அவற்றின் ஒட்டுமொத்த QB கட்டமைப்பைப் போலவே உள்ளன. 3PRC-ஐ உன்னிப்பாக ஆய்வு செய்ததில், LDAO (லாரில் டைமெதில் அமீன் ஆக்சைடு) டிடர்ஜென்ட் மூலக்கூறுகள் QB நிலையின் நுழைவாயிலில் பிணைந்து, மூடிய உருவமைப்பிற்கு மறுசீரமைப்பதைத் தடுக்கக்கூடும் என்பது தெரியவந்தது. 1EYS அல்லது 1OGV-இல் LDAO அதே நிலையில் சிதைவடையவில்லை என்றாலும், இந்த RC-கள் ஒரே டிடர்ஜென்டைப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்படுவதால், அவை ஒரே மாதிரியான விளைவை ஏற்படுத்தக்கூடும். Rba. sphaeroides-இன் படிக அமைப்பு... சைட்டோக்ரோம் c2 உடன் இணைந்து படிகமாக்கப்பட்ட ஸ்பேராய்டஸ் RC (PDB ID: 1L9B) ஒரு மூடிய QB தளத்தைக் கொண்டிருப்பதாகவும் தெரிகிறது. இருப்பினும், இந்த நேர்வில், RC-M பாலிபெப்டைடின் N-முனைப் பகுதி (Q ஹெலிக்ஸில் உள்ள Tyr எச்சத்தின் H பிணைப்பு வழியாக QB பிணைப்பு தளத்துடன் தொடர்பு கொள்கிறது) ஒரு இயற்கைக்கு மாறான வடிவத்தை ஏற்றுக்கொள்கிறது, மேலும் QB வடிவ மாற்றம் மேலும் ஆராயப்படவில்லை (30). ஆறுதல் அளிப்பது என்னவென்றால், RC-LH114-W அமைப்பில் M பாலிபெப்டைடின் இந்த வகையான சிதைவை நாங்கள் காணவில்லை, இது RC-LH116 RC-யின் N-முனைப் பகுதியைப் போலவே உள்ளது. டிடர்ஜென்ட் அடிப்படையிலான LH1 ஆன்டெனா அகற்றப்பட்ட பிறகு, PDB-யில் உள்ள அப்போலிப்போபுரோட்டீன் RC-கள் பிரிக்கப்பட்டன, இது RC-க்கும் சுற்றியுள்ள LH1 வளையத்தின் உள் மேற்பரப்பிற்கும் இடையிலான இடைவெளியில் உள்ள உள் குயினோன் குளங்கள் மற்றும் லிப்பிடுகளை நீக்கியது என்பதும் குறிப்பிடத்தக்கது (31, 32). RC ஆனது, சிதைக்கக்கூடிய QB குயினோனைத் தவிர மற்ற அனைத்து இணைக்காரணிகளையும் தக்கவைத்துக்கொள்வதால், அது தொடர்ந்து செயல்படுகிறது. QB குயினோன் குறைவான நிலைத்தன்மை கொண்டது மற்றும் தயாரிப்பு செயல்முறையின் போது அடிக்கடி இழக்கப்படுகிறது (33). கூடுதலாக, RC-யிலிருந்து LH1 மற்றும் இயற்கையான வளைய லிப்பிடுகளை அகற்றுவது, மின்னூட்டம் பிரிக்கப்பட்ட P+QB-நிலையின் ஆயுட்காலம் குறைவது போன்ற செயல்பாடுகளில் தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் என்பது அறியப்படுகிறது (31, 34, 35). எனவே, RC-யைச் சுற்றியுள்ள உள்ளூர் LH1 வளையத்தின் இருப்பு, "மூடிய" QB தளத்தைப் பராமரித்து, அதன் மூலம் QB-க்கு அருகிலுள்ள உள்ளூர் சூழலைப் பாதுகாக்கக்கூடும் என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம்.
அப்போலிப்போபுரோட்டீன் (QB குயினோன் இல்லாமல்) மற்றும் முழுமையான அமைப்பு ஆகியவை QB தளத்தின் செயல்பாட்டின் தொடர் நிகழ்வுகளைக் காட்டிலும், அதன் இரண்டு கணநேரப் படங்களை மட்டுமே குறிக்கின்றன என்றாலும், ஹைட்ரோகுயினோனால் மீண்டும் பிணைவதைத் தடுக்கவும், அடி மூலக்கூறு தடுப்பைத் தடுக்கவும் பிணைப்பைக் கட்டுப்படுத்த முடியும் என்பதற்கான அறிகுறிகள் உள்ளன. அப்போலிப்போபுரோட்டீனின் QB தளத்திற்கு அருகில் குயினோலோல் மற்றும் குயினோனின் இடைவினை வித்தியாசமாக இருக்கலாம், இது RC-ஆல் அது நிராகரிக்கப்படுவதற்கு வழிவகுக்கிறது. குயினோன்களின் பிணைப்பு மற்றும் ஒடுக்கத்தில் உருவமைப்பு மாற்றங்கள் ஒரு பங்கு வகிக்கின்றன என்று நீண்ட காலமாக முன்மொழியப்பட்டுள்ளது. இருள் தழுவலுக்குப் பிறகு உறைந்த RC-களின் குயினோன்களை ஒடுக்கும் திறன் பாதிக்கப்படுகிறது (36); X-கதிர் படிகவியல், இந்த சேதமானது, QB குயினோன்கள் செயல்படும் அருகாமை நிலையில் இருந்து சுமார் 4.5 Å தொலைவில் ஒரு "தொலைநிலை" உருவமைப்பில் சிக்குவதால் ஏற்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது (26), 37). இந்த தொலைநிலை பிணைப்பு உருவமைப்பு, குயினோனுடனான ஆரம்ப இடைவினை மற்றும் QB தளம் திறக்கப்பட்டதைத் தொடர்ந்து வரும் அப்போலிப்போபுரோட்டீனுக்கும் முழு வளைய அமைப்புக்கும் இடையிலான இடைநிலை நிலையின் ஒரு கணநேரப் படம் என்று நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம்.
சில ஒளிச்சேர்க்கை பாக்டீரியாக்கள் மற்றும் சயனோபாக்டீரியாக்கள், பாசிகள் மற்றும் தாவரங்களின் PSII வளாகத்தில் காணப்படும் வகை II RC, கட்டமைப்பு மற்றும் செயல்பாட்டுப் பாதுகாப்பைக் கொண்டுள்ளது (38). படம் 6 (D மற்றும் E)-இல் காட்டப்பட்டுள்ள கட்டமைப்பு சீரமைப்பு, PSII RC-களுக்கும் பாக்டீரியல் RC வளாகத்தின் QB தளத்திற்கும் இடையிலான ஒற்றுமையை வலியுறுத்துகிறது. இந்த ஒப்பீடு, குயினோன் பிணைப்பு மற்றும் ஒடுக்கத்தின் நெருங்கிய தொடர்புடைய அமைப்புகளைப் படிப்பதற்கான ஒரு மாதிரியாக நீண்ட காலமாக இருந்து வருகிறது. முந்தைய வெளியீடுகள், உருவமைப்பு மாற்றங்கள் குயினோன்களின் PSII ஒடுக்கத்துடன் சேர்ந்து நிகழ்கின்றன என்று பரிந்துரைத்தன (39, 40). எனவே, RC-யின் பரிணாமப் பாதுகாப்பைக் கருத்தில் கொண்டு, முன்னர் கவனிக்கப்படாத இந்த பிணைப்பு வழிமுறையானது, ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஒளிச்சேர்க்கை தாவரங்களில் உள்ள PSII RC-யின் QB தளத்திற்கும் பொருந்தக்கூடும்.
