தற்போதைய முகவரி: கொலோன் 50931, ஜெர்மனி, முதுமை தொடர்பான நோய்களில் உயிரணு அழுத்த எதிர்வினை குறித்த கொலோன் சிறப்பு ஆராய்ச்சி மையம் (CECAD).
நியூரான்களின் வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மை குறைவாக இருப்பதால், மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களால் ஏற்படும் நரம்புச் சிதைவு மீள முடியாததாகக் கருதப்படுகிறது. ஆனால், உடலில் உள்ள நியூரான்களின் வளர்சிதை மாற்றச் செயல்பாட்டின் மீதான மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் விளைவு சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. இங்கு, சீர்குலைந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு இயக்கவியலால் ஏற்படும் படிப்படியான OXPHOS குறைபாடு கொண்ட புர்கின்ஜே நியூரான்களின் செல்-சார்ந்த புரோட்டியோமை நாங்கள் அறிமுகப்படுத்துகிறோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, புரோட்டியோமிக்ஸ் துறையில் ஒரு ஆழமான மாற்றத்தைத் தூண்டியது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். இது இறுதியில், செல் இறப்பிற்கு முன்பு துல்லியமான வளர்சிதை மாற்றத் திட்டங்களின் தொடர்ச்சியான செயல்பாட்டிற்கு வழிவகுத்தது. எதிர்பாராதவிதமாக, TCA சுழற்சியின் இடைநிலைகளுக்குத் துணைபுரியும் பைருவேட் கார்பாக்சிலேஸ் (PCx) மற்றும் பிற முதுமை எதிர்ப்பு நொதிகளின் தெளிவான தூண்டலை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். PCx-ஐத் தடுப்பது ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தையும் நரம்புச் சிதைவையும் அதிகப்படுத்தியது. இது, OXPHOS இல்லாத நியூரான்களில் தமனித் தடிப்பு ஒரு பாதுகாப்பு விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது. முழுமையாகச் சிதைந்த நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவை மீட்டெடுப்பது, இந்த வளர்சிதை மாற்றப் பண்புகளை முழுமையாக மாற்றியமைத்து, அதன் மூலம் செல் இறப்பைத் தடுக்கிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பிற்கு மீள்திறனை வழங்கும், இதுவரை அறியப்படாத வழிமுறைகளை எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் அடையாளம் காட்டுகின்றன; மேலும், நோயின் இறுதிக் கட்டங்களில்கூட நரம்புச் சிதைவை மீளமைக்க முடியும் என்பதையும் அவை நிரூபிக்கின்றன.
மனித மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களுடன் தொடர்புடைய விரிவான நரம்பியல் அறிகுறிகளால், நரம்பியல் ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்தைப் பராமரிப்பதில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் மையப் பங்கு வலியுறுத்தப்படுகிறது. இந்த நோய்களில் பெரும்பாலானவை, மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு வெளிப்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் மரபணு மாற்றங்களால் (1, 2) அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் தொடர்பான மரபணு அழிவால் ஏற்படுகின்றன, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ (mtDNA) நிலைத்தன்மையை மறைமுகமாகப் பாதிக்கிறது (3, 4). விலங்கு மாதிரிகளில் செய்யப்பட்ட ஆய்வுகள், சுற்றியுள்ள திசுக்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, நிலையான வளர்சிதை மாற்றப் பாதைகள் (5-7) செயல்படுத்தப்படலாம் என்பதைக் காட்டுகின்றன, இது இந்த சிக்கலான நோய்களின் நோய்க்காரணவியலைப் பற்றிய ஆழமான புரிதலுக்கு முக்கியமான தகவல்களை வழங்குகிறது. இதற்கு முற்றிலும் மாறாக, மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியல் அடினோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (ATP) உற்பத்தியின் பொதுவான தோல்வியால் ஏற்படும் குறிப்பிட்ட செல் வகைகளின் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்கள் குறித்த நமது புரிதல் அடிப்படையானது (8), இது நோயைத் தடுக்க அல்லது நரம்புச் சிதைவைத் தடுக்கப் பயன்படுத்தக்கூடிய சிகிச்சை இலக்குகளை அடையாளம் காண வேண்டியதன் அவசியத்தை வலியுறுத்துகிறது (9). சுற்றியுள்ள திசுக்களின் செல் வகைகளுடன் ஒப்பிடும்போது நரம்பு செல்கள் மிகவும் குறைந்த வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதாக பரவலாகக் கருதப்படுகிறது என்பதே தகவல் பற்றாக்குறையாகும் (10). சினாப்டிக் கடத்தலை ஊக்குவிக்கவும், காயம் மற்றும் நோய் நிலைகளுக்கு பதிலளிக்கவும் நியூரான்களுக்கு வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் விநியோகத்தை ஒருங்கிணைப்பதில் இந்த செல்கள் ஒரு முக்கிய பங்கு வகிப்பதால், மூளை திசுக்களின் சவாலான நிலைமைகளுக்கு ஏற்ப செல் வளர்சிதை மாற்றத்தை மாற்றியமைக்கும் திறன் கிட்டத்தட்ட கிளியல் செல்களுக்கு மட்டுமே உள்ளது (11-14). கூடுதலாக, மூளை திசுக்களின் உள்ளார்ந்த செல்லுலார் பன்முகத்தன்மை, குறிப்பிட்ட நியூரானல் துணைக்குழுக்களில் ஏற்படும் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களைப் பற்றிய ஆய்வை பெருமளவில் தடுக்கிறது. இதன் விளைவாக, நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் துல்லியமான செல்லுலார் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகள் பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகளைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வெளிப்புற சவ்வு இணைவு (Mfn2) அழிவினால் ஏற்படும் நரம்புச் சிதைவின் வெவ்வேறு நிலைகளில் உள்ள புர்கின்ஜே நியூரான்களை (PNs) நாங்கள் தனிமைப்படுத்தினோம். மனிதர்களில் Mfn2 பிறழ்வுகள், ஷார்கோட்-மேரி-டூத் வகை 2A (15) எனப்படும் ஒரு வகையான பரம்பரை மோட்டார் உணர்ச்சி நரம்பியல் நோயுடன் தொடர்புடையதாக இருந்தாலும், எலிகளில் Mfn2-இன் நிபந்தனைக்குட்பட்ட அழிவு என்பது ஆக்சிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷன் (OXPHOS) செயலிழப்பைத் தூண்டும் ஒரு நன்கு அறியப்பட்ட முறையாகும். பல்வேறு நியூரானல் துணை வகைகள் (16-19) மற்றும் அதன் விளைவாக ஏற்படும் நரம்புச் சிதைவுப் பண்பு ஆகியவை இயக்கக் கோளாறுகள் (18, 19) அல்லது செரிபெல்லார் அட்டாக்ஸியா (16) போன்ற முற்போக்கான நரம்பியல் அறிகுறிகளுடன் சேர்ந்து காணப்படுகின்றன. லேபிள்-இல்லாத அளவுசார் (LFQ) புரோட்டியோமிக்ஸ், மெட்டபாலோமிக்ஸ், இமேஜிங் மற்றும் வைராலஜிக்கல் முறைகளின் கலவையைப் பயன்படுத்தி, முற்போக்கான நரம்புச் சிதைவானது, உயிருள்ள PN-களின் தமனித் தடிப்புடன் தொடர்புடைய பைருவேட் கார்பாக்சிலேஸ் (PCx) மற்றும் பிற காரணிகளின் நொதி வெளிப்பாட்டை வலுவாகத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம். இந்தக் கண்டுபிடிப்பின் பொருத்தத்தை சரிபார்க்க, Mfn2-குறைபாடுள்ள PN-களில் PCx-இன் வெளிப்பாட்டை நாங்கள் குறிப்பாகக் குறைத்தோம், மேலும் இந்தச் செயல்பாடு ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தை அதிகப்படுத்தி, நரம்புச் சிதைவை விரைவுபடுத்துவதைக் கண்டறிந்தோம். இதன் மூலம், அசோஸ்பெர்மியா செல் இறப்பு வளர்சிதை மாற்றத் தகவமைப்பை வழங்குகிறது என்பதை நிரூபிக்கிறது. MFN2-இன் கடுமையான வெளிப்பாடு, கடுமையான OXPHOS குறைபாடு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ-வின் பெரும் நுகர்வு மற்றும் வெளிப்படையாக உடைந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பு ஆகியவற்றைக் கொண்ட இறுதிநிலைச் சிதைவு PN-ஐ முழுமையாக மீட்க முடியும். இது, இந்த வகையான நரம்புச் சிதைவு, செல் இறப்பிற்கு முன்பே நோயின் முற்றிய நிலையில்கூட மீள முடியும் என்பதை மேலும் வலியுறுத்துகிறது.
Mfn2 மரபணு நீக்கப்பட்ட PN-களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் காட்சிப்படுத்த, Cre-சார்ந்த மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் மஞ்சள் ஒளிரும் புரதத்தை (YFP) (mtYFP) (20) இலக்காகக் கொள்ள அனுமதிக்கும் ஒரு சுண்டெலி வகையைப் பயன்படுத்தி, உயிருள்ள நிலையில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவமைப்பைச் சரிபார்த்தோம். PN-களில் Mfn2 மரபணுவின் அழிவு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பின் படிப்படியான பிரிவுக்கு வழிவகுக்கும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S1A), மேலும் ஆரம்ப மாற்றம் 3 வார வயதில் காணப்பட்டது. இதற்கு மாறாக, கால்பிண்டின் இம்யூனோஸ்டெய்னிங் இழப்பால் நிரூபிக்கப்பட்ட PN செல் அடுக்கின் கணிசமான சிதைவு, 12 வார வயது வரை தொடங்கவில்லை (படம் 1, A மற்றும் B). மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவமைப்பில் ஏற்படும் ஆரம்ப மாற்றங்களுக்கும், நரம்பணு இறப்பின் புலப்படும் தொடக்கத்திற்கும் இடையிலான நேரப் பொருத்தமின்மை, செல் இறப்பிற்கு முன்பு மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பால் தூண்டப்படும் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களை ஆராய எங்களைத் தூண்டியது. YFP (YFP+) வெளிப்படுத்தும் PN-களை (படம் 1C) மற்றும் கட்டுப்பாட்டு எலிகளில் (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), இனிமேல் CTRL (படம் S1B) எனக் குறிப்பிடப்படுபவற்றை, நாங்கள் ஃப்ளோரசன்ஸ்-ஆக்டிவேட்டட் செல் சார்ட்டிங் (FACS) அடிப்படையிலான ஒரு உத்தியை உருவாக்கினோம். YFP சிக்னலின் சார்பு செறிவின் அடிப்படையில் கேட்டிங் உத்தியை மேம்படுத்துவதன் மூலம், PN-களின் YFP+ பாடியை (YFPhigh), PN அல்லாதவற்றிலிருந்து (YFPneg) (படம் S1B) அல்லது சாத்தியமான ஃப்ளோரசன்ட் ஆக்சான்/டென்ட்ரிடிக் துண்டுகளிலிருந்து (YFPlow; படம் S1D, இடது) தூய்மைப்படுத்த முடிகிறது. இது கான்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம் S1D, வலது). வகைப்படுத்தப்பட்ட பாப்புலேஷனின் அடையாளத்தைச் சரிபார்க்க, நாங்கள் LFQ புரோட்டியோமிக்ஸ் மற்றும் பின்னர் பிரின்சிபல் காம்பொனென்ட் அனாலிசிஸ் ஆகியவற்றை நடத்தினோம், மேலும் YFPhigh மற்றும் YFPneg செல்களுக்கு இடையே ஒரு தெளிவான பிரிப்பு இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S1C). YFPhigh செல்கள் அறியப்பட்ட PN குறிப்பான்களின் (அதாவது Calb1, Pcp2, Grid2 மற்றும் Itpr3) நிகர செறிவூட்டலைக் காட்டின (21, 22), ஆனால் நியூரான்கள் அல்லது பிற செல் வகைகளில் பொதுவாக வெளிப்படுத்தப்படும் புரதங்களின் செறிவூட்டல் இல்லை (படம் 1D). தனிப்பட்ட சோதனைகளில் சேகரிக்கப்பட்ட வகைப்படுத்தப்பட்ட YFPhigh செல்களில் உள்ள மாதிரிகளுக்கு இடையிலான ஒப்பீடு, 0.9-க்கும் அதிகமான தொடர்பு குணகத்தைக் காட்டியது, இது உயிரியல் பிரதிகளுக்கு இடையில் நல்ல மறுஉற்பத்தித்திறனை நிரூபிக்கிறது (படம் S1E). சுருக்கமாக, இந்தத் தரவுகள் சாத்தியமான PN-ஐ விரைவாகவும் குறிப்பாகவும் பிரித்தெடுப்பதற்கான எங்கள் திட்டத்தை உறுதிப்படுத்தின. பயன்படுத்தப்பட்ட L7-cre டிரைவர் அமைப்பு, விநியோகத்திற்குப் பிறகு முதல் வாரத்தில் மொசைக் மறுசேர்க்கையைத் தூண்டுவதால் (23), நாங்கள் CTRL மற்றும் நிபந்தனைக்குட்பட்ட (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) எலிகளை நியூரான்களைச் சேகரிக்கத் தொடங்கினோம். மறுசேர்க்கை முடிந்த பிறகு, 4 வார வயதில் அது Mfn2cKO என்று அழைக்கப்படுகிறது. இறுதிப் புள்ளியாக, தெளிவான மைட்டோகாண்ட்ரியல் துண்டாதல் இருந்தபோதிலும் PN அடுக்கு அப்படியே இருந்த 8 வார வயதை நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம் (படம் 1B மற்றும் படம் S1A). மொத்தத்தில், நாங்கள் மொத்தம் 3013 புரதங்களை அளவிட்டோம், அவற்றில் சுமார் 22% மைட்டோகாண்ட்ரியாவாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரோட்டியோமை அடிப்படையாகக் கொண்ட MitoCarta 2.0 குறிப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை (படம் 1E) (படம் 1E) (24). 8வது வாரத்தில் செய்யப்பட்ட வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, அனைத்து புரதங்களில் 10.5% மட்டுமே குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களைக் கொண்டிருந்தன என்பதைக் காட்டியது (படம் 1F மற்றும் படம் S1F), அவற்றில் 195 புரதங்கள் கீழ்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டும் 120 புரதங்கள் மேல்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டும் இருந்தன (படம் 1F). இந்த தரவுத் தொகுப்பின் "புதுமையான பாதை பகுப்பாய்வு" வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் முக்கியமாக குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளின் ஒரு கட்டுப்படுத்தப்பட்ட தொகுப்பைச் சேர்ந்தவை என்பதைக் காட்டுகிறது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது (படம் 1G). சுவாரஸ்யமாக, OXPHOS மற்றும் கால்சியம் சமிக்ஞை தொடர்பான பாதைகளின் குறைவுபடுத்தல், இணைவு-குறைபாடுள்ள PN-களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு தூண்டப்படுவதை உறுதிப்படுத்தினாலும், முக்கியமாக அமினோ அமில வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஈடுபடும் மற்ற பிரிவுகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரிக்கின்றன, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் PN-களின் மறுசீரமைப்பு செயலிழப்பில் நிகழும் வளர்சிதை மாற்றத்துடன் ஒத்துப்போகிறது.