Rps ΔpufW (குறியிடப்படாத pufW நீக்கம்) மற்றும் PufW-His (இயற்கையான pufW லோகஸிலிருந்து வெளிப்படுத்தப்பட்ட C-முனைய 10x His-டேக் செய்யப்பட்ட புரதம்-W) திரிபுகள். palustris CGA009 எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் (16) விவரிக்கப்பட்டுள்ளது. இந்த திரிபுகள் மற்றும் ஐசோஜெனிக் வைல்ட்-டைப் பெற்றோர் ஆகியவை உறைவிப்பானிலிருந்து மீட்கப்பட்டன. இதற்காக, PYE (ஒவ்வொன்றும் 5 கிராம் லிட்டர் -1) (LB-இல் -80 °C-இல் சேமிக்கப்பட்டது, இதில் 50% (w/v) கிளிசரால், புரதம், ஈஸ்ட் சாறு மற்றும் சக்சினேட் ஆகியவை இருந்தன) அகார் [1.5% (w/v)] தட்டில் ஒரு சிறிய எண்ணிக்கையிலான செல்கள் கோடுகள் இடப்பட்டன. அந்தத் தட்டு, அறை வெப்பநிலையில் காற்றில்லா நிலையில், இருட்டில் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர், ஒரு ஒற்றைக் காலனி தோன்றும் வரை 3 முதல் 5 நாட்களுக்கு OSRAM 116-W ஹாலஜன் பல்புகளால் (RS Components, UK) வழங்கப்படும் வெள்ளை ஒளியால் (~50 μmolm-2 s-1) ஒளியூட்டப்பட்டது. 0.1% (w/v) காசாமினோ அமிலங்கள் (இனி M22 எனக் குறிப்பிடப்படும்) சேர்க்கப்பட்ட 10 மில்லி M22+ ஊடகத்தில் (41) ஒரு தனிப்பட்ட காலனி பயன்படுத்தப்பட்டது. அந்தக் கலவை 34°C வெப்பநிலையில், குறைந்த ஆக்ஸிஜன் நிலையில், இருட்டில், 180 rpm வேகத்தில் 48 மணி நேரம் அசைக்கப்பட்டு வளர்க்கப்பட்டது, பின்னர் அந்தக் கலவையிலிருந்து 70 மில்லி அதே நிலையில் 24 மணி நேரம் இடப்பட்டது. 1 மில்லி கன அளவுள்ள ஒரு பகுதி-காற்றோட்டக் கலவையானது, 30 மில்லி கொள்ளளவு கொண்ட ஒரு பொதுவான திருகு மூடி கொண்ட ஒளிபுகும் கண்ணாடி பாட்டிலில் உள்ள 30 மில்லி M22 ஊடகத்தில் இடப்பட்டு, ஒரு மலட்டு காந்த விசை கலக்கும் தடியால் 48 மணி நேரம் அசைவுடன் (~50μmolm-2 s-1) கதிர்வீச்சுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது. பின்னர், அதே நிபந்தனைகளின் கீழ், 30 மிலி வளர்ப்புக்கலவையுடன் சுமார் 1 லிட்டர் வளர்ப்புக்கலவை இடப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து, 72 மணி நேரத்திற்கு ~200 μmolm-2 s-1 என்ற அளவில் ஒளியூட்டப்பட்ட சுமார் 9 லிட்டர் வளர்ப்புக்கலவையில் இது இடப்பட்டது. செல்கள் 30 நிமிடங்களுக்கு 7132 RCF வேகத்தில் மையவிலக்கு முறையில் அறுவடை செய்யப்பட்டு, ~10 மிலி 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) கரைசலில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, தேவைப்படும் வரை -20°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டன.
உறைந்த நிலை நீங்கிய பிறகு, மீண்டும் கரைக்கப்பட்ட செல்களுடன் டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியேஸ் I (மெர்க், யுகே) படிகங்கள், லைசோசைம் (மெர்க், யுகே) மற்றும் இரண்டு ரோச் ஹோலோஎன்சைம் புரோட்டியேஸ் தடுப்பான் மாத்திரைகள் (மெர்க், யுகே) ஆகியவற்றைச் சேர்க்கவும். 20,000 psi பிரெஞ்சு அழுத்தக் கலத்தில் (அமின்கோ, அமெரிக்கா), செல்கள் 8 முதல் 12 முறை சிதைக்கப்பட்டன. 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 18,500 RCF வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் உடையாத செல்கள் மற்றும் கரையாத சிதைவுகளை நீக்கிய பிறகு, 43,000°C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரத்திற்கு 113,000 RCF வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் நிறமி கலந்த கரைப்பானிலிருந்து சவ்வு வீழ்படிவாக்கப்பட்டது. கரையக்கூடிய பகுதியை அகற்றிவிட்டு, நிறமுள்ள சவ்வை 100 முதல் 200 மில்லி 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) கரைசலில் மீண்டும் கரைத்து, கண்ணுக்குத் தெரியும் திரட்சிகள் இல்லாத வரை ஒருபடித்தாக்கவும். தொங்கவிடப்பட்ட சவ்வானது, 2% (w/v) β-DDM ஐக் கொண்ட 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) (அனாட்ரேஸ், அமெரிக்கா) கரைசலில், 4°C வெப்பநிலையில் இருட்டில், மெதுவாகக் கலக்கியவாறு 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர், எஞ்சிய கரையாதவற்றை அகற்றுவதற்காக, 150,000 RCF ஐ 4°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் கரைக்க, 70°C வெப்பநிலையில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.
ΔpufW திரிபிலிருந்து பெறப்பட்ட கரைக்கும் சவ்வு, மூன்று நெடுவரிசை கனஅளவுகள் (CV) கொண்ட பிணைப்பு இடையகத்துடன் [20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) 0.03% (w/v) β-DDM உடன்] ஒரு 50 மிலி DEAE செஃபரோஸ் அயனிப் பரிமாற்ற நெடுவரிசையில் பயன்படுத்தப்பட்டது. நெடுவரிசையை இரண்டு CV பிணைப்பு இடையகங்களைக் கொண்டு கழுவவும், பின்னர் 50 mM NaCl கொண்ட இரண்டு பிணைப்பு இடையகங்களைக் கொண்டு நெடுவரிசையைக் கழுவவும். RC-LH116 கூட்டுப்பொருள் 1.75 CV-இல் 150 முதல் 300 mM NaCl (பிணைப்பு இடையகத்தில்) வரையிலான ஒரு நேரியல் சாய்வு மூலம் வெளியேற்றப்பட்டது, மற்றும் மீதமுள்ள பிணைப்பு கூட்டுப்பொருள் 0.5 CV-இல் 300 mM NaCl கொண்ட ஒரு பிணைப்பு இடையகத்தைக் கொண்டு வெளியேற்றப்பட்டது. 250 மற்றும் 1000 nm-க்கு இடையில் உள்ள உட்கிரகிப்பு நிறமாலையைச் சேகரித்து, 880 முதல் 280 nm-இல் 1-ஐ விட அதிகமான உட்கிரகிப்பு விகிதத்தைக் (A880/A280) கொண்ட பகுதியைத் தக்கவைத்து, அதை பிணைப்பு இடையகத்தில் (binding buffer) இருமுறை நீர்த்து, சுத்திகரிப்பின் போது DEAE நிரலில் (column) மீண்டும் அதே செயல்முறையைப் பயன்படுத்தவும். 1.7-ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதங்கள் மற்றும் 3.0-ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதங்களைக் கொண்ட பகுதிகளை நீர்த்து, மூன்றாவது சுற்று அயனிப் பரிமாற்றத்தைச் செய்து, 2.2-ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதங்கள் மற்றும் 5.0-ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதங்களைக் கொண்ட பகுதிகளைத் தக்கவைத்துக் கொள்ளவும். பகுதியளவு சுத்திகரிக்கப்பட்ட கலவையானது, அமிகான் 100,000 மூலக்கூறு எடை வரம்பு (MWCO) மையவிலக்கு வடிகட்டியில் (மெர்க், யுகே) சுமார் 2 மில்லி லிட்டருக்கு அடர்த்தியாக்கப்பட்டு, 200 mM NaCl இடையகத்தைக் கொண்ட சூப்பர்டெக்ஸ் 200 16/600 அளவு விலக்கு நிரலில் (ஜிஇ ஹெல்த்கேர், யுஎஸ்) ஏற்றப்பட்டு, பின்னர் அதே இடையகத்தில் 1.5 CV-இல் வெளியேற்றப்பட்டது. அளவு விலக்கு பகுதியின் உட்கவர் நிறமாலைகளைச் சேகரித்து, A880/A280 விகிதங்கள் 2.4-க்கு மேலும், A880/A805 விகிதங்கள் 5.8-க்கு மேலும் உள்ள உட்கவர் நிறமாலைகளை 100 A880 வரை அடர்த்தியாக்கி, அவற்றை உடனடியாக கிரையோ-TEM கட்டம் தயாரிப்பு அல்லது சேமிப்பிற்காகப் பயன்படுத்தவும். தேவைப்படும் வரை -80°C-இல் வைக்கவும்.