(A) CTRL மற்றும் Mfn2cKO எலிகளின் சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ கான்ஃபோகல் புகைப்படங்கள், PN-களின் படிப்படியான இழப்பைக் காட்டுகின்றன (கால்பிண்டின், சாம்பல்); உட்கருக்கள் DAPI கொண்டு எதிர்நிறமூட்டப்பட்டன. (B) (A)-இன் அளவு நிர்ணயம் (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு, ***P<0.001; மூன்று எலிகளிலிருந்து n = 4 முதல் 6 வட்டங்கள்). (C) பரிசோதனைப் பணிப்பாய்வு. (D) புர்கின்ஜே (மேல்) மற்றும் பிற செல் வகைகளுக்கு (நடுவில்) குறிப்பிட்ட குறிப்பான்களின் வெப்ப வரைபடப் பரவல். (E) வகைப்படுத்தப்பட்ட PN-இல் அடையாளம் காணப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களின் எண்ணிக்கையைக் காட்டும் வென் வரைபடம். (F) 8 வாரங்களில் Mfn2cKO நியூரான்களில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களின் எரிமலை வரைபடம் (முக்கியத்துவ வரம்பு மதிப்பு 1.3). (G) ஆக்கத்திறன் வழித்தடப் பகுப்பாய்வு, 8 வாரங்களாக வகைப்படுத்தப்பட்ட Mfn2cKO PN-இல் உள்ள ஐந்து மிக முக்கியமான மேல்-ஒழுங்குமுறை (சிவப்பு) மற்றும் கீழ்-ஒழுங்குமுறை (நீலம்) வழித்தடங்களைக் காட்டுகிறது. கண்டறியப்பட்ட ஒவ்வொரு புரதத்தின் சராசரி வெளிப்பாட்டு நிலை காட்டப்பட்டுள்ளது. சாம்பல்நிற வெப்ப வரைபடம்: சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பு. ns, முக்கியமற்றது.
புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுகள், காம்ப்ளக்ஸ் I, III, மற்றும் IV ஆகியவற்றின் புரத வெளிப்பாடு படிப்படியாகக் குறைந்ததைக் காட்டின. காம்ப்ளக்ஸ் I, III, மற்றும் IV ஆகிய அனைத்தும் அத்தியாவசியமான mtDNA-வால் குறியிடப்பட்ட துணை அலகுகளைக் கொண்டிருந்தன, அதேசமயம், அணுக்கருவால் மட்டுமே குறியிடப்பட்ட காம்ப்ளக்ஸ் II, அடிப்படையில் பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 2A மற்றும் படம் S2A). புரோட்டியோமிக்ஸ் முடிவுகளுக்கு இணங்க, சிறுமூளை திசுப் பிரிவுகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி, PN-இல் உள்ள காம்ப்ளக்ஸ் IV-இன் MTCO1 (மைட்டோகாண்ட்ரியல் சைட்டோக்ரோம் C ஆக்சிடேஸ் துணை அலகு 1) துணை அலகு நிலை படிப்படியாகக் குறைந்ததைக் காட்டியது (படம் 2B). mtDNA-வால் குறியிடப்பட்ட துணை அலகு Mtatp8 குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைக்கப்பட்டது (படம் S2A), அதேசமயம், அணுக்கருவால் குறியிடப்பட்ட ATP சின்தேஸ் துணை அலகின் நிலையான நிலை மாறாமல் இருந்தது, இது mtDNA வெளிப்பாடு நிலையாக இருக்கும்போது அறியப்பட்ட நிலையான ATP சின்தேஸ் துணைக்கூறு F1 காம்ப்ளக்ஸ் உருவாக்கத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. குறுக்கீடு (7). வரிசைப்படுத்தப்பட்ட Mfn2cKO PN-களில் நிகழ்நேர பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (qPCR) மூலம் mtDNA அளவை மதிப்பீடு செய்ததில், mtDNA நகல்களின் எண்ணிக்கை படிப்படியாகக் குறைவது உறுதி செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​8 வார வயதில், mtDNA அளவில் சுமார் 20% மட்டுமே தக்கவைக்கப்பட்டது (படம் 2C). இந்த முடிவுகளுக்கு இணங்க, DNA-வைக் கண்டறிய Mfn2cKO PN-களின் கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி சாயமேற்றல் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நியூக்ளியோடைடுகளின் நேரத்தைச் சார்ந்த நுகர்வைக் காட்டியது (படம் 2D). மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதச் சிதைவு மற்றும் அழுத்த எதிர்வினையில் ஈடுபட்டுள்ள Lonp1, Afg3l2 மற்றும் Clpx, மற்றும் OXPHOS சிக்கலான ஒருங்கிணைப்புக் காரணிகள் உள்ளிட்ட சில வேட்பாளர்கள் மட்டுமே அதிகமாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். அப்போப்டோசிஸில் ஈடுபட்டுள்ள புரதங்களின் அளவுகளில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை (படம் S2B). இதேபோல், கால்சியம் போக்குவரத்தில் ஈடுபட்டுள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியா மற்றும் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் கால்வாய்களில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S2C). கூடுதலாக, ஆட்டோஃபேஜி தொடர்பான புரதங்களின் மதிப்பீட்டில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் காணப்படவில்லை, இது இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி மற்றும் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் இன் விவோவில் காணப்பட்ட ஆட்டோஃபேகோசோம்களின் புலப்படும் தூண்டலுடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் S3). இருப்பினும், PN-களில் ஏற்படும் படிப்படியான OXPHOS செயலிழப்பு, தெளிவான மீநுண் கட்டமைப்பு மைட்டோகாண்ட்ரியல் மாற்றங்களுடன் சேர்ந்துள்ளது. 5 மற்றும் 8 வார வயதுடைய Mfn2cKO PN-களின் செல் உடல்கள் மற்றும் டென்டிரிடிக் மரங்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கொத்துக்களைக் காணலாம், மேலும் உள் சவ்வு அமைப்பு ஆழமான மாற்றங்களுக்கு உள்ளாகியுள்ளது (படம் S4, A மற்றும் B). இந்த மீநுண் கட்டமைப்பு மாற்றங்கள் மற்றும் mtDNA-வில் ஏற்பட்ட குறிப்பிடத்தக்க குறைவுக்கு இணங்க, டெட்ராமெதில்ரோடமைன் மெத்தில் எஸ்டர் (TMRM) கொண்டு செய்யப்பட்ட தீவிர பெருமூளை சிறுமூளைத் துண்டுகளின் பகுப்பாய்வில், Mfn2cKO PN-களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு மின்னழுத்தம் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைந்திருந்தது தெரியவந்தது (படம் S4C).
(A) OXPHOS தொகுப்பின் வெளிப்பாட்டு அளவின் காலப்போக்கு பகுப்பாய்வு. 8 வாரங்களில் P<0.05 உள்ள புரதங்களை மட்டும் கருத்தில் கொள்க (இருவழி ANOVA). புள்ளிக் கோடு: கட்டுப்பாட்டுடன் (CTRL) ஒப்பிடும்போது சரிசெய்தல் இல்லை. (B) இடது: ஆன்டி-MTCO1 ஆன்டிபாடியால் குறியிடப்பட்ட சிறுமூளைப் பகுதியின் ஒரு எடுத்துக்காட்டு (அளவுகோல், 20 μm). புர்கின்ஜே செல் உடல்கள் உள்ள பகுதி மஞ்சள் நிறத்தால் மூடப்பட்டுள்ளது. வலது: MTCO1 அளவுகளின் அளவு நிர்ணயம் (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; மூன்று எலிகளிலிருந்து பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட n = 7 முதல் 20 செல்கள்). (C) வரிசைப்படுத்தப்பட்ட PN-இல் உள்ள mtDNA நகல் எண்ணிக்கையின் qPCR பகுப்பாய்வு (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; n = 3 முதல் 7 எலிகள்). (D) இடது: ஆன்டி-DNA ஆன்டிபாடியால் குறியிடப்பட்ட சிறுமூளைத் துண்டின் ஒரு எடுத்துக்காட்டு (அளவுகோல், 20 μm). புர்கின்ஜே செல் உடல்கள் உள்ள பகுதி மஞ்சள் நிறத்தால் மூடப்பட்டுள்ளது. வலது: mtDNA பாதிப்புகளின் அளவீடு (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; மூன்று எலிகளிலிருந்து n = 5 முதல் 9 செல்கள்). (E) முழு-செல் பேட்ச் கிளாம்பிங் பதிவில் mitoYFP + புர்கின்ஜே செல்களை (அம்புக்குறி) காட்டும் ஒரு கூர்மையான சிறுமூளைப் பகுதியின் எடுத்துக்காட்டு. (F) IV வளைவின் அளவீடு. (G) CTRL மற்றும் Mfn2cKO புர்கின்ஜே செல்களில் டிபோலரைசிங் மின்னோட்ட உட்செலுத்தலின் பிரதிநிதித்துவப் பதிவுகள். மேல் தடயம்: AP-ஐத் தூண்டிய முதல் துடிப்பு. கீழ் தடயம்: அதிகபட்ச AP அதிர்வெண். (H) போஸ்ட்சினாப்டிக் தன்னிச்சையான உள்ளீடுகளின் (sPSPs) அளவீடு. பிரதிநிதித்துவப் பதிவுத் தடயமும் அதன் உருப்பெருக்க விகிதமும் (I)-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு மூன்று எலிகளிலிருந்து n = 5 முதல் 20 செல்களைப் பகுப்பாய்வு செய்தது. தரவுகள் சராசரி±SEM என வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) துளையிடப்பட்ட பேட்ச் கிளாம்பிங் பயன்முறையைப் பயன்படுத்திப் பதிவுசெய்யப்பட்ட தன்னிச்சையான AP-இன் பிரதிநிதித்துவத் தடயங்கள். மேல் தடயம்: அதிகபட்ச AP அதிர்வெண். கீழ் தடயம்: ஒரு தனி AP-இன் உருப்பெருக்கம். (K) (J)-இன் படி சராசரி மற்றும் அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணை அளவிடவும். மான்-விட்னி சோதனை; நான்கு எலிகளிலிருந்து n = 5 செல்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. தரவுகள் சராசரி±SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன; முக்கியமில்லை.
8 வார வயதுடைய Mfn2cKO PN-களில் தெளிவான OXPHOS பாதிப்பு கண்டறியப்பட்டது, இது நியூரான்களின் உடலியல் செயல்பாடு கடுமையாக இயல்புக்கு மாறாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது. எனவே, 4 முதல் 5 வாரங்கள் மற்றும் 7 முதல் 8 வாரங்களில், சிறுமூளையின் கூர்மையான துண்டுகளில் (படம் 2E) முழு-செல் பேட்ச் கிளாம்பிங் பதிவுகளை மேற்கொள்வதன் மூலம், OXPHOS குறைபாடுள்ள நியூரான்களின் செயலற்ற மின் பண்புகளை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். எதிர்பாராதவிதமாக, செல்களுக்கு இடையில் நுட்பமான வேறுபாடுகள் இருந்தபோதிலும் (அட்டவணை 1), Mfn2cKO நியூரான்களின் சராசரி ஓய்வு சவ்வு மின்னழுத்தம் மற்றும் உள்ளீட்டு மின்தடை ஆகியவை கட்டுப்பாட்டு நியூரான்களைப் போலவே இருந்தன. இதேபோல், 4 முதல் 5 வார வயதில், மின்னோட்டம்-மின்னழுத்த உறவில் (IV வளைவு) குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் காணப்படவில்லை (படம் 2F). இருப்பினும், 7 முதல் 8 வார வயதுடைய எந்த Mfn2cKO நியூரான்களும் IV சிகிச்சை முறையை (ஹைப்பர்போலரைசேஷன் படிநிலை) தாங்கவில்லை, இது இந்த பிந்தைய கட்டத்தில் ஹைப்பர்போலரைசேஷன் மின்னழுத்தத்திற்கு ஒரு தெளிவான உணர்திறன் இருப்பதைக் குறிக்கிறது. இதற்கு மாறாக, Mfn2cKO நியூரான்களில், தொடர்ச்சியான செயல் திறன் (AP) வெளியேற்றங்களை ஏற்படுத்தும் டிபோலரைசிங் மின்னோட்டங்கள் நன்கு பொறுத்துக்கொள்ளப்படுகின்றன, இது அவற்றின் ஒட்டுமொத்த வெளியேற்ற வடிவங்கள் 8 வார வயதுடைய கட்டுப்பாட்டு நியூரான்களிலிருந்து குறிப்பிடத்தக்க அளவு வேறுபடவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது (அட்டவணை 1 மற்றும் படம் 2G). இதேபோல், தன்னிச்சையான போஸ்ட்சினாப்டிக் மின்னோட்டங்களின் (sPSCs) அதிர்வெண் மற்றும் வீச்சு ஆகியவை கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடத்தக்கதாக இருந்தன, மேலும் நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண் 4 வாரங்களிலிருந்து 5 வாரங்கள், 7 வாரங்கள், 8 வாரங்கள் என இதேபோன்ற அதிகரிப்புடன் கூடியது (படம் 2, H மற்றும் I). PN-களில் சினாப்டிக் முதிர்ச்சியின் காலம் (25). துளையிடப்பட்ட PN பேட்ச்களுக்குப் பிறகும் இதேபோன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன. இந்த உள்ளமைவு, முழு-செல் பேட்ச் கிளாம்பிங் பதிவில் ஏற்படக்கூடியது போல, செல்லுலார் ATP குறைபாடுகளின் சாத்தியமான ஈடுபாட்டைத் தடுக்கிறது. குறிப்பாக, Mfn2cKO நியூரான்களின் ஓய்வு சவ்வு மின்னழுத்தம் மற்றும் தன்னிச்சையான ஃபயரிங் அதிர்வெண் பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 2, J மற்றும் K). சுருக்கமாக, இந்த முடிவுகள், தெளிவான OXPHOS செயலிழப்பு கொண்ட PN-கள் உயர் அதிர்வெண் வெளியேற்ற வடிவங்களை நன்கு சமாளிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன; இது, அவை ஏறக்குறைய இயல்பான மின் உடலியல் பதில்களைப் பராமரிக்க அனுமதிக்கும் ஒரு ஈடுசெய்யும் பொறிமுறை இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
தரவுகள் சராசரி ± SEM (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு, ஹோம்-சிடாக் பன்முக ஒப்பீட்டுச் சோதனை; *P<0.05) என வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. அலகு எண் அடைப்புக்குறிகளால் குறிக்கப்படுகிறது.
புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்பில் (படம் 1G) உள்ள ஏதேனும் ஒரு பிரிவில், கடுமையான OXPHOS குறைபாட்டை எதிர்கொள்ளக்கூடிய பாதைகள் உள்ளதா என்பதை ஆராய நாங்கள் தொடங்கினோம், இதன் மூலம் பாதிக்கப்பட்ட PN ஏன் கிட்டத்தட்ட இயல்பான எலக்ட்ரோபிசியாலஜியைப் பராமரிக்க முடியும் என்பதை விளக்கினோம் (படம் 2, E முதல் K வரை). புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வு, கிளைச் சங்கிலி அமினோ அமிலங்களின் (BCAA) சிதைமாற்றத்தில் ஈடுபட்டுள்ள நொதிகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்துள்ளன என்பதைக் காட்டியது (படம் 3A மற்றும் படம் S5A), மேலும் இறுதி விளைபொருளான அசிடைல்-CoA (CoA) அல்லது சக்சினைல் CoA, தமனித் தடிப்பு அமில (TCA) சுழற்சியில் டிரைகார்பாக்சிலேட்டுகளை நிரப்ப முடியும். BCAA டிரான்ஸ்அமினேஸ் 1 (BCAT1) மற்றும் BCAT2 ஆகிய இரண்டின் உள்ளடக்கமும் அதிகரித்திருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். அவை α-கீட்டோகுளூட்டரேட்டிலிருந்து குளூட்டமேட்டை உருவாக்குவதன் மூலம் BCAA சிதைமாற்றத்தின் முதல் படியை வினையூக்குகின்றன (26). கிளைச் சங்கிலி கீட்டோ அமில டீஹைட்ரோஜினேஸ் (BCKD) தொகுப்பை உருவாக்கும் அனைத்து துணை அலகுகளும் அதிகப்படுத்தப்படுகின்றன (இந்தத் தொகுப்பு, அதன் விளைவாக உருவாகும் BCAA கார்பன் கட்டமைப்பின் அடுத்தடுத்த மற்றும் மீளமுடியாத கார்பாக்சில் நீக்கத்தை வினையூக்குகிறது) (படம் 3A மற்றும் படம் S5A). இருப்பினும், வரிசைப்படுத்தப்பட்ட PN-களில் BCAA-வில் வெளிப்படையான மாற்றங்கள் எதுவும் காணப்படவில்லை, இது இந்த அத்தியாவசிய அமினோ அமிலங்களின் அதிகரித்த செல் உட்கொள்ளல் அல்லது TCA சுழற்சியை நிறைவு செய்ய மற்ற மூலங்களைப் (குளுக்கோஸ் அல்லது லாக்டிக் அமிலம்) பயன்படுத்துவதால் இருக்கலாம் (படம் S5B). OXPHOS இல்லாத PN-களும் 8 வார வயதில் அதிகரித்த குளுட்டமைன் சிதைவு மற்றும் டிரான்சமினேஷன் செயல்பாடுகளைக் காட்டின, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நொதிகளான குளுட்டமினேஸ் (GLS) மற்றும் குளுட்டமைன் பைருவேட் டிரான்சமினேஸ் 2 (GPT2) ஆகியவற்றின் அதிகப்படுத்தலால் பிரதிபலிக்கப்படுகிறது (படம் 3, A மற்றும் C). GLS இன் அதிகரிப்பு, பிணைக்கப்பட்ட ஐசோஃபார்ம் குளுட்டமினேஸ் C (GLS-GAC) க்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது (Mfn2cKO/CTRL இன் மாற்றம் தோராயமாக 4.5 மடங்கு, P = 0.05), மேலும் புற்றுநோய் திசுக்களில் அதன் குறிப்பிட்ட அதிகரிப்பு மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிர் ஆற்றலை ஆதரிக்க முடியும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. (27).
(A) வெப்ப வரைபடம், 8 வாரங்களில் குறிப்பிட்ட வழித்தடத்திற்கான புரத மட்டத்தில் ஏற்படும் மடங்கு மாற்றத்தைக் காட்டுகிறது. (B) ஆன்டி-PCx ஆன்டிபாடியால் குறியிடப்பட்ட சிறுமூளைத் துண்டின் எடுத்துக்காட்டு (அளவுகோல் பட்டை, 20 μm). மஞ்சள் அம்பு புர்கின்ஜே செல் உடலைச் சுட்டிக்காட்டுகிறது. (C) தமனித் தடிப்புக்கான ஒரு முக்கிய வேட்பாளராக அடையாளம் காணப்பட்ட புரத வெளிப்பாட்டின் காலப்போக்கு பகுப்பாய்வு (பல t-சோதனை, *FDR <5%; n = 3-5 எலிகள்). (D) மேலே: [1-13C]பைருவேட் தடயத்தில் உள்ள குறியிடப்பட்ட கார்பன் நுழைவதற்கான வெவ்வேறு வழிகளைக் காட்டும் ஒரு திட்ட வரைபடம் (அதாவது, PDH வழியாக அல்லது தமனிவழிப் பாதை). கீழே: வயலின் விளக்கப்படம், [1-13C]பைருவேட் கொண்டு சிறுமூளைத் துண்டுகளைக் குறியிட்ட பிறகு, ஒற்றைக் குறியிடப்பட்ட கார்பன் (M1) அஸ்பார்டிக் அமிலம், சிட்ரிக் அமிலம் மற்றும் மாலிக் அமிலமாக மாற்றப்பட்ட சதவீதத்தைக் காட்டுகிறது (இணை t-சோதனை; ** P <0.01). (E) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட பாதையின் விரிவான கால வரலாற்றுப் பகுப்பாய்வு. 8 வாரங்களில் P<0.05 எனும் மதிப்பைக் கொண்ட புரதங்களை மட்டும் கருத்தில் கொள்ளவும். புள்ளியிடப்பட்ட கோடு: சரிசெய்தல் மதிப்பு இல்லை (இருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; * P <0.05; *** P <0.001). தரவுகள் சராசரி±SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன.
எங்கள் பகுப்பாய்வில், BCAA சிதைமாற்றம் முக்கிய மேல்-ஒழுங்குபடுத்தல் பாதைகளில் ஒன்றாக மாறியுள்ளது. இந்த உண்மை, OXPHOS இல்லாத PN-களில் TCA சுழற்சிக்குள் நுழையும் காற்றோட்ட அளவு மாற்றப்படலாம் என்பதை வலுவாகக் குறிப்பிடுகிறது. இது நரம்பணு வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்பின் ஒரு முக்கிய வடிவத்தைக் குறிக்கலாம், இது கடுமையான OXPHOS செயலிழப்பைப் பராமரிக்கும் போது நரம்பணு உடலியல் மற்றும் உயிர்வாழ்வில் நேரடி தாக்கத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும். இந்தக் கருதுகோளுக்கு இணங்க, முக்கிய தமனித் தடிப்பு எதிர்ப்பு நொதியான PCx மேல்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (Mfn2cKO/CTRL தோராயமாக 1.5 மடங்கு மாறுகிறது; படம் 3A), இது பைருவேட்டை ஆக்சாலோஅசிட்டேட்டாக மாற்றும் வினையை ஊக்குவிக்கிறது (28), இது மூளை திசுக்களில் ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளுக்கு மட்டுமே கட்டுப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்பாட்டைக் கொண்டிருப்பதாக நம்பப்படுகிறது (29, 30). புரோட்டியோமிக்ஸ் முடிவுகளுக்கு இணங்க, கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி, OXPHOS-குறைபாடுள்ள PN-களில் PCx வெளிப்பாடு குறிப்பாகவும் கணிசமாகவும் அதிகரித்திருப்பதைக் காட்டியது, அதே நேரத்தில் PCx வினைத்திறன் கட்டுப்பாட்டு மாதிரியின் அருகிலுள்ள பெர்க்மேன் கிளியல் செல்களுக்கு மட்டுமே முக்கியமாகக் கட்டுப்படுத்தப்பட்டிருந்தது (படம் 3B). PCx-இன் காணப்பட்ட அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைச் செயல்பாட்டு ரீதியாகச் சோதிக்க, நாங்கள் சிறுமூளைத் துண்டுகளை [1-13C]பைருவேட் டிரேசர் கொண்டு பரிசோதித்தோம். பைருவேட், பைருவேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (PDH) மூலம் ஆக்ஸிஜனேற்றம் செய்யப்பட்டபோது, ​​அதன் ஐசோடோப் குறியீடு மறைந்துவிட்டது. ஆனால், பைருவேட் இரத்த நாள வினைகளால் வளர்சிதை மாற்றம் செய்யப்படும்போது, ​​அது TCA சுழற்சியின் இடைநிலைகளில் இணைக்கப்படுகிறது (படம் 3D). எங்கள் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுகளுக்கு ஆதரவாக, Mfn2cKO துண்டுகளின் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தில் இந்த டிரேசரிலிருந்து அதிக எண்ணிக்கையிலான குறிப்பான்களைக் கண்டோம். அதே சமயம், சிட்ரிக் அமிலம் மற்றும் மாலிக் அமிலம் ஆகியவை குறிப்பிடத்தக்கதாக இல்லாவிட்டாலும், ஒரு மிதமான போக்கைக் கொண்டிருந்தன (படம் 3D).
டோபமைன் நியூரான்கள் குறிப்பாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி A மரபணுவை (Tfam) அழிப்பதால் ஏற்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் கூடிய மிட்டோபார்க் எலிகளின் டோபமைன் நியூரான்களில் (படம் S6B), PCx வெளிப்பாடும் கணிசமாக அதிகரிக்கப்பட்டது (31). இது, உடலில் உள்ள நியூரான்களின் OXPHOS செயலிழப்பின் போது அசிட்டோன் அமில தமனி தடிப்பு நோய் ஏற்படுவது கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. தமனி தடிப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கக்கூடிய நியூரான்களில் வெளிப்படுத்தப்படக்கூடிய தனித்துவமான நொதிகள் (32-34), OXPHOS இல்லாத PN-களில் கணிசமாக அதிகரிக்கப்படுவது கண்டறியப்பட்டுள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. அவை, புரோபியோனைல்-CoA கார்பாக்சிலேஸ் (PCC-A), புரோபியோனைல்-CoA-வை சக்சினைல்-CoA-வாக மாற்றும் மலோனைல்-CoA, மற்றும் மாலேட்டிலிருந்து பைருவேட்டை மீட்டெடுப்பதே முக்கியப் பங்கு வகிக்கும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மாலிக் நொதி 3 (ME3) (படம் 3, A மற்றும் C) (33, 35) போன்றவை ஆகும். கூடுதலாக, PDH ஐ பாஸ்போரைலேட் செய்து செயலிழக்கச் செய்யும் Pdk3 நொதியில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் கண்டறிந்தோம் (36), அதே நேரத்தில் PDH ஐ செயல்படுத்தும் Pdp1 நொதியிலோ அல்லது PDH நொதி வளாகத்திலோ எந்த மாற்றங்களும் கண்டறியப்படவில்லை (படம் 3A). தொடர்ந்து, Mern2cKO PNs இல், PDH வளாகத்தின் பைருவேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் E1 கூறுகளின் Ser293 இல் உள்ள α1 துணை அலகு α (PDHE1α) துணை அலகின் பாஸ்போரைலேஷன் (PDH இன் நொதி செயல்பாட்டைத் தடுப்பதாக அறியப்படுகிறது) மேம்படுத்தப்பட்டது (படம் S6C). பைருவேட்டிற்கு வாஸ்குலர் அணுகல் இல்லை.
இறுதியாக, அறிக்கைகளின்படி, செயல்படுத்தும் செயல்பாட்டின் போது, ​​செரின் மற்றும் கிளைசின் உயிர் தொகுப்பின் சூப்பர் பாதை, தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஃபோலேட் (1C) சுழற்சி மற்றும் புரோலின் உயிர் தொகுப்பு (படம் 1G மற்றும் படம் S5C) அனைத்தும் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரிக்கின்றன என்பதைக் கண்டறிந்தோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் சுற்றியுள்ள திசுக்கள் செயல்படுத்தப்படுகின்றன (5-7). இந்த புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவை ஆதரிக்கும் கான்ஃபோகல் பகுப்பாய்வு, OXPHOS இல்லாத PN-இல், 8 வார வயதுடைய எலிகளின் சிறுமூளைத் துண்டுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஃபோலேட் சுழற்சியின் முக்கிய நொதியான செரின் ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் 2 (SHMT2)-க்கு உட்படுத்தப்பட்டபோது குறிப்பிடத்தக்க நோயெதிர்ப்புத் துலங்கலைக் காட்டியது (படம் S5D). 13 CU-குளுக்கோஸ்-அடைகாக்கப்பட்ட தீவிர சிறுமூளைத் துண்டுகளில், வளர்சிதை மாற்றத் தடமறிதல் சோதனைகள் செரின் மற்றும் புரோலின் உயிர் தொகுப்பின் அதிகரிப்பை மேலும் உறுதிப்படுத்தின, இது செரின் மற்றும் புரோலினுக்குள் கார்பன் ஐசோஃபார்ம்களின் பாய்வு அதிகரித்ததைக் குறிக்கிறது (படம் S5E). GLS மற்றும் GPT2 ஆல் ஊக்குவிக்கப்படும் வினைகள், குளுட்டமைனிலிருந்து குளுட்டமேட்டைத் தொகுப்பதற்கும், குளுட்டமேட்டிற்கும் α-கீட்டோகுளுட்டரேட்டிற்கும் இடையேயான டிரான்சமினேஷனுக்கும் காரணமாக இருப்பதால், அவற்றின் மிகை வெளிப்பாடு, OXPHOS குறைபாடுள்ள நியூரான்களுக்கு குளுட்டமேட்டின் தேவை அதிகரித்துள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. இது புரோலினின் அதிகரித்த உயிர் தொகுப்பைப் பராமரிப்பதை நோக்கமாகக் கொண்டிருக்கலாம் (படம் S5C). இந்த மாற்றங்களுக்கு மாறாக, PN-குறிப்பிட்ட Mfn2cKO எலிகளின் சிறுமூளை ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு, இந்த பாதைகள் (அனைத்து ஆன்டிபெராக்ஸிடேஸ்கள் உட்பட) வெளிப்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மாறவில்லை என்பதைக் காட்டியது, இதன் மூலம் இந்த வளர்சிதை மாற்றத் திசைமாற்றம் சிதைக்கப்பட்ட PN-க்கு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது என்பதை நிரூபிக்கிறது (படம் S6, D முதல் G வரை).
சுருக்கமாக, இந்த பகுப்பாய்வுகள் PN-களில் உள்ள குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பாதைகளின் தற்காலிக செயல்பாட்டின் கணிசமாக வேறுபட்ட வடிவங்களை வெளிப்படுத்தின. அசாதாரண நரம்பணு மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு ஆரம்பகால தமனித்தடிப்பு மற்றும் 1C மறுவடிவமைப்பிற்கு (படம் 3E மற்றும் படம் S5C) வழிவகுக்கும் என்றாலும், மேலும் I மற்றும் IV வளாகங்களின் வெளிப்பாட்டில் கணிக்கக்கூடிய மாற்றங்கள் ஏற்பட்டாலும், செரைனின் டி நோவோ தொகுப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் பிற்கால கட்டங்களில் மட்டுமே தெளிவாகத் தெரிந்தன. OXPHOS செயலிழப்பு (படம் 3E மற்றும் படம் S5C). இந்த கண்டுபிடிப்புகள் ஒரு தொடர்ச்சியான செயல்முறையை வரையறுக்கின்றன, இதில் மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் (1C சுழற்சி) மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் (செரைன் உயிர் தொகுப்பு) பதில், TCA சுழற்சியில் தமனித்தடிப்பு அதிகரிப்புடன் இணைந்து நரம்பணு வளர்சிதை மாற்றத்தை மறுவடிவமைக்கிறது.