PufW-His திரிபிலிருந்து பெறப்பட்ட கரைக்கும் சவ்வு, IMAC தாங்கல் கரைசலில் (GE ஹெல்த்கேர்) உள்ள 20 மிலி HisPrep FF Ni-NTA செஃபரோஸ் நிரலில் (20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) உடன் 200 mM NaCl மற்றும் 0.03% (w/w) கொண்டது) பயன்படுத்தப்பட்டது. v) β-DDM]. அந்த நிரல், IMAC தாங்கல் கரைசலின் ஐந்து CV-களாலும், பின்னர் 10 mM ஹிஸ்டிடின் கொண்ட IMAC தாங்கல் கரைசலின் ஐந்து CV-களாலும் கழுவப்பட்டது. மையக் கூட்டுப்பொருள், 100 mM ஹிஸ்டிடின் கொண்ட ஐந்து IMAC தாங்கல் கரைசல்களைக் கொண்டு நிரலிலிருந்து வெளியேற்றப்பட்டது. RC-LH114-W கூட்டுப்பொருளைக் கொண்ட பகுதி, Amicon 100,000 MWCO வடிகட்டி (மெர்க், UK) பொருத்தப்பட்ட ஒரு கலக்கித் தொட்டியில் ~10 மிலி-க்கு அடர்த்தியாக்கப்பட்டு, பிணைப்புத் தாங்கல் கரைசலுடன் 20 மடங்கு நீர்த்துப் பின்னர் 25 மிலி DEAE செஃபரோஸ் நிரலில் சேர்க்கப்பட்டது. தாங்கல் கரைசலுடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்கு CV-கள் முன்கூட்டியே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. நான்கு CV பிணைப்பு இடையகங்களைக் கொண்டு நிரலைக் கழுவவும், பின்னர் 0 முதல் 100 mM NaCl (பிணைப்பு இடையகத்தில்) வரையிலான நேரியல் சாய்வில் எட்டு CV-களில் சிக்கலான சேர்மத்தை வெளியேற்றவும், மீதமுள்ள நான்கு CV-களில் 100 mM பிணைப்பு இடையகத்தைக் கொண்டு வெளியேற்றவும். சோடியம் குளோரைடில் வெளியேற்றப்பட்ட எஞ்சிய சிக்கலான சேர்மங்கள், 2.4-ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதம் மற்றும் 4.6-ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதத்துடன் கூடிய பின்னங்கள், அமிகான் 100,000 MWCO மையவிலக்கு வடிகட்டியில் ~2 மில்லி லிட்டருக்கு அடர்த்தியாக்கப்பட்டு, முன்னரே இடையகத்தால் சமநிலைப்படுத்தப்பட்ட சூப்பர்டெக்ஸ் 200 16/600 அளவு விலக்கு நிரலில் 1.5 CV IMAC கொண்டு நிரப்பப்பட்டு, பின்னர் அதே இடையகத்தில் 1.5 CV-இல் வெளியேற்றப்பட்டன. அளவு-விலக்கு பின்னங்களின் உட்கிரகிப்பு நிறமாலைகளைச் சேகரித்து, A880/A280 விகிதம் 2.1-க்கு அதிகமாகவும், A880/A805 விகிதம் 4.6-க்கு அதிகமாகவும் உள்ள உட்கிரகிப்பு நிறமாலைகளை 100 A880 வரை செறிவூட்டவும். இவை உறைந்த TEM கட்டம் தயாரிப்பிற்கு உடனடியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன அல்லது தேவைப்படும் வரை -80°C-ல் சேமித்து வைக்கப்படுகின்றன.
குறைந்த வெப்பநிலை TEM கட்டங்களைத் தயாரிக்க, ஒரு லைக்கா EM GP இம்மர்ஷன் ஃப்ரீசர் பயன்படுத்தப்பட்டது. அந்தக் கலவை, IMAC பஃபரில் A880 மதிப்பு 50 ஆக நீர்க்கப்பட்டு, பின்னர் 5μl அளவு, புதிதாக மின்னிறக்கம் செய்யப்பட்ட குவாண்டிஃபாயில் 1.2/1.3 கார்பன் பூசப்பட்ட செப்பு வலை மீது (அகார் சயின்டிஃபிக், யுகே) ஏற்றப்பட்டது. அந்தக் கட்டத்தை 20°C வெப்பநிலையிலும் 60% ஒப்பு ஈரப்பதத்திலும் 30 விநாடிகள் அடைகாத்து, பின்னர் 3 விநாடிகள் ஒற்றி உலர்த்தி, அதன்பின் -176°C வெப்பநிலையில் திரவ ஈத்தேனில் குளிர்விக்கப்பட்டது.
RC-LH114-W தொகுப்பின் தரவுகள், eBIC (மின்னணு உயிரிப் படிமவியல் மையம்) (பிரிட்டிஷ் டயமண்ட் லைட் சோர்ஸ்) இல், டைட்டன் கிரியோஸ் நுண்ணோக்கி மூலம் பதிவு செய்யப்பட்டன. இந்த நுண்ணோக்கி 300kV முடுக்கும் மின்னழுத்தத்திலும், 130,000× பெயரளவு உருப்பெருக்கத்திலும், 20 eV ஆற்றல் இடைவெளியிலும் செயல்படுகிறது. தரவுகளைச் சேகரிப்பதற்காக, எண்ணும் முறையில் படங்களைப் பதிவு செய்ய, K2 உச்ச உணரியுடன் கூடிய Gatan 968 GIF குவாண்டம் பயன்படுத்தப்பட்டது. அளவீடு செய்யப்பட்ட பிக்சல் அளவு 1.048Å மற்றும் டோஸ் வீதம் 3.83 e-Å-2s-1 ஆகும். காணொளி 11 வினாடிகளில் சேகரிக்கப்பட்டு, 40 பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது. நுண்ணோக்கியை மீண்டும் குவியப்படுத்த கார்பன் பூசப்பட்ட பகுதி பயன்படுத்தப்பட்டது, பின்னர் ஒவ்வொரு துளைக்கும் மூன்று காணொளிகள் சேகரிக்கப்பட்டன. மொத்தமாக, -1 மற்றும் -3μm க்கு இடையில் குவியவிலகல் மதிப்புகளுடன் 3130 காணொளிகள் சேகரிக்கப்பட்டன.
RC-LH116 தொகுப்பிற்கான தரவுகள், ஆஸ்டர்பரி உயிர் கட்டமைப்பு ஆய்வகத்தில் (லீட்ஸ் பல்கலைக்கழகம், இங்கிலாந்து) உள்ள அதே நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி சேகரிக்கப்பட்டன. இந்தத் தரவுகள் 130k உருப்பெருக்கத்துடன் எண்ணும் முறையில் சேகரிக்கப்பட்டன, மேலும் பிக்சல் அளவு 4.6 e-Å-2s-1 டோஸுடன் 1.065 Å ஆக அளவீடு செய்யப்பட்டது. இந்தக் காணொளி 12 வினாடிகளில் பதிவு செய்யப்பட்டு 48 பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது. மொத்தமாக, -1 மற்றும் -3μm-க்கு இடைப்பட்ட குவியவிலகல் மதிப்புகளுடன் 3359 படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன.
அனைத்து தரவு செயலாக்கமும் ரிலியன் 3.0 பைப்லைனில் (42) செய்யப்படுகிறது. டோஸ் வெயிட்டிங் மூலம் கற்றை இயக்கத்தை சரிசெய்ய மோஷன்கோர் 2 (43) ஐப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் CTF (கான்ட்ராஸ்ட் டிரான்ஸ்ஃபர் ஃபங்ஷன்) அளவுருவைத் தீர்மானிக்க CTFFIND 4.1 (44) ஐப் பயன்படுத்தவும். இந்த ஆரம்ப செயலாக்க நிலைகளுக்குப் பிறகு வழக்கமான ஃபோட்டோமைக்ரோகிராஃப்கள் படம் 2. S16 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. தானியங்கி தேர்வு டெம்ப்ளேட், 250-பிக்சல் சட்டகத்தில் உள்ள 1000 துகள்களில் சுமார் 250 பிக்சல்களை கைமுறையாகத் தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலம் உருவாக்கப்படுகிறது, மேலும் குறிப்பு இரு பரிமாண (2D) வகைப்பாடு எதுவும் இல்லை, இதன் மூலம் மாதிரி மாசுபடுதல் அல்லது கண்டறியக்கூடிய பண்புகள் இல்லாத வகைப்பாடுகள் நிராகரிக்கப்படுகின்றன. பின்னர், அனைத்து மைக்ரோஃபோட்டோகிராஃப்களிலும் தானியங்கி தேர்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் RC-LH114-W 849,359 துகள்களாகவும், RC-LH116 காம்ப்ளக்ஸ் 476,547 துகள்களாகவும் இருந்தது. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்துத் துகள்களும் இரண்டு சுற்று குறிப்பற்ற 2D வகைப்படுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. ஒவ்வொரு ஓட்டத்திற்குப் பிறகும், கார்பன் பகுதி, மாதிரி மாசு, தெளிவான அம்சங்கள் இல்லாத அல்லது வலுவாக ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் துகள்கள் போன்ற நிபந்தனைகளைப் பூர்த்தி செய்யும் துகள்கள் நிராகரிக்கப்பட்டன. இதன் விளைவாக, RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 ஆகியவற்றின் 3D வகைப்படுத்தலுக்கு முறையே 772,033 (90.9%) மற்றும் 359,678 (75.5%) துகள்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன. ஆரம்ப 3D குறிப்பு மாதிரி, ஸ்டோகாஸ்டிக் கிரேடியன்ட் டிசென்ட் முறையைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டது. ஆரம்ப மாதிரியை ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தி, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட துகள்கள் 3D-யில் நான்கு வகைகளாக வகைப்படுத்தப்பட்டன. இந்த வகையிலுள்ள மாதிரியை ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தி, மிகப்பெரிய வகையிலுள்ள துகள்களில் 3D சுத்திகரிப்பு செய்யப்பட்டது. பின்னர், கரைப்பான் பகுதியை மறைக்க ஆரம்ப 15Å லோ-பாஸ் வடிகட்டி பயன்படுத்தப்பட்டது, 6 பிக்சல்கள் மென்மையான விளிம்புகள் சேர்க்கப்பட்டன, மேலும் மேல் கண்டறியும் கருவியின் Gatan K2 உச்சநிலை பண்பேற்றப் பரிமாற்றச் செயல்பாட்டைச் சரிசெய்ய பிக்சல்கள் பிந்தைய செயலாக்கம் செய்யப்பட்டன. RC-LH114-W தரவுத்தொகுப்பைப் பொறுத்தவரை, முகமூடியின் விளிம்புகளில் உள்ள வலுவான அடர்த்தியை (UCSF கைமேராவில் உள்ள மைய சிக்கலான அடர்த்தியிலிருந்து துண்டிக்கப்பட்டது) அகற்றுவதன் மூலம் இந்த ஆரம்ப மாதிரி மாற்றியமைக்கப்பட்டது. இதன் விளைவாகக் கிடைத்த மாதிரிகள் (RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 ஆகியவற்றின் பிரிதிறன்கள் முறையே 3.91 மற்றும் 4.16 Å ஆகும்) 3D வகைப்பாட்டின் இரண்டாம் சுற்றுக்கு ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பயன்படுத்தப்பட்ட துகள்கள் ஆரம்ப 3D வகுப்பில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் அவை அண்டைப்பகுதியுடன் வலுவான தொடர்பைக் கொண்டிருக்கவில்லை. ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்துதல் அல்லது தெளிவான கட்டமைப்பு அம்சங்கள் இல்லாதிருத்தல். 3D வகைப்பாட்டின் இரண்டாம் சுற்றுக்குப் பிறகு, மிக உயர்ந்த பிரிதிறன் கொண்ட வகை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது [RC-LH114-W-க்கு, ஒரு வகை 377,703 துகள்கள் (44.5%), RC-LH116-க்கு, இரண்டு வகைகள் உள்ளன, மொத்தம் 260,752 துகள்கள் (54.7%), ஆரம்ப சுழற்சிக்குப் பிறகு ஒரு சிறிய வித்தியாசத்துடன் சீரமைக்கப்படும்போது மட்டுமே அவை ஒரே மாதிரியாக இருக்கும்]. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட துகள்கள் 400-பிக்சல் பெட்டியில் மீண்டும் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, 3D சுத்திகரிப்பு மூலம் செம்மைப்படுத்தப்படுகின்றன. ஆரம்ப 15Å லோ-பாஸ் ஃபில்டர், 3 பிக்சல் மேப் விரிவாக்கம் மற்றும் 3 பிக்சல் சாஃப்ட் மாஸ்க் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி சால்வென்ட் மாஸ்க் உருவாக்கப்படுகிறது. ஒவ்வொரு படிக்குப் பிறகும், துகள் வாரியான CTF சுத்திகரிப்பு, துகள் வாரியான இயக்கத் திருத்தம் மற்றும் துகள் வாரியான CTF சுத்திகரிப்பின் இரண்டாம் சுற்று ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, விளைவாக வரும் டெக்ஸ்சரை மேலும் செம்மைப்படுத்த 3D சுத்திகரிப்பு, சால்வென்ட் மாஸ்கிங் மற்றும் பிந்தைய செயலாக்கம் ஆகியவை செய்யப்படுகின்றன. 0.143 என்ற FSC (ஃபூரியர் ஷெல் தொடர்பு குணகம்) கட்-ஆஃப் மதிப்பைப் பயன்படுத்தி, RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 ஆகியவற்றின் இறுதி மாதிரிகளின் பிரிதிறன்கள் முறையே 2.65 மற்றும் 2.80Å ஆகும். இறுதி மாதிரியின் FSC வளைவு படம் 2. S17-இல் காட்டப்பட்டுள்ளது.
அனைத்து புரத வரிசைகளும் UniProtKB இலிருந்து பதிவிறக்கம் செய்யப்பட்டுள்ளன: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M மற்றும் RC-H ஆகியவற்றின் புரத வரிசைகளையும், Rba. sphaeroides RC-யின் படிக அமைப்பையும் கொண்ட RC-யின் ஒரு ஹோமாலஜி மாதிரியை உருவாக்க SWISS-MODEL (45) பயன்படுத்தப்பட்டது. RC ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது (PDB ID: 5LSE) (46). உருவாக்கப்பட்ட மாதிரியை வரைபடத்திற்கு (47) பொருத்துவதற்கும், புரத அமைப்பை மேம்படுத்துவதற்கும், மற்றும் துணைக்காரணி [4×BChl a (மோனோமர் நூலக எச்சப் பெயர் = BCL), 2×BPh a (BPH), ஒன்று அல்லது இரண்டு வகையான UQ10 (U10), ஒரு ஹீம் அல்லாத இரும்பு (Fe) மற்றும் ஒரு 3,4-டைஹைட்ரோஹெக்ஸாகார்போனைல்கோலின் (QAK)] ஆகியவற்றை Coot (48) ஐப் பயன்படுத்தி சேர்ப்பதற்கும் UCSF Chimera இல் உள்ள “fit map” கருவியைப் பயன்படுத்தவும். மோனோமர் நூலகத்தில் QAK கிடைக்காததால், அது PHENIX (49) இல் உள்ள eLBOW கருவியைப் பயன்படுத்தி அளவுருவாக்கப்பட்டது.