8 வார வயதுடைய OXPHOS குறைபாடுள்ள PN-கள், உயர் அதிர்வெண் தூண்டல் செயல்பாட்டைத் தக்கவைத்துக் கொள்ளவும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை ஈடுசெய்ய குறிப்பிடத்தக்க வளர்சிதை மாற்ற மறுஇணைப்பிற்கு உள்ளாகின்றன. இந்தக் கண்டுபிடிப்பு, இந்தத் தருணத்தில் கூட, இந்த செல்கள் நரம்புச் சிதைவைத் தாமதப்படுத்த அல்லது தடுக்க சிகிச்சை தலையீட்டைப் பெறக்கூடும் என்ற ஒரு சுவாரஸ்யமான சாத்தியக்கூறை எழுப்புகிறது. இந்த சாத்தியக்கூறை நாங்கள் இரண்டு தனித்தனி தலையீடுகள் மூலம் தீர்த்தோம். முதல் முறையில், நாங்கள் ஒரு Cre-சார்ந்த அடினோ-அசோசியேட்டட் வைரஸ் (AAV) வெக்டரை வடிவமைத்தோம், இதன் மூலம் MFN2-ஐ உயிருள்ள OXPHOS குறைபாடுள்ள PN-களில் தேர்ந்தெடுத்து வெளிப்படுத்த முடியும் (படம் S7A). MFN2 மற்றும் ஒளிரும் ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவான mCherry-ஐ குறியீடாக்கும் AAV (Mfn2-AAV), ஆய்வகத்தில் முதன்மை நியூரான்களின் வளர்ப்பில் சரிபார்க்கப்பட்டது. இது MFN2-ஐ Cre-சார்ந்த முறையில் வெளிப்படுத்தச் செய்து, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவமைப்பை மீட்டெடுத்தது. இதன் மூலம் Mfn2cKO நியூரான்களில் நரம்புப் பிறழ்வு ஏற்படுவதைத் தடுத்தது (படம் S7, B, D மற்றும் E). அடுத்து, 8 வார வயதுடைய Mfn2-AAV-ஐ Mfn2cKO மற்றும் கட்டுப்பாட்டு எலிகளின் சிறுமூளைப் புறணிக்கு ஸ்டீரியோடாக்டிக்காக செலுத்துவதற்காக, நாங்கள் இன் விவோ சோதனைகளை நடத்தினோம், மேலும் 12 வார வயதுடைய எலிகளைப் பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 4A). சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட Mfn2cKO எலிகள் இறந்தன (படம் 1, A மற்றும் B) (16). இன் விவோவில் வைரஸ் டிரான்ஸ்டக்ஷன், சில சிறுமூளை வட்டங்களில் PN-இன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளிப்பாட்டிற்கு வழிவகுத்தது (படம் S7, G மற்றும் H). mCherry-ஐ மட்டும் வெளிப்படுத்தும் கட்டுப்பாட்டு AAV-ஐ (Ctrl-AAV) உட்செலுத்துவது, Mfn2cKO விலங்குகளில் நரம்புச் சிதைவின் அளவில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவை ஏற்படுத்தவில்லை. இதற்கு மாறாக, Mfn2-AAV-ஐக் கொண்டு டிரான்ஸ்டக்ஷன் செய்யப்பட்ட Mfn2cKO-க்களின் பகுப்பாய்வு, PN செல் அடுக்கின் குறிப்பிடத்தக்க பாதுகாப்பு விளைவைக் காட்டியது (படம் 4, B மற்றும் C). குறிப்பாக, நியூரான்களின் அடர்த்தி கட்டுப்பாட்டு விலங்குகளிலிருந்து கிட்டத்தட்ட வேறுபடுத்த முடியாததாகத் தெரிகிறது (படம் 4, B மற்றும் C, மற்றும் படம் S7, H மற்றும் I). MFN1-இன் வெளிப்பாடு, MFN2-இன் வெளிப்பாட்டைப் போலல்லாமல், நரம்பணு இறப்பைத் தடுப்பதில் சமமான செயல்திறன் கொண்டது (படம் 4C மற்றும் படம் S7, C மற்றும் F). இது, இடமாற்றப்பட்ட MFN1-இன் வெளிப்பாடு, MFN2-இன் பற்றாக்குறையைத் திறம்பட ஈடுசெய்ய முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. தனிப்பட்ட PN மட்டத்தில் செய்யப்பட்ட மேலதிக பகுப்பாய்வில், Mfn2-AAV ஆனது மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் மீநுண் கட்டமைப்பை பெருமளவில் மீட்டெடுத்தது, mtDNA அளவுகளை இயல்பாக்கியது, மற்றும் இரத்த நாள உருவாக்க எதிர்ப்பு குறிப்பானான PCx-இன் அதிக வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைத்தது (படம் 4, C முதல் E வரை) என்பது தெரியவந்தது. மீட்கப்பட்ட Mfn2cKO எலிகளை ஓய்வு நிலையில் கண்ணால் ஆய்வு செய்தபோது, ​​அவற்றின் உடல் தோரணை மற்றும் இயக்க அறிகுறிகள் (இயக்கம் S1 முதல் S3 வரை) மேம்பட்டிருந்தன என்பது தெரியவந்தது. முடிவாக, OXPHOS-இல் கடுமையாகப் பற்றாக்குறையுள்ள PN-களில் MFN2-ஐ தாமதமாக மீண்டும் அறிமுகப்படுத்துவது, mtDNA நுகர்வை மாற்றியமைக்கவும், தமனித் தடிப்பைத் தூண்டவும் போதுமானது என்பதை இந்த சோதனைகள் காட்டுகின்றன. இதன் மூலம், உயிருள்ள உயிரினங்களில் ஆக்சான் சிதைவு மற்றும் நரம்பணு இறப்பு தடுக்கப்படுகிறது.
(A) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பாதை செயல்படுத்தப்படும்போது, ​​MFN2-ஐ குறியீடாக்கும் AAV-ஐ உட்செலுத்துவதற்கான சோதனை அட்டவணையைக் காட்டும் ஒரு திட்டம். (B) Mfn2cKO எலிகளில் 8 வாரங்களில் மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்டு, ஆன்டி-கால்பிண்டின் ஆன்டிபாடியால் குறியிடப்பட்ட 12 வார வயதுடைய சிறுமூளைத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவ கான்ஃபோகல் படங்கள். வலது: ஆக்சான் இழைகளின் அளவிடுதல். ஆக்சான் உருப்பெருக்கத்தின் அளவு 450 மற்றும் 75 μm ஆகும். (C) இடது: AAV மரபணு மாற்ற வளையத்தில் (AAV+) புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தியின் அளவு நிர்ணயம் (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; n = 3 எலிகள்). வலது: 12-வது வாரத்தில் மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்ட PN-இல் mtDNA குவியப் பகுப்பாய்வு (இணைக்கப்படாத t-சோதனை; மூன்று எலிகளிலிருந்து n = 6 செல்கள்). * P <0.05; ** P <0.01. (D) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட வைரல் வெக்டர்களால் மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்ட Mfn2cKO சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் PN-களின் பிரதிநிதித்துவ டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள். இளஞ்சிவப்பு முகமூடியானது டென்ட்ரைட்டுகள் அமைந்துள்ள பகுதியைக் காட்டுகிறது, மேலும் மஞ்சள் புள்ளியிடப்பட்ட சதுரம் வலதுபுறத்தில் கொடுக்கப்பட்டுள்ள உருப்பெருக்கத்தைக் காட்டுகிறது; n என்பது உட்கருவைக் குறிக்கிறது. அளவுப் பட்டை, 1μm. (E) 12 வாரங்களில் மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்ட PN-இல் PCx சாயமேற்றத்தின் ஒரு உதாரணத்தைக் காட்டுகிறது. அளவுப் பட்டை, 20μm. OE, மிகை வெளிப்பாடு; FC, மடங்கு மாற்றம்.
இறுதியாக, OXPHOS செயலிழப்பை அனுபவித்த PN-களில் பெராக்ஸைடு-தூண்டப்பட்ட செல் உயிர்வாழ்வின் முக்கியத்துவத்தை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். எலியின் PCx mRNA-ஐ குறிப்பாக இலக்காகக் கொண்ட mCherry குறியாக்க AAV-shRNA-வை (குறுகிய ஹேர்பின் RNA) நாங்கள் உருவாக்கி (AAV-shPCx), அந்த வைரஸையோ அல்லது அதன் சீரற்ற கட்டுப்பாட்டையோ (AAV-scr) Mfn2cKO எலிகளின் சிறுமூளையில் செலுத்தினோம். PCx வெளிப்பாடு அதிகரித்திருந்த (படம் 3C) மற்றும் PN செல் அடுக்கு அப்படியே இருந்த (படம் 1A) காலகட்டத்தில், திறம்பட PCx வெளிப்பாட்டைக் குறைப்பதற்காக, இந்த ஊசி நான்காவது வார வயதில் செலுத்தப்பட்டது (படம் 5A). PCx வெளிப்பாட்டைக் குறைப்பது (படம் S8A), PN இறப்பை கணிசமாக விரைவுபடுத்துகிறது என்பதும், இந்த இறப்பு பாதிக்கப்பட்ட வளையத்திற்குள் மட்டுமே கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது (படம் 5, B மற்றும் C) என்பதும் குறிப்பிடத்தக்கது. PCx-ன் மேம்படுத்தப்பட்ட வெளிப்பாட்டினால் தூண்டப்படும் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகளின் வழிமுறையைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, குளுட்டாதயோனின் பெப்டைட் ரெடாக்ஸ் ஆற்றலில் ஏற்படும் சார்பு மாற்றத்தை மதிப்பிடுவதற்காக, PCx-ன் வெளிப்பாடு குறைக்கப்பட்ட பின்னரும், AAV-மூலம் ஒளியியல் உயிரி உணரியான Grx1-roGFP2 ஒரே நேரத்தில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட பின்னரும் PN-களின் ரெடாக்ஸ் நிலையை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம் (படம் S8, B முதல் D வரை) (38). பின்னர், FLIM நிபந்தனைகளைச் சரிபார்த்த பிறகு, சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரெடாக்ஸ் நிலையில் ஏற்படக்கூடிய மாற்றங்களைக் கண்டறிய, 7 வார வயதுடைய Mfn2cKO அல்லது கட்டுப்பாட்டு குட்டிச் சகோதரர்களின் கூர்மையான மூளைத் துண்டுகளில் இரு-ஃபோட்டான் ஃபுளோரசன்ஸ் ஆயுட்காலப் படமெடுப்பு நுண்ணோக்கியை (FLIM) நாங்கள் மேற்கொண்டோம் (படம் S8, E முதல் G வரை). இந்த பகுப்பாய்வு, PCx வெளிப்பாடு இல்லாத ஒரு தனிப்பட்ட Mfn2cKO PN-ன் ஆக்சிஜனேற்ற நிலையில் ஒரு குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் காட்டியது, இது கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள் அல்லது சீரற்ற shRNA-வை மட்டும் வெளிப்படுத்தும் Mfn2cKO PN-களிலிருந்து வேறுபட்டது (படம் 5, D மற்றும் E). PCx வெளிப்பாடு குறைக்கப்பட்டபோது, ​​அதிக ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட நிலையைக் காட்டும் Mfn2cKO PNs-களின் சதவீதம் மூன்று மடங்குக்கு மேல் அதிகரித்தது (படம் 5E), இது PCx-இன் அதிகரித்த வெளிப்பாடு சிதைந்த நியூரான்களின் ரெடாக்ஸ் திறனைப் பராமரித்தது என்பதைக் குறிக்கிறது.
(A) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பாதை செயல்படுத்தப்படும்போது shPCx-ஐ குறியீடாக்கும் AAV-ஐ உட்செலுத்துவதற்கான சோதனை அட்டவணையைக் காட்டும் ஒரு வரைபடம். (B) 4 வாரங்களில் ஆன்டி-கால்சினியூரின் ஆன்டிபாடியால் மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்டு குறியிடப்பட்ட Mfn2cKO எலிகளில் உள்ள 8 வார வயதுடைய சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ கான்ஃபோகல் புகைப்படங்கள். அளவுகோல் பட்டை, 450μm. (C) AAV-மரபணு மாற்றம் செய்யப்பட்ட வளையங்களில் புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தியின் அளவு நிர்ணயம் (ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு; n = 3 முதல் 4 எலிகள்). தரவுகள் சராசரி±SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன; ***P<0.001. (D) பிரதிநிதித்துவ FLIM படம், குறிப்பிட்ட சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் குளுட்டாதயோன் ரிடாக்ஸ் சென்சார் Grx1-roGFP2-ஐ வெளிப்படுத்தும் 7 வார வயதுடைய PN-இன் சராசரி ஆயுட்காலத்தைக் காட்டுகிறது. LUT (தேடல் அட்டவணை) விகிதம்: உயிர்வாழும் நேர இடைவெளி (பிகோநொடிகளில்). அளவுகோல் பட்டை, 25μm. (E) இந்த வரைபடம் (D)-இல் இருந்து பெறப்பட்ட Grx1-roGFP2 ஆயுட்கால மதிப்புகளின் பரவலைக் காட்டுகிறது (ஒவ்வொரு நிபந்தனையின் கீழும் இரண்டு எலிகளில் n=158 முதல் 368 செல்கள் வரை). ஒவ்வொரு வரைபடத்திற்கும் மேலே உள்ள வட்ட விளக்கப்படம்: CTRL-AAV-scr-இல் உள்ள சராசரி ஆயுட்கால மதிப்பின் 1 SD-ஐ விட அதிகமாக, குறிப்பிடத்தக்க அளவு நீண்ட (சிவப்பு, ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட) அல்லது குறுகிய (நீலம், குறைக்கப்பட்ட) ஆயுட்கால மதிப்புகளைக் கொண்ட செல்களின் எண்ணிக்கையைக் காட்டுகிறது. (F) முன்மொழியப்பட்ட மாதிரி, நரம்பியல் PCx-இன் மேம்படுத்தப்பட்ட வெளிப்பாட்டின் பாதுகாப்பு விளைவைக் காட்டுகிறது.