அடுத்து, LH1 துணை அலகு உருவாக்கப்பட்டது. ஆரம்பத்தில், வரைபடம் மற்றும் LH1-α மற்றும் LH1-β புரத வரிசைகளை உள்ளீடாகப் பயன்படுத்தி, LH1 வரிசையின் ஒரு பகுதியைத் தானாக உருவாக்க PHENIX (49) இல் உள்ள தானியங்கி கட்டுமானக் கருவி பயன்படுத்தப்பட்டது. மிகவும் முழுமையான LH1 துணை அலகைத் தேர்ந்தெடுத்து, அதைப் பிரித்தெடுத்து Coot இல் ஏற்றவும், அதில் விடுபட்ட வரிசையை கைமுறையாகச் சேர்க்கவும், மேலும் இரண்டு BCls a (BCL) மற்றும் ஒரு ஸ்பிரில்லாக்ஸாந்தின் (CRT) சேர்ப்பதற்கு முன் முழு கட்டமைப்பையும் கைமுறையாகச் செம்மைப்படுத்தவும் [தொடர்புடைய Rps LH1 வளாகத்தின் அடர்த்தி மற்றும் அறியப்பட்ட கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கம். இனங்கள் (17) படி]. முழுமையான LH1 துணை அலகை நகலெடுத்து, UCSF கைமேரா "டாக்கிங் மேப் டூல்" ஐப் பயன்படுத்தி அருகிலுள்ள LH1 அடர்த்தியின் மாதிரி அல்லாத பகுதியில் இணைக்கவும், பின்னர் அதை Coot இல் செம்மைப்படுத்தவும்; அனைத்து LH1 துணை அலகுகளும் மாதிரியாகும் வரை இந்த செயல்முறையை மீண்டும் செய்யவும். RC-LH114-W கட்டமைப்பிற்கு, Coot-இல் ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தியைப் பிரித்தெடுப்பதன் மூலம், USCF கைமிரா வரைபடத்தில் மீதமுள்ள புரதம் அல்லாத கூறுகளிலிருந்து புரதம் பிரிக்கப்படுகிறது, மேலும் ஆரம்ப மாதிரியை நிறுவ ஆட்டோபில்ட் கருவி பயன்படுத்தப்படுகிறது, மற்றும் மீதமுள்ள துணை அலகுகள் (புரதம்-W) மாதிரியாக்கம். PHENIX-இல் (49). Coot-இல் (48) விளைந்த மாதிரியில் விடுபட்ட வரிசைகளைச் சேர்க்கவும், பின்னர் முழு துணை அலகையும் கைமுறையாகச் செம்மைப்படுத்தவும். மீதமுள்ள ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தி, லிப்பிடுகள் (PDB மோனோமர் நூலக ஐடி CDL = CDL, POPC = 6PL மற்றும் POPG = PGT), β-DDM டிடர்ஜென்ட் (LMT) மற்றும் UQ10 மூலக்கூறுகள் (U10) ஆகியவற்றின் கலவையுடன் பொருந்துகிறது. மாதிரி புள்ளிவிவரங்கள் மற்றும் பொருத்தத்தின் காட்சித் தரம் மேலும் மேம்படுத்த முடியாத வரை முழுமையான ஆரம்ப மாதிரியைச் செம்மைப்படுத்த PHENIX உகப்பாக்கம் (49) மற்றும் Coot-இல் (48) கைமுறை உகப்பாக்கத்தைப் பயன்படுத்தவும். இறுதியாக, உள்ளூர் வரைபடத்தை கூர்மைப்படுத்த LocScale (50) ஐப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தியை மாதிரியாக்குதல் மற்றும் தானியங்கி மற்றும் கைமுறை உகப்பாக்கம் ஆகியவற்றின் பல சுழற்சிகளைச் செய்யவும்.
அந்தந்த அடர்த்திகளுக்குள் நிலைநிறுத்தப்பட்ட தொடர்புடைய பெப்டைடுகள், துணைக்காரணிகள், பிற லிப்பிடுகள் மற்றும் குயினோன்கள் ஆகியவை படங்கள் 1 மற்றும் 2, S18 முதல் S23 வரை காட்டப்பட்டுள்ளன. இறுதி மாதிரியின் புள்ளிவிவரத் தகவல்கள் அட்டவணை S1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், UV/Vis/NIR உட்கவர் நிறமாலைகள், கேரி60 நிறமாலைமானியில் (அஜிலென்ட், அமெரிக்கா) 250 nm முதல் 1000 nm வரை 1 nm இடைவெளியிலும், 0.1 வினாடி ஒருங்கிணைப்பு நேரத்திலும் சேகரிக்கப்பட்டன.
மாதிரியை 2 மிமீ பாதை கொண்ட குவார்ட்ஸ் குவெட்டில் 1 என்ற செறிவுக்கு நீர்த்து, 400 மற்றும் 1000 நானோமீட்டருக்கு இடையில் உள்ள உட்கிரகிப்பு நிறமாலையைச் சேகரிக்கவும். வட்ட இருவண்ண நிறமாலைகள், ஜாஸ்கோ 810 நிறமாலை முனைவாக்கமானியில் (ஜாஸ்கோ, ஜப்பான்) 400 நானோமீட்டர் மற்றும் 950 நானோமீட்டருக்கு இடையில் 1 நானோமீட்டர் இடைவெளியில், 20 நானோமீட்டர்/நிமிடம் என்ற ஸ்கேன் வேகத்தில் சேகரிக்கப்பட்டன.
மையக் கலவையை சுமார் 50 என்ற A880 அளவிற்கு நீர்த்துப்போகச் செய்வதன் மூலம் மோலார் அழிவு குணகம் தீர்மானிக்கப்படுகிறது. 10μl அளவை 990μl பிணைப்பு இடையகத்தில் அல்லது மெத்தனாலில் நீர்த்துப்போகச் செய்து, BChl சிதைவைக் குறைக்க உடனடியாக உறிஞ்சுதல் நிறமாலையைச் சேகரிக்கவும். ஒவ்வொரு மெத்தனால் மாதிரியின் BChl உள்ளடக்கம் 771 nm இல் 54.8 mM-1 cm-1 என்ற அழிவு குணகத்தால் கணக்கிடப்பட்டது, மேலும் அழிவு குணகம் தீர்மானிக்கப்பட்டது (51). மையக் கலவையின் செறிவைத் தீர்மானிக்க அளவிடப்பட்ட BChl செறிவை 32 (RC-LH114-W) அல்லது 36 (RC-LH116) ஆல் வகுக்கவும், இது பின்னர் இடையகத்தில் சேகரிக்கப்பட்ட அதே மாதிரியின் உறிஞ்சுதல் நிறமாலையின் அழிவு குணகத்தைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் மூன்று முறை அளவீடுகள் எடுக்கப்பட்டன, மேலும் BChl Qy அதிகபட்சத்தின் சராசரி உறிஞ்சுதல் கணக்கீட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. 878 nm-ல் அளவிடப்பட்ட RC-LH114-W-ன் அழிவு குணகம் 3280±140 mM-1 cm-1 ஆகவும், 880 nm-ல் அளவிடப்பட்ட RC-LH116-ன் அழிவு குணகம் 3800±30 mM-1 cm-1 ஆகவும் உள்ளது.
(52) இல் உள்ள முறையின்படி UQ10 அளவிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, Agilent 1200 HPLC அமைப்பைப் பயன்படுத்தி ரிவர்ஸ் ஃபேஸ் HPLC (RP-HPLC) செய்யப்பட்டது. சுமார் 0.02 nmol RC-LH116 அல்லது RC-LH114-W ஐ 0.02% (w/v) ஃபெரிக் குளோரைடு கொண்ட 50μl 50:50 மெத்தனால்:குளோரோஃபார்மில் கரைத்து, முன்-சமநிலைப்படுத்தப்பட்ட Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Dissolve ஐ 40°C இல் 1 ml-1 min-1 இல் HPLC கரைப்பானில் (80:20 மெத்தனால்:2-புரோப்பனால்) ×25 cm நெடுவரிசையில் செலுத்தவும். 275 nm (UQ10), 450 nm (கரோட்டினாய்டுகள்) மற்றும் 780 nm (BChl) இல் உறிஞ்சுதலைக் கண்காணிக்க 1 மணி நேரத்திற்கு HPLC கரைப்பானில் ஐசோக்ராடிக் எல்யூஷனைச் செய்யவும். 25.5 நிமிடங்களில் 275 nm குரோமட்டோகிராமில் உள்ள உச்சம் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது, அதில் கண்டறியக்கூடிய வேறு எந்த சேர்மங்களும் இல்லை. 0 முதல் 5.8 nmol வரையிலான தூய தரநிலைகளை உட்செலுத்துவதன் மூலம் கணக்கிடப்பட்ட அளவுத்திருத்த வளைவைப் (படம் S14) பொறுத்து, பிரித்தெடுக்கப்பட்ட UQ10-இன் மோலார் அளவைக் கணக்கிட இந்த ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட பகுதி பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஒவ்வொரு மாதிரியும் மூன்று பிரதிகளில் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் அறிவிக்கப்பட்ட பிழையானது சராசரியின் திட்ட விலகலுக்கு (SD) ஒத்திருக்கிறது.
0.1 என்ற அதிகபட்ச Qy உறிஞ்சுதலைக் கொண்ட RC-LH1 கூட்டுப்பொருளை உள்ளடக்கிய ஒரு கரைசல், 30 μM குறைக்கப்பட்ட குதிரை இதய சைட்டோக்ரோம் c2 (மெர்க், இங்கிலாந்து) மற்றும் 0 முதல் 50 μMUQ2 (மெர்க், இங்கிலாந்து) ஆகியவற்றைக் கொண்டு தயாரிக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு UQ2 செறிவிலும் மூன்று 1-மிலி மாதிரிகள் தயாரிக்கப்பட்டு, அளவீட்டிற்கு முன் இருளுக்கு முழுமையாகப் பழகுவதை உறுதி செய்வதற்காக 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் இருளில் அடைகாக்கப்பட்டன. அந்தக் கரைசல், 300 nm சுடர்/500 வரி கிரேட்டிங், 1.24 மிமீ உள்வழி, 0.12 மிமீ நடு மற்றும் 0.6 மிமீ வெளிவழிப் பிளவுகள் பொருத்தப்பட்ட OLIS RSM1000 மாடுலர் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரில் ஏற்றப்பட்டது. கிளர்வு ஒளியை விலக்குவதற்காக, மாதிரி ஃபோட்டோகுழாய் மற்றும் குறிப்பு ஃபோட்டோமல்டிப்ளையர் குழாயின் நுழைவாயிலில் 600 nm நீளக் கடப்பு வடிகட்டி ஒன்று வைக்கப்பட்டுள்ளது. உறிஞ்சுதலானது 0.15 வி ஒருங்கிணைப்பு நேரத்துடன் 550 nm-ல் கண்காணிக்கப்பட்டது. கிளர்வு ஒளி, 880 nm M880F2 LED (ஒளி உமிழும் டையோடு) (தோர்லாப்ஸ் லிமிடெட், இங்கிலாந்து) இலிருந்து ஒரு ஃபைபர் ஆப்டிக் கேபிள் வழியாக 90% செறிவில் DC2200 கட்டுப்படுத்தி (தோர்லாப்ஸ் லிமிடெட், இங்கிலாந்து) மூலம் உமிழப்பட்டு, ஒளி மூலத்திற்கு 90° கோணத்தில் செலுத்தப்படுகிறது. மாதிரியால் ஆரம்பத்தில் உறிஞ்சப்படாத எந்த ஒளியையும் திருப்பி அனுப்புவதற்காக, அளவிடும் கற்றையானது கண்ணாடிக்கு எதிராக வைக்கப்படுகிறது. 50 விநாடி ஒளியூட்டத்திற்கு 10 விநாடிகளுக்கு முன்பு உறிஞ்சுதலைக் கண்காணிக்கவும். பின்னர், குயினோலோல் தன்னிச்சையாக சைட்டோக்ரோம் c23+ ஐ எந்த அளவிற்கு ஒடுக்குகிறது என்பதை மதிப்பிடுவதற்காக, இருளில் 60 விநாடிகளுக்கு உறிஞ்சுதலானது மேலும் கண்காணிக்கப்பட்டது (மூலத் தரவுகளுக்கு படம் S8 ஐப் பார்க்கவும்).
(UQ2 செறிவைப் பொறுத்து) 0.5 முதல் 10 வினாடிகளுக்குள் ஒரு நேரியல் ஆரம்ப வீதத்தைப் பொருத்தி, ஒவ்வொரு UQ2 செறிவிலும் மூன்று மாதிரிகளின் வீதங்களையும் சராசரியாகக் கணக்கிடுவதன் மூலம் தரவு செயலாக்கப்பட்டது. அந்தந்த அழிவுக் குணகத்தால் கணக்கிடப்பட்ட RC-LH1 செறிவு, வீதத்தை வினையூக்கத் திறனாக மாற்றுவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. இது Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) இல் வரைபடமாக்கப்பட்டு, தோற்ற Km மற்றும் Kcat மதிப்புகளைத் தீர்மானிக்க மைக்கேலிஸ்-மென்டன் மாதிரியுடன் பொருத்தப்பட்டது.
நிலையற்ற உறிஞ்சுதல் அளவீடுகளுக்காக, RC-LH1 மாதிரியானது, 50 mM சோடியம் அஸ்கார்பேட் (மெர்க், அமெரிக்கா) மற்றும் 0.4 mM டெர்புடின் (மெர்க், அமெரிக்கா) ஆகியவற்றைக் கொண்ட IMAC தாங்கல் கரைசலில் ~2μM அளவிற்கு நீர்க்கப்பட்டது. அளவீட்டுச் செயல்முறை முழுவதும் முக்கிய RC கொடையாளி ஒடுக்கப்பட்ட நிலையில் (அதாவது, ஒளி ஆக்சிஜனேற்றம் அடையாமல்) இருப்பதை உறுதி செய்வதற்காக, அஸ்கார்பிக் அமிலம் ஒரு தியாக எலக்ட்ரான் கொடையாளியாகவும், டெர்ட்-பியூட்டாக்ளோஃபென் ஒரு QB தடுப்பானாகவும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. தூண்டல் துடிப்புகளுக்கு இடையில் லேசர் பாதையில் உள்ள மாதிரிக்கு இருளில் தகவமைத்துக் கொள்ளப் போதுமான நேரம் கிடைப்பதை உறுதி செய்வதற்காக, சுமார் 3 மிலி மாதிரியானது, 2 மிமீ ஒளியியல் பாதை நீளம் கொண்ட ஒரு பிரத்யேக சுழலும் கலத்தில் (சுமார் 0.1 மீ விட்டம், 350 RPM) சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரியை 880 nm அலைநீளத்தில் 1 kHz மறுநிகழ்வு விகிதத்தில் (NIR-க்கு 20 nJ அல்லது Vis-க்கு 100 nJ) தூண்டுவதற்கு, Ti: Sapphire லேசர் அமைப்பை (Spectra Physics, USA) பெருக்குவதற்கு ~100-fs லேசர் துடிப்புகளைப் பயன்படுத்தவும். தரவுகளைச் சேகரிப்பதற்கு முன், மாதிரியை சுமார் 30 நிமிடங்களுக்குத் தூண்டல் ஒளிக்கு வெளிப்படுத்தவும். இந்த வெளிப்பாடு QA செயலிழப்பை ஏற்படுத்தும் (ஒருவேளை QA-வை ஒன்று அல்லது இரண்டு முறை குறைக்கலாம்). ஆனால், இந்தச் செயல்முறை மீளக்கூடியது என்பதை நினைவில் கொள்ளவும், ஏனெனில் நீண்ட கால இருள் தழுவலுக்குப் பிறகு, RC மெதுவாக QA செயல்பாட்டிற்குத் திரும்பும். -10 முதல் 7000 ps வரையிலான தாமத நேரத்துடன் நிலைமாறும் நிறமாலைகளை அளவிட ஒரு Helios நிறமாலைமானி (Ultrafast Systems, USA) பயன்படுத்தப்பட்டது. தரவுத் தொகுப்புகளைப் பிரிக்க Surface Xplorer மென்பொருளை (Ultrafast Systems, USA) பயன்படுத்தவும், பின்னர் அவற்றை ஒன்றிணைத்துத் தரப்படுத்தவும். சிதைவு தொடர்பான வேறுபாட்டு நிறமாலைகளைப் பெறுவதற்கு, ஒருங்கிணைந்த தரவுத் தொகுப்பைப் பயன்படுத்த கார்பெட்வியூ மென்பொருள் தொகுப்பை (லைட் கன்வர்ஷன் லிமிடெட், லிதுவேனியா) பயன்படுத்தவும், அல்லது ஆரிஜினில் (ஆரிஜின்லேப், அமெரிக்கா) ஒற்றை அலைநீள நிறமாலை பரிணாமத்தைப் பொருத்துவதற்கு, கருவியின் துலங்கலுடன் பல அடுக்குக்குறிகளை இணைக்கும் ஒரு செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்தவும்.
மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி (53), RC மற்றும் புற LH2 ஆன்டெனா இரண்டும் இல்லாத LH1 காம்ப்ளெக்ஸைக் கொண்ட ஒரு ஒளிச்சேர்க்கை படலம் தயாரிக்கப்பட்டது. சவ்வு 20 mM டிரிஸில் (pH 8.0) நீர்த்துப் பின்னர் 2 மிமீ ஒளியியல் பாதையுடன் கூடிய குவார்ட்ஸ் கியூவெட்டில் ஏற்றப்பட்டது. -10 முதல் 7000 ps வரையிலான தாமத நேரத்துடன் 540 nm இல் மாதிரியைத் தூண்டுவதற்கு 30nJ லேசர் துடிப்பு பயன்படுத்தப்பட்டது. Rps. pal மாதிரிக்கு விவரிக்கப்பட்டபடி தரவுத் தொகுப்பைச் செயலாக்கவும்.
சவ்வு 4°C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரத்திற்கு 150,000 RCF வேகத்தில் மையவிலக்கு முறையில் திரட்டப்பட்டது, பின்னர் அதன் 880 nm உறிஞ்சலானது 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) மற்றும் 200 mM NaCl இல் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டது. 4°C வெப்பநிலையில் இருட்டில் 1 மணி நேரத்திற்கு 2% (w/v) β-DDM இல் மெதுவாகக் கலக்குவதன் மூலம் சவ்வைக் கரைக்கவும். மாதிரியானது 100 mM டிரையெதிலமோனியம் கார்பனேட் (pH 8.0) (TEAB; மெர்க், UK) இல் 2.5 mg ml-1 (பயோ-ராட் பகுப்பாய்வு) புரதச் செறிவுக்கு நீர்க்கப்பட்டது. முன்னர் வெளியிடப்பட்ட முறையிலிருந்து (54) மேலதிக செயலாக்கம் மேற்கொள்ளப்பட்டது, இது 50 μg புரதத்தை 1% (w/v) சோடியம் லாரேட் (மெர்க், UK) கொண்ட மொத்தம் 50 μl TEAB இல் நீர்த்தலுடன் தொடங்குகிறது. 60 விநாடிகள் சோனிகேஷனுக்குப் பிறகு, அது 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு 5 mM டிரிஸ்(2-கார்பாக்சியெத்தில்)பாஸ்பைன் (மெர்க், யுகே) கொண்டு ஒடுக்கப்பட்டது. S-ஆல்கைலேஷனுக்காக, மாதிரியை 10 mM மெத்தில் S-மெத்தில்தியோமெத்தேன்சல்பொனேட் (மெர்க், யுகே) உடன் அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு அடைகாத்து, அதை 200 mM ஐசோபுரோப்பனால் ஸ்டாக் கரைசலில் இருந்து சேர்க்கவும். 2 μg டிரிப்சின்/எண்டோபுரோட்டினேஸ் லைஸ்-சி கலவையை (புரோமேகா யுகே) சேர்த்து, 37°C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாப்பதன் மூலம் புரோட்டியோலிடிக் செரிமானம் மேற்கொள்ளப்பட்டது. 50 μl எத்தில் அசிட்டேட் மற்றும் 10 μl 10% (v/v) LC கிரேடு டிரைஃப்ளூரோஅசிட்டிக் அமிலம் (TFA; தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், யுகே) சேர்த்து 60 விநாடிகள் வோர்டெக்ஸிங் செய்வதன் மூலம் லாரேட் சர்பாக்டான்ட் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. 15,700 RCF வேகத்தில் 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் கட்டப் பிரிப்பு ஊக்குவிக்கப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, பெப்டைடைக் கொண்ட கீழ் கட்டத்தை கவனமாக உறிஞ்சி உப்பு நீக்கம் செய்ய ஒரு C18 ஸ்பின் காலம் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், யுகே) பயன்படுத்தப்பட்டது. வெற்றிட மையவிலக்கு மூலம் உலர்த்திய பிறகு, அந்த மாதிரி 0.5% TFA மற்றும் 3% அசிட்டோநைட்ரைலில் கரைக்கப்பட்டது, மேலும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட அமைப்பு அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி, நிறை நிறமாலைமானியுடன் இணைக்கப்பட்ட நானோஃப்ளோ RP நிறப்பிரிகை மூலம் 500 ng பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
Rps. palustris புரோட்டியோம் தரவுத்தளத்தை (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) தேடுவதற்கு, புரதத்தை அடையாளம் காணவும் அளவிடவும் MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ஐப் பயன்படுத்தவும். மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவு, PXD020402 என்ற தரவுத்தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியின் கீழ், PRIDE கூட்டாளர் களஞ்சியம் (http://proteomecentral.proteomexchange.org) வழியாக ProteomeXchange கூட்டணியில் சமர்ப்பிக்கப்பட்டுள்ளது.
எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்க நிறை நிறமாலையியல் உடன் இணைக்கப்பட்ட RPLC மூலம் பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக, RC-LH1 கூட்டுப்பொருள் காட்டுவகை Rps-லிருந்து தயாரிக்கப்பட்டது. முன்னர் வெளியிடப்பட்ட முறையைப் (16) பயன்படுத்தி, 20 mM ஹெப்ஸ் (pH 7.8), 100 mM NaCl மற்றும் 0.03% (w/v) β- (பயோ-ராட் பகுப்பாய்வு) DDM ஆகியவற்றில் பாலுஸ்ட்ரிஸ் செல்களில் உற்பத்தி செய்யப்பட்ட புரதச் செறிவு 2 mg ml-1 ஆக இருந்தது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, வீழ்படிவு முறையில் 10 μg புரதத்தைப் பிரித்தெடுக்க 2D சுத்திகரிப்பு கிட்டை (GE ஹெல்த்கேர், அமெரிக்கா) பயன்படுத்தவும், மேலும் வீழ்படிவை 20 μl 60% (v/v) ஃபார்மிக் அமிலம் (FA), 20% (v/v) அசிட்டோநைட்ரைல் மற்றும் 20% (v/v) நீரில் கரைக்கவும். ஐந்து மைக்ரோலிட்டர்கள் நிறை நிறமாலையியல் (மேக்சிஸ் UHR-TOF, புரூக்கர்) உடன் இணைக்கப்பட்ட RPLC (டயோனெக்ஸ் RSLC) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. 60°C மற்றும் 100μlmin -1 இல் பிரித்தெடுப்பதற்கு MabPac 1.2×100 mm நிரலைப் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், யுகே) பயன்படுத்தவும். இதில் 85% (v/v) கரைப்பான் A [0.1% (v/v) FA மற்றும் 0.02% (V/v) TFA நீர்க்கரைசல்] முதல் 85%(v/v) கரைப்பான் B [0.1%(v/v) FA மற்றும் 0.02%(v/v) 90%(v/v) அசிட்டோநைட்ரைலில் TFA] வரையிலான சாய்வு பயன்படுத்தப்படுகிறது. நிலையான எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்க மூலம் மற்றும் இயல்புநிலை அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி 60 நிமிடங்களுக்கும் மேலாக, நிறை நிறமாலைமானி 100 முதல் 2750 m/z (நிறை-மின்னூட்ட விகிதம்) வரை பெறுகிறது. ExPASy உயிரித்தகவல் வள இணையதளத்தின் FindPept கருவியின் (https://web.expasy.org/findpept/) உதவியுடன், நிறை நிறமாலையை அந்த அணைவின் துணை அலகுகளுடன் பொருத்தவும்.