மொத்தத்தில், நாங்கள் இங்கு வழங்கும் தரவுகள், MFN2-இன் மறு வெளிப்பாடானது, கடுமையான OXPHOS குறைபாடு, கடுமையான mtDNA குறைவு மற்றும் மிகவும் அசாதாரணமான இஸ்டா போன்ற உருவமைப்பைக் கொண்ட முற்றிய PN-ஐ முழுமையாக மீட்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. இதன் மூலம், முற்றிய நோய்களிலும்கூட தொடர்ச்சியான முன்னேற்றத்தை வழங்குகிறது. நரம்புச் சிதைவானது, செல் இறப்பிற்கு முந்தைய நிலையின் மீளக்கூடிய சான்றை வழங்குகிறது. இந்த அளவிலான வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையானது, நரம்பணுக்கள் தமனித் தடிப்பைத் (TCA சுழற்சியின் மறுசீரமைப்பு) தூண்டும் திறனால் மேலும் வலியுறுத்தப்படுகிறது. இது OXPHOS இல்லாத PN-களில் PCx வெளிப்பாட்டைத் தடுத்து, செல் இறப்பை அதிகரிப்பதன் மூலம் ஒரு பாதுகாப்புப் பாத்திரத்தை வகிக்கிறது (படம் 5F).
இந்த ஆய்வில், வளர்சிதை மாற்றத் திட்டங்களால் செயல்படுத்தப்படும் வேறுபட்ட செயல்பாட்டுப் பாதை வழியாக, OXPHOS செயலிழப்புக்கு PN-களின் பதில் படிப்படியாக TCA சுழற்சி தமனித் தடிப்புக்கு இட்டுச் செல்கிறது என்பதற்கான ஆதாரத்தை நாங்கள் வழங்கினோம். பல நிரப்பு முறைகளைக் கொண்டு புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் கடுமையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பால் சவாலுக்குட்படுத்தப்படும்போது, ​​நியூரான்கள் முன்பு அறியப்படாத ஒரு வகையான வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதை வெளிப்படுத்தினோம். எங்களின் ஆச்சரியத்திற்கு, இந்த முழுமையான மறுசீரமைப்பு செயல்முறையானது, நரம்புச் சிதைவை படிப்படியாகவும் மீளமுடியாத வகையிலும் உடன்வரும் இறுதி வளர்சிதை மாற்ற நிலையைக் குறிக்க வேண்டிய அவசியமில்லை, ஆனால் செல் இறப்பிற்கு முந்தைய கட்டத்தில் கூட இது ஒரு பராமரிப்பு நியூரானின் செயல்பாட்டு ஈடுசெய்யும் பொறிமுறையாக இருக்கலாம் என்று எங்கள் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன. இந்த கண்டுபிடிப்பு, உடலில் நியூரான்கள் கணிசமான அளவு வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த உண்மை, MFN2-ஐ பின்னர் மீண்டும் அறிமுகப்படுத்துவது முக்கிய வளர்சிதை மாற்றக் குறிப்பான்களின் வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைத்து PN சிதைவைத் தடுக்க முடியும் என்பதை நிரூபிக்கிறது. மாறாக, இது தமனித் தடிப்பைத் தடுக்கிறது மற்றும் நரம்புகளை விரைவுபடுத்துகிறது.
எங்கள் ஆராய்ச்சியில் மிகவும் சுவாரஸ்யமான கண்டுபிடிப்புகளில் ஒன்று, OXPHOS இல்லாத PN-கள், தமனித் தடிப்பு நோயைத் தூண்டும் நொதிகளை அதிகரிப்பதன் மூலம் TCA சுழற்சி வளர்சிதை மாற்றத்தை மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதாகும். வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்பு என்பது புற்றுநோய் செல்களின் ஒரு பொதுவான அம்சமாகும், அவற்றில் சில, சுவாசச் சங்கிலியை இயக்கி, லிப்பிட் மற்றும் நியூக்ளியோடைடு உயிர் தொகுப்பு முன்னோடிகளின் உற்பத்தியைப் பராமரிக்கும் குறைக்கும் சமமானவற்றை உற்பத்தி செய்ய, TCA சுழற்சி இடைநிலைகளை நிரப்ப குளுட்டமைனைச் சார்ந்துள்ளன (39, 40). OXPHOS செயலிழப்பை அனுபவிக்கும் புற திசுக்களில், குளுட்டமைன்/குளுட்டமேட் வளர்சிதை மாற்றத்தின் மறு இணைப்பும் ஒரு முக்கிய அம்சமாகும் என்று ஒரு சமீபத்திய ஆய்வு காட்டியது (5, 41), அங்கு TCA சுழற்சியில் குளுட்டமைன் நுழைவின் திசையானது OXPHOS காயத்தின் தீவிரத்தைப் பொறுத்தது (41). இருப்பினும், உடலில் உள்ள நரம்பியல் வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையின் ஒற்றுமை மற்றும் நோய் சூழலில் அதன் சாத்தியமான தொடர்பு குறித்து தெளிவான சான்றுகள் இல்லை. சமீபத்திய இன் விட்ரோ ஆய்வில், முதன்மை கார்டிகல் நியூரான்கள் நரம்பியக்கடத்தலுக்காக குளுட்டமேட் குளங்களைத் திரட்டுவதாகக் காட்டப்பட்டது, இதன் மூலம் வளர்சிதை மாற்ற அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் தமனித் தடிப்பு ஆகியவற்றை ஊக்குவிக்கிறது (42). TCA சுழற்சி நொதியான சக்சினேட் டீஹைட்ரோஜினேஸின் மருந்தியல் தடுப்பின் கீழ், வளர்க்கப்பட்ட செரிபெல்லார் கிரானுல் நியூரான்களில் ஆக்சாலோஅசிட்டேட்டின் தொகுப்பை பைருவேட் கார்பாக்சிலேஷன் பராமரிப்பதாக நம்பப்படுகிறது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது (34). இருப்பினும், மூளை திசுக்களுக்கு இந்த வழிமுறைகளின் உடலியல் பொருத்தமானது (தமனித் தடிப்பு முக்கியமாக ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளுக்குள் மட்டுமே இருப்பதாக நம்பப்படுகிறது) இன்னும் முக்கியமான உடலியல் முக்கியத்துவத்தைக் கொண்டுள்ளது (43). இந்த விஷயத்தில், உடலில் OXPHOS ஆல் சேதமடைந்த PNs, BCAA சிதைவு மற்றும் பைருவேட் கார்பாக்சிலேஷனுக்கு மாற்றப்படலாம் என்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது, இவை TCA பூல் இடைநிலைகளின் நிரப்புதலின் இரண்டு முக்கிய ஆதாரங்களாகும். நரம்பணு ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்திற்கு BCAA சிதைமாற்றத்தின் பங்களிப்பு முன்மொழியப்பட்டிருந்தாலும், நரம்பியக்கடத்தலுக்கான குளுட்டமேட் மற்றும் GABAவின் பங்கிற்கு கூடுதலாக (44), இந்த வழிமுறைகளுக்கான எந்த ஆதாரமும் உயிருள்ள உயிரினங்களில் இன்னும் இல்லை. எனவே, செயலிழந்த PN-கள், தன்மயமாக்கல் செயல்முறையால் இயக்கப்படும் TCA இடைநிலைகளின் நுகர்வை, தமனித் தடிப்பு அதிகரிப்பதன் மூலம் தானாகவே ஈடுசெய்ய முடியும் என்று ஊகிக்க எளிதானது. குறிப்பாக, அஸ்பார்டிக் அமிலத்திற்கான அதிகரித்த தேவையை பராமரிக்க PCx-ன் மேம்பாடு தேவைப்படலாம், இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் பெருகும் செல்களில் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது (45). இருப்பினும், எங்கள் வளர்சிதைமாற்றவியல் பகுப்பாய்வு Mfn2cKO PN-களில் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தின் நிலையான அளவில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை வெளிப்படுத்தவில்லை (படம் S6A), இது பெருகும் செல்கள் மற்றும் பிந்தைய மைட்டோடிக் நியூரான்களுக்கு இடையில் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தின் வெவ்வேறு வளர்சிதை மாற்ற பயன்பாட்டை பிரதிபலிக்கிறது. உயிருள்ள நிலையில் செயலிழந்த நியூரான்களில் PCx அதிகரிப்பதற்கான சரியான வழிமுறை இன்னும் வகைப்படுத்தப்படவில்லை என்றாலும், இந்த முன்கூட்டிய பதில் நியூரான்களின் ரெடாக்ஸ் நிலையை பராமரிப்பதில் ஒரு முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபித்தோம், இது சிறுமூளை துண்டுகளில் FLIM சோதனைகளில் நிரூபிக்கப்பட்டது. குறிப்பாக, PNs PCx ஐ அதிகரிப்பதைத் தடுப்பது அதிக ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட நிலைக்கு வழிவகுத்து செல் இறப்பை துரிதப்படுத்தும். BCAA சிதைவு மற்றும் பைருவேட்டின் கார்பாக்சிலேஷன் ஆகியவை மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் புற திசுக்களை வகைப்படுத்துவதற்கான வழிகள் அல்ல (7). எனவே, அவை நரம்பு சிதைவுக்கு முக்கியமான ஒரே அம்சம் இல்லாவிட்டாலும், OXPHOS-குறைபாடுள்ள நியூரான்களின் முன்னுரிமை அம்சமாகத் தெரிகிறது.
செரிபெல்லார் நோய் என்பது ஒரு பன்முகத்தன்மை கொண்ட நரம்பு சிதைவு நோயாகும், இது பொதுவாக அட்டாக்ஸியாவாக வெளிப்படுகிறது மற்றும் பெரும்பாலும் PN-களை (46) சேதப்படுத்துகிறது. இந்த நியூரான்களின் தொகுப்பு மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கு குறிப்பாக பாதிக்கப்படக்கூடியது, ஏனெனில் எலிகளில் அவற்றின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட சிதைவு, மனித ஸ்பைனோசெரிபெல்லார் அட்டாக்ஸியாவின் சிறப்பியல்புடைய பல இயக்க அறிகுறிகளை மீண்டும் உருவாக்க போதுமானது (16, 47, 48). அறிக்கைகளின்படி, ஒரு பிறழ்ந்த மரபணுவைக் கொண்ட ஒரு டிரான்ஸ்ஜெனிக் எலி மாதிரி, மனித ஸ்பைனோசெரிபெல்லார் அட்டாக்ஸியாவுடன் தொடர்புடையது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பைக் கொண்டுள்ளது (49, 50), இது PNPH-இல் OXPHOS குறைபாட்டின் விளைவுகளைப் படிப்பதன் முக்கியத்துவத்தை வலியுறுத்துகிறது. எனவே, இந்த தனித்துவமான நியூரான்களின் தொகுப்பை திறம்பட தனிமைப்படுத்தி ஆய்வு செய்வது மிகவும் பொருத்தமானது. இருப்பினும், PN-கள் அழுத்தத்திற்கு மிகவும் உணர்திறன் கொண்டவை மற்றும் முழு செரிபெல்லார் செல் தொகுப்பிலும் குறைந்த விகிதத்தைக் கொண்டிருப்பதால், பல ஓமிக்ஸ் அடிப்படையிலான ஆய்வுகளுக்கு, அவற்றை முழு செல்களாகத் தேர்ந்தெடுத்துப் பிரிப்பது இன்னும் ஒரு சவாலான அம்சமாக உள்ளது. மற்ற செல் வகைகளின் (குறிப்பாக வயது வந்த திசுக்கள்) முழுமையான மாசுபடுதலைத் தவிர்ப்பது கிட்டத்தட்ட சாத்தியமற்றது என்றாலும், பிற்கால புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்விற்காக போதுமான எண்ணிக்கையிலான உயிருள்ள நியூரான்களைப் பெற, நாங்கள் ஒரு பயனுள்ள பிரித்தல் படியை FACS உடன் இணைத்தோம், மேலும் முழு சிறுமூளையின் தற்போதைய தரவுத் தொகுப்புடன் (51) ஒப்பிடும்போது மிகவும் அதிக புரதக் கவரேஜைக் (சுமார் 3000 புரதங்கள்) கொண்டுள்ளோம். முழு செல்களின் உயிர்வாழும் தன்மையைப் பாதுகாப்பதன் மூலம், நாங்கள் இங்கு வழங்கும் முறையானது மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் உள்ள வளர்சிதை மாற்றப் பாதைகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களைச் சரிபார்க்க மட்டுமல்லாமல், அதன் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பகுதிகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களையும் சரிபார்க்க அனுமதிக்கிறது. இது சிக்கலான திசுக்களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கையை அதிகரிக்க மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு குறிப்பான்களைப் பயன்படுத்துவதற்கு ஒரு புதிய முறையாகும் (52, 53). நாங்கள் விவரிக்கும் இந்த முறையானது புர்கின்ஜே செல்களின் ஆய்வுடன் தொடர்புடையது மட்டுமல்லாமல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் பிற மாதிரிகள் உட்பட, நோயுற்ற மூளைகளில் ஏற்படும் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களைக் கண்டறிய எந்த வகை செல்லுக்கும் எளிதாகப் பயன்படுத்தப்படலாம்.
இறுதியாக, இந்த வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்புச் செயல்பாட்டின் போது, ​​செல் அழுத்தத்தின் முக்கிய அறிகுறிகளை முழுமையாக மாற்றியமைத்து, நரம்பணுச் சிதைவைத் தடுக்கக்கூடிய ஒரு சிகிச்சைக்கான வாய்ப்பை நாங்கள் கண்டறிந்துள்ளோம். எனவே, இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ள இந்த மறுசீரமைப்பின் செயல்பாட்டு விளைவுகளைப் புரிந்துகொள்வது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் போது நரம்பணுக்களின் உயிர்வாழ்திறனைப் பராமரிப்பதற்கான சாத்தியமான சிகிச்சைகள் குறித்த அடிப்படைப் புரிதல்களை வழங்கக்கூடும். இந்தக் கோட்பாட்டை மற்ற நரம்பியல் நோய்களுக்கும் முழுமையாகப் பயன்படுத்த முடியுமா என்பதை வெளிப்படுத்த, பிற மூளை செல் வகைகளில் உள்ள ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களைப் பகுப்பாய்வு செய்வதை நோக்கமாகக் கொண்ட எதிர்கால ஆராய்ச்சி தேவைப்படுகிறது.
மிட்டோபார்க் எலிகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன (31). Mfn2 மரபணுக்களைச் சுற்றியுள்ள loxP கொண்ட C57BL/6N எலிகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டு (18) L7-Cre எலிகளுடன் கலப்பு செய்யப்பட்டன (23). இதன் விளைவாக உருவான இரட்டை ஹெட்டரோசைகஸ் சந்ததிகள், Mfn2-க்கான புர்கின்ஜே-குறிப்பிட்ட மரபணு நாக்அவுட்களை (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) உருவாக்க, ஹோமோசைகஸ் Mfn2loxP/Mfn2loxP எலிகளுடன் கலப்பு செய்யப்பட்டன. இனச்சேர்க்கையின் ஒரு துணைக்குழுவில், கூடுதல் கலப்புகள் மூலம் Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP அல்லீல் (stop-mtYFP) அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது (20). அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் ஐரோப்பிய, தேசிய மற்றும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன மற்றும் ஜெர்மனியின், வடக்கு ரைன்-வெஸ்ட்ஃபாலியாவில் உள்ள உம்வெல்ட் மற்றும் வெர்ப்ராச்சர்ஷுட்ஸின் லாண்டெசாம்ட்ஃபர்நேச்சுரால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன. விலங்குப் பணிகள் ஐரோப்பிய ஆய்வக விலங்கு அறிவியல் சங்கங்களின் கூட்டமைப்பின் வழிகாட்டுதலையும் பின்பற்றுகின்றன.