செல்கள் 100 மிலி NF-குறைந்த (10μMm-2 s-1), நடுத்தர (30μMm-2 s-1) அல்லது அதிக (300μMm-2 s-1) ஒளியின் கீழ் 72 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. M22 ஊடகம் (அம்மோனியம் சல்பேட் தவிர்க்கப்பட்டு, சோடியம் சக்சினேட்டிற்குப் பதிலாக சோடியம் அசிடேட் சேர்க்கப்பட்ட M22 ஊடகம்) 100 மிலி திருகு மூடி பாட்டிலில் (23) வைக்கப்பட்டது. ஐந்து 30-வினாடி சுழற்சிகளில், செல்களை சிதைப்பதற்காக 0.1 மைக்ரான் கண்ணாடி மணிகள் 1:1 கன அளவு விகிதத்தில் கோர்க்கப்பட்டு, 5 நிமிடங்களுக்கு பனிக்கட்டியில் குளிர்விக்கப்பட்டன. கரையாத பொருட்கள், உடையாத செல்கள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகள் ஆகியவை ஒரு மேசை மேல் மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜில் 10 நிமிடங்களுக்கு 16,000 RCF வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் அகற்றப்பட்டன. அந்தச் சவ்வு, 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) கரைசலில், 40/15% (w/w) சுக்ரோஸ் சாய்வுமுறையில், 10 மணி நேரத்திற்கு Ti 70.1 ரோட்டரில் 100,000 RCF வேகத்தில் பிரிக்கப்பட்டது.
எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் விவரிக்கப்பட்டபடி, PufW (16) இல் உள்ள His குறிச்சொல்லின் நோயெதிர்ப்பு கண்டறிதல். சுருக்கமாக, சுத்திகரிக்கப்பட்ட மையக் கலவை (11.8 nM) அல்லது அதே செறிவுள்ள RC ஐக் கொண்ட சவ்வு (ஆக்ஸிஜனேற்றத்தைக் கழித்து, குறைக்கப்பட்ட வேறுபாட்டு நிறமாலையைக் கழித்து, கறை படிந்த ஜெல் மீதான சுமையுடன் பொருத்துவதன் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது) 2x SDS லோடிங் பஃபரில் (மெர்க், UK) இரண்டு முறை நீர்க்கப்பட்டது. புரதங்கள் ஒரு பிரதி 12% பிஸ்-ட்ரிஸ் நியூபேஜ் ஜெல் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) மீது பிரிக்கப்பட்டன. RC-L துணை அலகை ஏற்றுவதற்கும் காட்சிப்படுத்துவதற்கும் ஒரு ஜெல் கூமாஸி பிரில்லியன்ட் ப்ளூ (பயோ-ராட், UK) கொண்டு கறை படியவைக்கப்பட்டது. இரண்டாவது ஜெல் மீதான புரதம், நோயெதிர்ப்பு மதிப்பீட்டிற்காக மெத்தனால்-செயல்படுத்தப்பட்ட பாலிவினைலிடீன் ஃபுளோரைடு (PVDF) சவ்வுக்கு (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) மாற்றப்பட்டது. PVDF சவ்வு 50 mM டிரிஸ்-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) ட்வீன்-20 மற்றும் 5% (w/v) கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பால் பவுடர் ஆகியவற்றில் தடுக்கப்பட்டு, பின்னர் ஆன்டி-ஹிஸ் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (ஆன்டிபாடி இடையகத்தை [50 mM டிரிஸ்-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl மற்றும் 0.05% (v/v) ட்வீன்-20] 1:1000 A190-114A, பெத்தில் ஆய்வகங்கள், அமெரிக்கா என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கவும்) 4 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. ஆன்டிபாடி பஃபரில் 5 நிமிடங்களுக்கு 3 முறை கழுவிய பிறகு, அந்த மென்படலம், ஹார்ஸ்ராடிஷ் பெராக்ஸைடு (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், யுகே) ஆன்டி-மவுஸ் செகண்டரி ஆன்டிபாடியுடன் (ஆன்டிபாடி பஃபரில் 1:10,000 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டது) இணைக்கப்பட்டது. வெஸ்டார் ETA C 2.0 கெமிலுமினெசென்ஸ் சப்ஸ்ட்ரேட் (சயனஜென், இத்தாலி) மற்றும் அமர்ஷாம் இமேஜர் 600 (ஜிஇ ஹெல்த்கேர், யுகே) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, கண்டறிதலை அனுமதிப்பதற்காக (ஆன்டிபாடி பஃபரில் 3 முறை கழுவிய பிறகு 5 நிமிடங்கள்) அடைகாக்கப்பட்டது.
ஒவ்வொரு கறை படிந்த ஜெல் அல்லது இம்யூனோஅஸ்ஸே லேனின் தீவிர விநியோகத்தை வரைந்து, உச்சத்தின் கீழ் உள்ள பகுதியை ஒருங்கிணைத்து, RC-L (கறை படிந்த ஜெல்) மற்றும் புரதம்-W (இம்யூனோஅஸ்ஸே) ஆகியவற்றின் தீவிர விகிதத்தைக் கணக்கிடுவதன் மூலம், ImageJ (57) இல் படத்தை செயலாக்கவும். தூய RC-LH114-W மாதிரியில் RC-L மற்றும் புரதம்-W விகிதம் 1:1 என்று கருதி, அதற்கேற்ப முழு தரவுத் தொகுப்பையும் இயல்பாக்குவதன் மூலம் இந்த விகிதங்கள் மோலார் விகிதங்களாக மாற்றப்பட்டன.
இந்தக் கட்டுரைக்கான கூடுதல் தகவல்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 என்ற இணைப்பைப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன் உரிமத்தின் கீழ் விநியோகிக்கப்படும் ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரை ஆகும். அசல் படைப்பு முறையாக மேற்கோள் காட்டப்பட வேண்டும் என்ற நிபந்தனையின் பேரில், இக்கட்டுரை எந்தவொரு ஊடகத்திலும் கட்டுப்பாடற்ற பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கத்திற்கு அனுமதிக்கப்படுகிறது.
குறிப்பு: நீங்கள் இந்தப் பக்கத்திற்குப் பரிந்துரைக்கும் நபர், இந்த மின்னஞ்சலை அவர்கள் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் அறிந்துகொள்வதற்காக மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் கேட்டுக்கொள்கிறோம். நாங்கள் எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் சேகரிக்க மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளர்தானா என்பதைச் சோதிப்பதற்கும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுப்பதற்கும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
டேவிட் ஜே.கே. ஸ்வைன்ஸ்பரி, பார்க் கியான், பிலிப் ஜே. ஜாக்சன், கெய்ட்லின் எம். ஃபாரிஸ், டாரியஸ் எம். நீட்ஸ்விட்ஸ்கி, எலிசபெத் சி. மார்ட்டின், டேவிட் ஏ. ஃபார்மர், லோர்னா ஏ. மலோன், ரெபேக்கா எஃப். தாம்சன், நீல் ஏ. ரான்சன், டேனியல் பி. கேனிஃப், மார்க் ஜே. டிக்மேன், டூயி ஹோல்டன், கிறிஸ்டின் கிர்மேயர், ஆண்ட்ரூ ஹிட்ச்காக், சி. நீல் ஹண்டர்
வினை மையத்தில் உள்ள ஒளிப் பொறி 1 அணைவின் உயர் தெளிவுத்திறன் அமைப்பு, குயினோன் இயக்கவியல் குறித்த புதிய புரிதல்களை வழங்குகிறது.
டேவிட் ஜே.கே. ஸ்வைன்ஸ்பரி, பார்க் கியான், பிலிப் ஜே. ஜாக்சன், கெய்ட்லின் எம். ஃபாரிஸ், டாரியஸ் எம். நீட்ஸ்விட்ஸ்கி, எலிசபெத் சி. மார்ட்டின், டேவிட் ஏ. ஃபார்மர், லோர்னா ஏ. மலோன், ரெபேக்கா எஃப். தாம்சன், நீல் ஏ. ரான்சன், டேனியல் பி. கேனிஃப், மார்க் ஜே. டிக்மேன், டூயி ஹோல்டன், கிறிஸ்டின் கிர்மேயர், ஆண்ட்ரூ ஹிட்ச்காக், சி. நீல் ஹண்டர்
வினை மையத்தில் உள்ள ஒளிப் பொறி 1 அணைவின் உயர் தெளிவுத்திறன் அமைப்பு, குயினோன் இயக்கவியல் குறித்த புதிய புரிதல்களை வழங்குகிறது.
©2021 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS ஆனது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.