கர்ப்பிணிப் பெண்ணின் கர்ப்பப்பை வாய் இடப்பெயர்ச்சிக்கு மயக்க மருந்து கொடுத்த பிறகு, எலிக் கரு (E13) தனிமைப்படுத்தப்படுகிறது. புறணி, 10 mM ஹெப்ஸ் சேர்க்கப்பட்ட ஹாங்க்ஸ் சமநிலை உப்பு கரைசலில் (HBSS) துண்டாக்கப்பட்டு, பாப்பைன் (20 U/ml) மற்றும் சிஸ்டைன் (1μg/ml) கொண்ட டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்டது. திசுவை DMEM-ல் அடைகாத்து, நொதி செரிமானம் மூலம் சிதைக்கவும். 37°C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு அடைகாத்து, பின்னர் 10% கரு மாட்டு சீரம் சேர்க்கப்பட்ட DMEM-ல் இயந்திர முறையில் அரைக்கப்பட்டது. செல்கள், பாலிசிசைன் பூசப்பட்ட கண்ணாடி மூடிகளில், 6 செ.மீ வளர்ப்புத் தட்டில் 2×10⁶ என்ற அடர்த்தியிலோ அல்லது படமெடுப்பு பகுப்பாய்விற்காக 0.5×10⁵ செல்கள்/செ.மீ² என்ற அடர்த்தியிலோ விதைக்கப்பட்டன. 4 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, ஊடகமானது 1% B27 துணைப்பொருள் மற்றும் 0.5 mM குளுட்டாமேக்ஸ் கொண்ட நியூரோபேசல் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தால் மாற்றப்பட்டது. பின்னர், பரிசோதனை முழுவதும் நியூரான்கள் 37°C மற்றும் 5% CO2 இல் பராமரிக்கப்பட்டு, வாரத்திற்கு ஒரு முறை ஊட்டப்பட்டன. இன் விட்ரோவில் மறுசேர்க்கையைத் தூண்டுவதற்காக, இன் விட்ரோவில் இரண்டாம் நாளில் நியூரான்களுக்கு சிகிச்சையளிக்க, பின்வரும் AAV9 வைரஸ் வெக்டரின் 3μl (24-குழி வளர்ப்புத் தட்டு) அல்லது 0.5μl (24-குழித் தட்டு) பயன்படுத்தப்பட்டது: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, பட்டியல் எண் 105530-AAV9) மற்றும் AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, பட்டியல் எண் 105545-AAV9).
எலியின் Mfn1 மற்றும் Mfn2 நிரப்பு டி.என்.ஏ (முறையே Addgene பிளாஸ்மிட் #23212 மற்றும் #23213-இலிருந்து பெறப்பட்டவை) அவற்றின் C-முனையில் V5 வரிசை (GKPIPNPLLGLDST) கொண்டு குறிக்கப்பட்டு, T2A வரிசை வழியாக mCherry உடன் ஒரே வரிசையில் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. Grx1-roGFP2 என்பது ஹைடெல்பெர்க் TP டிக் DFKZ (ஜெர்மன் புற்றுநோய் ஆராய்ச்சி மையம்) வழங்கிய அன்பளிப்பாகும். வழக்கமான குளோனிங் முறைகளைப் பயன்படுத்தி tdTomato கேசட்டை மாற்றுவதன் மூலம், pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 மற்றும் pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 வெக்டர்களை உருவாக்குவதற்காக, அந்தக் கேசட் pAAV-CAG-FLEX-tdTomato பேக்போனில் (Addgene குறிப்பு எண் 28306) சப்-குளோன் செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டு வெக்டரான pAAV-CAG-FLEX-mCherry-ஐ உருவாக்கவும் இதே போன்ற ஒரு உத்தி பயன்படுத்தப்பட்டது. AAV-shPCx கட்டமைப்பை உருவாக்குவதற்கு, ஒரு பிளாஸ்மிட் AAV வெக்டர் (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) தேவைப்படுகிறது. இது, சுண்டெலியின் PCx-ஐ இலக்காகக் கொண்ட shRNA-வை (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) குறியாக்கம் செய்யும் DNA வரிசையைக் கொண்டுள்ளது. U6 புரோமோட்டரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் mCherry-யும், CMV புரோமோட்டரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் mCherry-யும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. துணை AAV வெக்டர்களின் உற்பத்தி, உற்பத்தியாளரின் (Cell Biolabs) அறிவுறுத்தல்களின்படி மேற்கொள்ளப்பட்டது. சுருக்கமாக, கால்சியம் பாஸ்பேட் முறையைப் பயன்படுத்தி, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) அல்லது Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) குறியீட்டு மரபணு, அத்துடன் AAV1 கேப்சிட் புரதம் மற்றும் துணைப் புரதத்தைக் குறியிடும் பேக்கேஜிங் பிளாஸ்மிட் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு டிரான்ஸ்ஃபர் பிளாஸ்மிடைப் பயன்படுத்தி 293AAV செல்களில் தற்காலிகமாக டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் செய்யவும். உலர் பனிக்கட்டி/எத்தனால் குளியலில் உறைதல்-உருகுதல் சுழற்சிகள் மூலம் கச்சா வைரஸ் சூப்பர்நேட்டன்ட் பெறப்பட்டது மற்றும் பாஸ்பேட் பஃபர்டு சலைன் (PBS) இல் செல்கள் சிதைக்கப்பட்டன. AAV வெக்டர், தொடர்ச்சியற்ற அயோடிக்ஸானால் கிரேடியன்ட் அல்ட்ராசென்ட்ரிஃபியூகேஷன் (24 மணிநேரம் 32,000 rpm மற்றும் 4°C) மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டு, அமிகான் அல்ட்ரா-15 சென்ட்ரிஃபியூகல் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி அடர்த்தியாக்கப்பட்டது. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×10¹³ ஜீனோம் நகல் (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ஆகியவற்றின் ஜீனோம் டைட்டர் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி (54), நிகழ்நேர அளவுசார் PCR (qPCR) மூலம் அளவிடப்பட்டது -MFN1-V5 (1.9×10¹³ GC/ml) மற்றும் AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×10¹² GC/ml).
முதன்மை நியூரான்கள் பனிக்கட்டி குளிர்ச்சியான 1x PBS-இல் சுரண்டப்பட்டு, திரட்டப்பட்டு, பின்னர் பாஸ்படேஸ் மற்றும் புரோட்டியேஸ் தடுப்பான் (ரோச்) கொண்ட 0.5% டிரைட்டான் X-100 / 0.5% சோடியம் டியோக்ஸிகோலேட்/PBS லைசிஸ் பஃபரில் ஒருபடித்தாக்கப்பட்டது. புரதத்தின் அளவு பைசின்சோனிக் அமில மதிப்பீட்டை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. பின்னர் புரதங்கள் SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோஃபோரெசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்பட்டு, ஒரு பாலிவினைலிடீன் ஃபுளோரைடு சவ்வில் (GE ஹெல்த்கேர்) ஒட்டப்பட்டது. குறிப்பிட்டல்லாத தளங்களைத் தடுத்து, முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (விவரங்களுக்கு அட்டவணை S1-ஐப் பார்க்கவும்) TBST-இல் (ட்வீனுடன் கூடிய டிரிஸ்-பஃபர்டு சலைன்) 5% பாலில் அடைகாக்கவும், கழுவும் படிகள் மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் TBST-இல் அடைகாக்கவும். +4°C-இல் இரவு முழுவதும் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கவும். கழுவிய பிறகு, அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தவும். அதைத் தொடர்ந்து, அதே பிளாட்டை ஒரு ஆன்டி-β-ஆக்டின் ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாப்பதன் மூலம், அதே ஏற்றுதல் உறுதி செய்யப்பட்டது. வேதி ஒளிர்தலாக மாற்றுவதன் மூலமும் வேதி ஒளிர்தலை மேம்படுத்துவதன் மூலமும் கண்டறிதல் (ஜிஇ ஹெல்த்கேர்).
முன்னதாக கண்ணாடி மூடிச்சறுக்குகளில் பதியப்பட்ட நரம்பணுக்கள், குறிப்பிட்ட நேரத்தில் அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 4% பாராஃபார்மால்டிஹைடு (PFA)/PBS கொண்டு நிலைப்படுத்தப்பட்டன. அந்த மூடிச்சறுக்குகள் முதலில் அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு 0.1% டிரைட்டான் X-100/PBS கொண்டு ஊடுருவச் செய்யப்பட்டு, பின்னர் தடுப்பு இடையகத்தில் [3% போவின் சீரம் அல்புமின் (BSA)/PBS] வைக்கப்பட்டன. இரண்டாம் நாளில், மூடிச்சறுக்குகள் தடுப்பு இடையகத்தால் கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரத்திற்கு பொருத்தமான ஃபுளோரோஃபோர்-இணைக்கப்பட்ட இரண்டாம் நிலை எதிர்ப்பொருளுடன் அடைகாக்கப்பட்டன; இறுதியாக, மாதிரிகள் PBS-இல் முழுமையாகக் கழுவப்பட்டு, 4′,6-டயமிடினோ-2-ஃபினைல்இண்டோல் (DAPI) கொண்டு எதிர்சாயமிடப்பட்டு, பின்னர் அக்வா-பாலி/மவுண்ட் கொண்டு நுண்ணோக்கிச் சறுக்கியில் நிலைப்படுத்தப்பட்டன.
ஆண் மற்றும் பெண் எலிகளுக்கு, கெட்டமைன் (130 மி.கி/கி) மற்றும் சைலாசின் (10 மி.கி/கி) ஆகியவை வயிற்றுக்குள்ளான ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டு மயக்கமளிக்கப்பட்டது. மேலும், கார்ப்ரோஃபென் வலி நிவாரணி (5 மி.கி/கி) தோலடி வழியாகக் கொடுக்கப்பட்டு, சூடான திண்டு பொருத்தப்பட்ட ஸ்டீரியோடாக்டிக் கருவியில் (கோப்) வைக்கப்பட்டன. மண்டை ஓட்டை வெளிப்படுத்தி, பல் துரப்பணத்தைப் பயன்படுத்தி, மிஸ் எலும்புக்கு (லாம்டாவிலிருந்து: வால் 1.8, பக்கவாட்டு 1, இது லோபியூல்கள் IV மற்றும் V-க்கு ஒத்திருக்கிறது) இணையான சிறுமூளைப் புறணியின் பகுதியை மெல்லியதாக்கவும். கீழே உள்ள இரத்த நாளங்களுக்கு இடையூறு ஏற்படாதவாறு, வளைந்த சிரிஞ்ச் ஊசியைப் பயன்படுத்தி மண்டை ஓட்டில் கவனமாக ஒரு சிறிய துளையை உருவாக்கவும். பின்னர், மெல்லியதாக வரையப்பட்ட கண்ணாடி நுண்குழாய், டியூரா மேட்டரின் வயிற்றுப் பக்கத்தில் உள்ள நுண் துளைக்குள் (-1.3 முதல் -1 வரை) மெதுவாகச் செருகப்படுகிறது. பின்னர், 200 முதல் 300 நானோலிட்டர் AAV, 10 முதல் 20 நிமிட கால இடைவெளியில், குறைந்த அழுத்தத்தில் பலமுறை, கையால் இயக்கப்படும் சிரிஞ்சுகள் (நரிஷிகே) மூலம் நுண்-செலுத்திக்குள் (நரிஷிகே) உட்செலுத்தப்படுகிறது. உட்செலுத்தலுக்குப் பிறகு, வைரஸ் முழுமையாகப் பரவுவதற்கு ஏதுவாக, நுண்குழாயை மேலும் 10 நிமிடங்களுக்கு அப்படியே வைக்கவும். நுண்குழாய்கள் வெளியே எடுக்கப்பட்ட பிறகு, காயத்தின் வீக்கத்தைக் குறைக்கவும், விலங்கு குணமடையவும் ஏதுவாக, தோல் கவனமாகத் தைக்கப்படுகிறது. அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு பல நாட்களுக்கு விலங்குகளுக்கு வலி நிவாரணிகள் (காஸ்போஃபென்) கொடுக்கப்பட்டன. அந்தக் காலகட்டத்தில் அவற்றின் உடல்நிலை கவனமாகக் கண்காணிக்கப்பட்டு, பின்னர் குறிப்பிட்ட நேரத்தில் அவை கருணைக் கொலை செய்யப்பட்டன. அனைத்து நடைமுறைகளும் ஐரோப்பிய, தேசிய மற்றும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களுக்கு இணங்க மேற்கொள்ளப்பட்டு, ஜெர்மனியின் வடக்கு ரைன்-வெஸ்ட்பாலியாவில் உள்ள சுற்றுச்சூழல் மற்றும் நுகர்வோர் பாதுகாப்புக்கான இயற்கை அரசாங்க அலுவலகத்தால் (LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz) அங்கீகரிக்கப்பட்டன.
விலங்குகளுக்கு கெட்டமைன் (100 மி.கி/கி.கி) மற்றும் சைலாசின் (10 மி.கி/கி.கி) மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது, மேலும் இதயம் முதலில் 0.1 M PBS மற்றும் பின்னர் PBS-இல் 4% PFA கொண்டு ஊடுருவப்பட்டது. திசு துண்டாக்கப்பட்டு 4°C வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் 4% PFA/PBS-இல் நிலைப்படுத்தப்பட்டது. PBS-இல் நிலைப்படுத்தப்பட்ட மூளையிலிருந்து சஜிடல் பிரிவுகளை (50 μm தடிமன்) தயாரிக்க ஒரு அதிர்வு கத்தி (Leica Microsystems GmbH, வியன்னா, ஆஸ்திரியா) பயன்படுத்தப்பட்டது. வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், அறை வெப்பநிலையில் மற்றும் கிளறலுடன், மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி (13) ஃப்ரீ-ஃப்ளோட்டிங் பிரிவுகளுக்கு சாயம் பூசுதல் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, முதலில், பெறப்பட்ட துண்டுகள் அறை வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 0.5% டிரைட்டன் X-100/PBS கொண்டு ஊடுருவச் செய்யப்பட்டன; சில எபிடோப்புகளுக்கு (Pcx மற்றும் Shmt2), இந்த படிக்கு பதிலாக 80°C (PH 9) வெப்பநிலையில் டிரிஸ்-EDTA இடையகத்தில் துண்டுகளை 25 நிமிடங்கள் சூடுபடுத்துவதன் மூலம். அடுத்து, அந்தப் பிரிவுகள் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (அட்டவணை S1-ஐப் பார்க்கவும்) தடுப்பு இடையகத்தில் (3% BSA/PBS) 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் கிளறலுடன் அடைகாக்கப்பட்டன. அடுத்த நாள், அந்தப் பிரிவுகள் தடுப்பு இடையகத்தால் கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் பொருத்தமான ஃபுளோரோஃபோர்-இணைக்கப்பட்ட இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கப்பட்டன; இறுதியாக, அந்தப் பிரிவுகள் PBS-இல் நன்கு கழுவப்பட்டு, DAPI-ஆல் எதிர்-சாயமிடப்பட்டு, பின்னர் ஒரு நுண்ணோக்கி ஸ்லைடில் அக்வாபாலிமவுண்ட் கொண்டு நிலைநிறுத்தப்பட்டன.
மாதிரியைப் படம்பிடிக்க, ஒரு வெள்ளை ஒளி லேசர் மற்றும் 405 டையோடு புற ஊதா லேசர் பொருத்தப்பட்ட லேசர் ஸ்கேனிங் கான்கோகல் நுண்ணோக்கி (TCS SP8-X அல்லது TCS டிஜிட்டல் லைட் ஷீட், லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஃபுளோரோஃபோரைத் தூண்டி, ஹைப்ரிட் டிடெக்டர் (HyDs) மூலம் சிக்னலைச் சேகரிப்பதன் மூலம், தொடர் முறையில் நைக்விஸ்ட் மாதிரியெடுப்பிற்கு இணங்க அடுக்கப்பட்ட படங்களைச் சேகரிக்க LAS-X மென்பொருள் பயன்படுத்தப்பட்டது: அளவுசாரா பேனல்களுக்கு, இது மிகவும் டைனமிக் சிக்னல்களாகும் (உதாரணமாக, சோமாடிக் செல்கள் மற்றும் டென்ட்ரைட்டுகளில்). பிரைட்R பயன்முறையில் PN-களின் எண்ணிக்கையைக் கண்டறிய HyD-ஐப் பயன்படுத்தவும். பின்னணியைக் குறைக்க 0.3 முதல் 6 ns வரை கேட்டிங் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
வரிசைப்படுத்தப்பட்ட செல்களின் நிகழ்நேரப் படமெடுத்தல். 1% B27 துணைப்பொருள் மற்றும் 0.5 mM குளுட்டாமேக்ஸ் கொண்ட நியூரோபேசல்-ஏ ஊடகத்தில் வரிசைப்படுத்திய பிறகு, செல்கள் உடனடியாக பாலி-எல்-லைசின் பூசப்பட்ட கண்ணாடி ஸ்லைடுகளில் (μ-ஸ்லைடு8 வெல், ஐபிடி, பட்டியல் எண் 80826) இடப்பட்டன. பின்னர், செல்கள் நிலைபெறுவதற்காக, அவை 37°C வெப்பநிலையிலும் 5% CO2 சூழலிலும் 1 மணி நேரம் வைக்கப்பட்டன. நிகழ்நேரப் படமெடுத்தல், ஒரு வெள்ளை லேசர், HyD, 63×[1.4 நியூமெரிக்கல் அபெர்ச்சர் (NA)] ஆயில் ஆப்ஜெக்டிவ் லென்ஸ் மற்றும் ஒரு வெப்பமூட்டும் மேடை ஆகியவற்றைக் கொண்ட லெய்கா SP8 லேசர் ஸ்கேனிங் கான்கோகல் நுண்ணோக்கியில் நிகழ்த்தப்பட்டது.
எலிக்கு கார்பன் டை ஆக்சைடு மூலம் விரைவாக மயக்கமளிக்கப்பட்டு, அதன் தலை துண்டிக்கப்பட்டது. மண்டையோட்டிலிருந்து மூளை விரைவாக அகற்றப்பட்டு, பின்வரும் பொருட்களால் நிரப்பப்பட்ட 200μm தடிமன் (13C குறியிடல் சோதனைக்காக) அல்லது 275μm தடிமன் (இரு ஃபோட்டான் சோதனைகளுக்காக) கொண்ட சஜிடல் வெட்டுத் துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டது. ஐஸ்கிரீம் (HM-650 V, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்டோர்ஃப், ஜெர்மனி) பின்வரும் பொருட்களால் நிரப்பப்பட்டுள்ளது: 125 mM பனிக்கட்டி போன்ற குளிர்ச்சியான, கார்பன் செறிவூட்டப்பட்ட (95% O2 மற்றும் 5% CO2) குறைந்த Ca2+ செயற்கை மூளைத்தண்டுவட திரவம் (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசல், 25 mM NaHCO3, 25 mM குளுக்கோஸ், 0.5 mM CaCl2 மற்றும் 3.5 mM MgCl2 (சவ்வூடுபரவல் அழுத்தம் 310 முதல் 330 mmol). பெறப்பட்ட மூளைத் துண்டுகளை, அதிக Ca2+ ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 2.0 mM MgCl2) ஊடகம்) pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mmol) கொண்ட ஒரு முன்-அடைகாப்பு அறைக்கு மாற்றவும்.
பிம்பமாக்கும் செயல்முறையின் போது, ​​துண்டுகள் ஒரு பிரத்யேக பிம்பமாக்கும் அறைக்கு நகர்த்தப்பட்டன, மேலும் 32° முதல் 33°C வரையிலான நிலையான வெப்பநிலையில் தொடர்ச்சியான ACSF பாய்ச்சலின் கீழ் பரிசோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது. துண்டுகளைப் பிம்பமாக்குவதற்கு, லைக்கா 25x புறவில்லை (NA 0.95, நீர்), Ti: சபையர் லேசர் (Chameleon Vision II, Coherent) ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு மல்டிபோட்டான் லேசர் ஸ்கேனிங் நுண்ணோக்கி (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) பயன்படுத்தப்பட்டது. FLIM தொகுதி (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-இன் FLIM. PN-களின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரெடாக்ஸ் நிலையில் ஏற்படும் மாற்றங்கள், சஜிடல் மூளைத் துண்டுகளில் டூ-போட்டான் FLIM மூலம் அளவிடப்பட்டன; இதில் Grx1-roGFP2 பயோசென்சார் PN-களை இலக்காகக் கொண்டது. PN அடுக்கில், துண்டின் மேற்பரப்பிலிருந்து சுமார் 50 முதல் 80 μm கீழே படமெடுக்கும் புலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. இதன் மூலம், அங்கு ஒரு செயல்படக்கூடிய PN இருப்பதையும் (அதாவது, டென்ட்ரைட்டுகளில் மணிகள் போன்ற அமைப்பு அல்லது நரம்பணு உருவவியல் மாற்றங்கள் இல்லாதிருத்தல்), இரட்டை நேர்மறை roGFP2 சென்சார் மற்றும் shRNA PCx அல்லது அதன் கட்டுப்பாட்டு வரிசையைக் குறியாக்கம் செய்யும் AAV (ஒவ்வொன்றும் mCherry-ஐ ஒருசேர வெளிப்படுத்துதல்) இருப்பதையும் உறுதிசெய்யப்பட்டது. 2x டிஜிட்டல் ஜூம் மூலம் ஒற்றை-அடுக்கு படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன [கிளர்வு அலைநீளம்: 890 nm; 512 nm 512 பிக்சல்கள்]. கண்டறிதல்: வளைவுப் பொருத்தத்திற்குத் தேவையான ஃபோட்டான்கள் (மொத்தம் 1000 ஃபோட்டான்கள்) சேகரிக்கப்படுவதை உறுதிசெய்ய, உள் HyD, ஃபுளோரசெய்ன் ஐசோதியோசயனேட் (FITC) வடிகட்டித் தொகுதி மற்றும் 2 முதல் 3 நிமிடங்களுக்குள் படச் சராசரியாக்கம் ஆகியவை பயன்படுத்தப்படுகின்றன. Grx1-roGFP2 ஆய்வுக்கருவியின் உணர்திறன் மற்றும் FLIM நிபந்தனைகளின் சரிபார்ப்பு ஆகியவை, பாய்ச்சல் ACSF-இல் புறவழியாக 10 mM H2O2-ஐச் சேர்க்கும்போது (ஆக்சிஜனேற்றத்தை அதிகப்படுத்தி, அதன் விளைவாக ஆயுட்காலத்தை அதிகரிக்க), பின்னர் 2 mM டைதியோதிரெயிட்டோலைச் சேர்க்கும்போது (ஒடுக்கத்தின் அளவைக் குறைத்து, ஆயுட்காலத்தைக் குறைக்க) roGFP2-இன் ஆயுட்கால மதிப்பைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் செய்யப்பட்டன (படம் S8, D முதல் G வரை). பெறப்பட்ட முடிவுகளைப் பகுப்பாய்வு செய்ய FLIMfit 5.1.1 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி, முழுப் படத்தின் ஒற்றை எக்ஸ்போனென்ஷியல் சிதைவு வளைவை அளவிடப்பட்ட IRF (கருவி மறுமொழிச் செயல்பாடு) உடன் பொருத்தவும், மேலும் χ2 தோராயமாக 1 ஆகும். ஒரு தனிப்பட்ட PN-இன் ஆயுட்காலத்தைக் கணக்கிட, நரம்பு உடலைச் சுற்றியுள்ள மாஸ்க் கைமுறையாக வரையப்பட்டது, மேலும் அளவீட்டிற்காக ஒவ்வொரு மாஸ்கிலும் உள்ள சராசரி ஆயுட்காலம் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆற்றல் பகுப்பாய்வு. உட்செலுத்தப்பட்ட ACSF-இல் நேரடியாகச் சேர்க்கப்பட்ட 100 nM TMRM உடன் கூர்முனைப் பிரிவு 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்ட பிறகு, PN-களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆற்றல் மாற்றங்கள் இரு-ஃபோட்டான் நுண்ணோக்கி மூலம் அளவிடப்பட்டன. TMRM படமெடுத்தல், 920 nm-இல் ஆய்வுக் கருவியைத் தூண்டி, சமிக்ஞைகளைச் சேகரிக்க உள் HyD-ஐ (டெட்ராமெதில்ரோடமைன் ஐசோதியோசயனேட்: 585/40 nm) பயன்படுத்துவதன் மூலமும்; அதே தூண்டல் அலைநீளத்தைப் பயன்படுத்தி, ஆனால் mtYFP-ஐப் படமெடுக்க வேறுபட்ட உள் HyD-ஐ (FITC: 525/50) பயன்படுத்துவதன் மூலமும் செய்யப்பட்டது. ஒற்றை செல் மட்டத்தில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆற்றலை மதிப்பிடுவதற்கு ImageJ-இன் இமேஜ் கால்குலேட்டர் செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தவும். சுருக்கமாக, தொடர்புடைய சேனலின் ஒற்றை-அடுக்கு கான்ஃபோகல் படத்தில் புர்கின்ஜே சோமாலியில் TMRM சமிக்ஞையைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியைக் கண்டறிய, செருகுநிரல் சமன்பாடு: signal = min (mtYFP, TMRM) பயன்படுத்தப்படுகிறது. பின்னர், அதன் விளைவாகக் கிடைக்கும் மாஸ்க்கில் உள்ள பிக்சல் பகுதி அளவிடப்பட்டு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆற்றலைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பின்னத்தைப் பெறுவதற்காக, mtYFP சேனலின் தொடர்புடைய த்ரெஷோல்ட் சிங்கிள்-ஸ்டாக் படத்தில் அது இயல்பாக்கப்படுகிறது.
படம், ஹுய்ஜென்ஸ் புரோ (அறிவியல் கன அளவு படமாக்கல்) மென்பொருளைக் கொண்டு டீகன்வல்யூட் செய்யப்பட்டது. டைல்களின் ஸ்கேன் செய்யப்பட்ட படங்களுக்கு, LAS-X மென்பொருள் வழங்கும் தானியங்கி ஸ்டிச்சிங் அல்காரிதத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு தனி டைலின் மாண்டேஜ் செய்யப்படுகிறது. பட அளவுத்திருத்தத்திற்குப் பிறகு, படத்தை மேலும் செயலாக்கவும், பிரகாசம் மற்றும் மாறுபாட்டைச் சீராகச் சரிசெய்யவும் ImageJ மற்றும் அடோப் போட்டோஷாப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. வரைகலைத் தயாரிப்பிற்கு அடோப் இல்லஸ்ட்ரேட்டர் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
mtDNA குவியப் பகுப்பாய்வு. கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி, டிஎன்ஏ-க்கு எதிரான ஆன்டிபாடிகள் கொண்டு குறியிடப்பட்ட சிறுமூளைப் பிரிவுகளில் mtDNA பாதிப்புகளின் எண்ணிக்கை அளவிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு செல்லின் செல் உடல் மற்றும் உட்கருவிற்காக ஒவ்வொரு இலக்குப் பகுதியும் உருவாக்கப்பட்டது, மேலும் அந்தந்தப் பகுதி மல்டி மெஷர் செருகுநிரலைப் (ImageJ மென்பொருள்) பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது. சைட்டோபிளாஸ்மிக் பகுதியைப் பெற, செல் உடல் பகுதியிலிருந்து உட்கருப் பகுதி கழிக்கப்பட்டது. இறுதியாக, வரம்புப் படத்தில் mtDNA-வைக் குறிக்கும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் டிஎன்ஏ புள்ளிகளைத் தானாகவே அளவிட அனலைஸ் பார்ட்டிகிள்ஸ் செருகுநிரல் (ImageJ மென்பொருள்) பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் பெறப்பட்ட முடிவுகள் CTRL எலிகளின் PN சராசரிக்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. முடிவுகள் ஒரு செல்லுக்குரிய சராசரி நியூக்ளியோசைடுகளின் எண்ணிக்கையாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன.
புரத வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்வு. PN-இல் ஒற்றைச் செல் மட்டத்தில் புரத வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடுவதற்கு ImageJ-இன் Image Calculator செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தவும். சுருக்கமாக, தொடர்புடைய சேனலின் ஒற்றை-அடுக்கு கான்ஃபோகல் படத்தில், signal = min (mtYFP, antibody) என்ற சமன்பாட்டின் மூலம், Purkina-வில் ஒரு குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிக்கு நோயெதிர்ப்பு வினைத்திறனைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதி அடையாளம் காணப்படுகிறது. பின்னர், அதன் விளைவாக வரும் மாஸ்க்கில் உள்ள பிக்சல் பகுதி அளவிடப்பட்டு, காட்டப்படும் புரதத்தின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பின்னத்தைப் பெறுவதற்காக, mtYFP சேனலின் தொடர்புடைய வரம்பு ஒற்றை-அடுக்கு படத்தில் இயல்பாக்கப்படுகிறது.
புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தி பகுப்பாய்வு. எண்ணப்பட்ட புர்கின்ஜே செல்களின் எண்ணிக்கையை, அந்த செல்கள் அமைந்துள்ள சிறுமூளை வளையத்தின் நீளத்தால் வகுப்பதன் மூலம் புர்கின்ஜே அடர்த்தியை மதிப்பிடுவதற்கு, ImageJ-இன் செல் கவுண்டர் செருகுநிரல் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மாதிரி தயாரிப்பு மற்றும் சேகரிப்பு. கட்டுப்பாட்டுக் குழு மற்றும் Mfn2cKO எலிகளின் மூளைகள், 0.1 M பாஸ்பேட் பஃபரில் (PB) உள்ள 2% PFA/2.5% குளுடரால்டிஹைடில் நிலைப்படுத்தப்பட்டன. பின்னர், சிலியேட்டுகளை (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) பயன்படுத்தி கரோனல் குறுக்குவெட்டுகள் (தடிமன் 50 முதல் 60 μm) தயாரிக்கப்பட்டன. அதன் பிறகு, அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரத்திற்கு 1% ஆஸ் டெட்ராக்சைடு மற்றும் 1.5% பொட்டாசியம் ஃபெரோசயனைடு கொண்ட PB பஃபரில் அவை நிலைப்படுத்தப்பட்டன. அந்தக் குறுக்குவெட்டுகள் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் மூன்று முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் 20 நிமிடங்களுக்கு 1% யுரேனைல் அசிடேட் கொண்ட 70% எத்தனால் கொண்டு சாயமேற்றப்பட்டன. அதன் பிறகு, அந்தக் குறுக்குவெட்டுகள் படிநிலை ஆல்கஹாலில் நீர்நீக்கம் செய்யப்பட்டு, சிலிக்கான் பூசப்பட்ட கண்ணாடி ஸ்லைடுகளுக்கு இடையில் டர்குபான் ACM (அரால்டைட் காஸ்டிங் ரெசின் M) எப்பாக்சி ரெசினில் (Electron Microscopy Sciences, பட்டியல் எண் 14040) பதிக்கப்பட்டன. இறுதியாக, 60°C வெப்பநிலையில் 48 மணி நேரத்திற்கு அடுப்பில் பாலிமரைஸ் செய்யப்பட்டன. சிறுமூளைப் புறணிப் பகுதி தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டு, லெய்கா அல்ட்ராக்கட் (லெய்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ் ஜிஎம்பிஹெச், வியன்னா, ஆஸ்திரியா) மூலம் 50 நானோமீட்டர் மிக மெல்லிய துண்டுகள் வெட்டப்பட்டு, பாலிஸ்டிரீன் படலம் பூசப்பட்ட 2×1 மிமீ செப்புப் பிளவு வலையில் பதியப்பட்டன. அந்தத் துண்டுகள், நீரில் கரைக்கப்பட்ட 4% யுரேனைல் அசிட்டேட் கரைசலால் 10 நிமிடங்களுக்குச் சாயமிடப்பட்டு, பலமுறை நீரால் கழுவப்பட்டன. பின்னர், ரெனால்ட்ஸ் லெட் சிட்ரேட் கரைசலால் 10 நிமிடங்களுக்குச் சாயமிடப்பட்டு, மீண்டும் பலமுறை நீரால் கழுவப்பட்டன. பிலிப்ஸ் CM100 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்டாம், மாசசூசெட்ஸ், அமெரிக்கா) என்ற ஊடுசெலுத்தும் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி, TVIPS (டீட்ஸ் வீடியோ மற்றும் படச் செயலாக்க அமைப்பு) டெம்கேம்-F416 டிஜிட்டல் கேமரா (TVIPS ஜிஎம்பிஹெச், கௌட்டிங், அமெரிக்கா) மூலம் நுண்ணுருவப் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன.
AAV-யால் பாதிக்கப்பட்ட எலிகளுக்கு, மூளை பிரிக்கப்பட்டு 1 மிமீ தடிமன் கொண்ட சஜிடல் வெட்டுத் துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டது, மேலும் AAV-யால் பாதிக்கப்பட்ட வளையத்தை (அதாவது, mCherry-ஐ வெளிப்படுத்தும் வளையம்) அடையாளம் காண, சிறுமூளை ஒரு ஃபுளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்யப்பட்டது. குறைந்தது இரண்டு தொடர்ச்சியான சிறுமூளை வளையங்களில், AAV ஊசி செலுத்துதலின் விளைவாக புர்கின்ஜே செல் அடுக்கின் (அதாவது, கிட்டத்தட்ட முழு அடுக்கின்) மிக அதிக டிரான்ஸ்டக்ஷன் செயல்திறன் ஏற்படும் சோதனைகள் மட்டுமே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. AAV-யால் டிரான்ஸ்டக்ஷன் செய்யப்பட்ட வளையம், இரவு முழுவதும் பிந்தைய நிலைப்படுத்தலுக்காக (0.1 M கோகோயேட் பஃபரில் 4% PFA மற்றும் 2.5% குளுடரால்டிஹைடு) நுண்-துண்டாக்கப்பட்டு, மேலும் பதப்படுத்தப்பட்டது. EPON உட்பொதித்தலுக்காக, நிலைப்படுத்தப்பட்ட திசு 0.1 M சோடியம் கோகோயேட் பஃபர் (Applichem) கொண்டு கழுவப்பட்டு, 0.1 M சோடியம் கோகோயேட் பஃபரில் (Applichem) உள்ள 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) உடன் 4 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் 2 மணி நேரம் கழுவப்பட்டது. 0.1 M கோகாமைடு பஃபருடன் 3 முறை மீண்டும் செய்யவும். அதைத் தொடர்ந்து, திசுவை நீர் நீக்கம் செய்வதற்காக, ஏறுவரிசை எத்தனால் தொடரில் ஒவ்வொரு எத்தனால் கரைசலும் 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. திசு புரோப்பிலீன் ஆக்சைடுக்கு மாற்றப்பட்டு, EPON (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) ஊடகத்தில் 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டது. திசுவை அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரத்திற்கு புதிய EPON ஊடகத்தில் வைத்து, பின்னர் 62°C வெப்பநிலையில் 72 மணி நேரத்திற்கு உட்பொதிக்கவும். ஒரு அல்ட்ராமைக்ரோடோம் (லைகா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ், UC6) மற்றும் ஒரு வைரக் கத்தி (டயட்டோம், பீல், சுவிட்சர்லாந்து) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி 70 nm மிக மெல்லிய பிரிவுகளை வெட்டி, 37°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 1.5% யுரேனைல் அசிடேட் கொண்டு சாயமேற்றி, பின்னர் 4 நிமிடங்களுக்கு ஈய சிட்ரேட் கரைசல் கொண்டு சாயமேற்றவும். கேமரா ஒன்வியூ 4K 16-பிட் (கடன்) மற்றும் டிஜிட்டல்மைக்ரோகிராஃப் மென்பொருள் (கடன்) பொருத்தப்பட்ட JEM-2100 பிளஸ் டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோப் (JEOL) பயன்படுத்தி எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள் எடுக்கப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்காக, 5000× அல்லது 10,000× டிஜிட்டல் ஜூம் பயன்படுத்தி எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கிப் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன.
மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல் பகுப்பாய்வு. அனைத்துப் பகுப்பாய்வுகளுக்கும், ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி எண்ணிமப் படங்களில் தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விளிம்புகள் கைமுறையாக வரையப்பட்டன. வெவ்வேறு உருவவியல் அளவுருக்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மைட்டோகாண்ட்ரிய அடர்த்தி என்பது, ஒவ்வொரு செல்லின் மொத்த மைட்டோகாண்ட்ரியப் பரப்பளவை சைட்டோபிளாசப் பரப்பளவால் (சைட்டோபிளாசப் பரப்பளவு = செல் பரப்பளவு - செல் உட்கரு பரப்பளவு) வகுத்து, 100-ஆல் பெருக்கிக் கிடைக்கும் சதவீதமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருண்டைத்தன்மை [4π∙(பரப்பளவு/சுற்றளவு 2)] என்ற சூத்திரத்தைக் கொண்டு கணக்கிடப்படுகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு, அவற்றின் முக்கிய வடிவங்களின்படி (“குழாய்” மற்றும் “கொப்புளம்”) என இரண்டு வகைகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது.
ஆட்டோஃபாகோசோம்/லைசோசோம் எண்ணிக்கை மற்றும் அடர்த்தி பகுப்பாய்வு. டிஜிட்டல் படத்தில் உள்ள ஒவ்வொரு ஆட்டோஃபாகோசோம்/லைசோசோமின் வெளிப்புறக் கோடுகளை கைமுறையாக வரைய ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும். ஆட்டோஃபாகோசோம்/லைசோசோம் பரப்பானது, ஒவ்வொரு செல்லின் மொத்த ஆட்டோஃபாகோசோம்/லைசோசோம் அமைப்புப் பரப்பை சைட்டோபிளாசப் பரப்பால் (சைட்டோபிளாசப் பரப்பு = செல் பரப்பு - உட்கருப் பரப்பு) 100 ஆல் வகுத்து கணக்கிடப்பட்ட சதவீதமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. ஆட்டோஃபாகோசோம்கள்/லைசோசோம்களின் அடர்த்தி, மொத்த எண்ணிக்கையை ஒரு செல்லில் உள்ள ஆட்டோஃபாகோசோம்/லைசோசோம் அமைப்புகளின் எண்ணிக்கையால் (சைட்டோபிளாசப் பரப்பின் அடிப்படையில்) (சைட்டோபிளாசப் பரப்பு = செல் பரப்பு - உட்கருப் பரப்பு) வகுப்பதன் மூலம் கணக்கிடப்படுகிறது.
கூர்மையான வெட்டுதல் மற்றும் மாதிரி தயாரிப்பிற்கான குறியிடுதல். குளுக்கோஸ் குறியிடுதல் தேவைப்படும் சோதனைகளுக்கு, கூர்மையான மூளைத் துண்டுகளை ஒரு முன்-அடைகாப்பு அறைக்கு மாற்றவும். அந்த அறையில் செறிவூட்டப்பட்ட கார்பன் (95% O2 மற்றும் 5% CO2), அதிக Ca2+ ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசல், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mOsm வரை சரிசெய்யப்பட்டது) ஆகியவை உள்ளன. இதில் குளுக்கோஸ் என்பது 13C6-குளுக்கோஸ் பதிலீடு (யூரிசோடாப், பட்டியல் எண் CLM-1396) ஆகும். பைருவேட் குறியிடல் தேவைப்படும் சோதனைகளுக்கு, கூர்மையான மூளைத் துண்டுகளை அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசல், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 2.0mM MgCl2 சேர்த்து, pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320mOsm வரை சரிசெய்யவும்) கரைசலுக்கு மாற்றி, 1mM 1-[1-13C]பைருவேட் (யூரிசோடாப், பட்டியல் எண் CLM-1082) சேர்க்கவும். அந்தத் துண்டுகளை 37°C வெப்பநிலையில் 90 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். சோதனையின் முடிவில், அந்தத் துண்டுகள் 75 mM அம்மோனியம் கார்பனேட் கொண்ட ஒரு நீர்க்கரைசலால் (pH 7.4) விரைவாகக் கழுவப்பட்டு, பின்னர் 40:40:20 (v:v:v) விகிதத்தில் அசிட்டோநைட்ரைல் (ACN): மெத்தனால்: நீர் கலவையில் கூழாக்கப்பட்டது. பிரிவுகள் 30 நிமிடங்கள் பனிக்கட்டியில் அடைகாக்கப்பட்ட பிறகு, மாதிரிகள் 4°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 21,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டன, மேலும் தெளிந்த மேல்தேங்கிய திரவம் ஸ்பீட்வேக் செறிவூட்டியில் உலர்த்தப்பட்டது. இதன் விளைவாகக் கிடைத்த உலர்ந்த வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் திரளானது, பகுப்பாய்வு செய்யப்படும் வரை -80°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டது.
13 C-குறியிடப்பட்ட அமினோ அமிலங்களின் திரவ நிறப்பிரிகை-நிறை நிறமாலை பகுப்பாய்வு. திரவ நிறப்பிரிகை-நிறை நிறமாலை (LC-MS) பகுப்பாய்விற்காக, வளர்சிதை மாற்றப் பெல்லட் 75μl LC-MS தர நீரில் (ஹனிவெல்) மீண்டும் கரைக்கப்பட்டது. 4°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு 21,000 g-ல் மையவிலக்கு செய்த பிறகு, தெளிவுபடுத்தப்பட்ட மேல்தேக்கத்திலிருந்து 20 μl அமினோ அமில பாய்வு பகுப்பாய்விற்காகப் பயன்படுத்தப்பட்டது, அதே நேரத்தில் மீதமுள்ள சாறு உடனடியாக அயனி பகுப்பாய்விற்காகப் பயன்படுத்தப்பட்டது (கீழே காண்க). முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட பென்சாயில் குளோரைடு வழித்தோன்றல் நெறிமுறையைப் (55, 56) பயன்படுத்தி அமினோ அமில பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. முதல் படியில், 20μl வளர்சிதை மாற்ற சாற்றுடன் 10μl 100 mM சோடியம் கார்பனேட் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சேர்க்கப்பட்டது, பின்னர் LC தர ACN உடன் 10μl 2% பென்சாயில் குளோரைடு (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரியானது சுருக்கமாக வோர்டெக்ஸ் செய்யப்பட்டு, பின்னர் 20°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு 21,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. தெளிந்த மேல்திரவத்தை, கூம்பு வடிவ கண்ணாடி செருகலுடன் கூடிய 2 மில்லி ஆட்டோசாம்பிளர் குப்பிக்கு (200 μl கொள்ளளவு) மாற்றவும். மாதிரிகள், Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) உயர்-தெளிவுத்திறன் துல்லிய நிறை நிறமாலைமானியுடன் (Thermo Fisher Scientific) இணைக்கப்பட்ட Acquity iClass அதி-உயர் செயல்திறன் LC அமைப்பைப் (Waters) பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்காக, 1.8μm துகள்களைக் கொண்ட 100×1.0 மிமீ உயர்-வலிமை சிலிக்கா T3 நிரலில் (Waters) 2μl வழித்தோன்றல் செய்யப்பட்ட மாதிரி உட்செலுத்தப்பட்டது. பாய்வு விகிதம் 100μl/நிமிடம் ஆகும், மற்றும் இடையக அமைப்பானது இடையக A (நீரில் 10 mM அம்மோனியம் ஃபார்மேட் மற்றும் 0.15% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் இடையக B (ACN) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது. சரிவு பின்வருமாறு: 0 நிமிடங்களில் 0%B; 0%B. 0 முதல் 0.1 நிமிடங்களில் 0 முதல் 15% B வரை; 0.1 முதல் 0.5 நிமிடங்களில் 15 முதல் 17% B வரை; 0.5 முதல் 14 நிமிடங்களில் B 17 முதல் 55% வரை; 14 முதல் 14.5 நிமிடங்களில் B 55 முதல் 70% வரை; 18 நிமிடங்களில் 14.5 முதல் 70 முதல் 100% B வரை; 18 முதல் 19 நிமிடங்களில் 100% B; 19 முதல் 19.1 நிமிடங்களில் 100 முதல் 0% B வரை; 19.1 முதல் 28 நிமிடங்களில் 0% B (55, 56). QE-HF நிறை நிறமாலைமானி, 50 முதல் 750 வரையிலான m/z (நிறை/மின்சுமை விகிதம்) நிறை வரம்புடன் நேர்மறை அயனியாக்கப் பயன்முறையில் இயங்குகிறது. பயன்படுத்தப்படும் பிரிதிறன் 60,000 ஆகும், மேலும் பெறப்பட்ட ஆதாயக் கட்டுப்பாட்டு (AGC) அயனி இலக்கு 3×10⁶ ஆகும், மற்றும் அதிகபட்ச அயனி நேரம் 100 மில்லிநொடிகள் ஆகும். வெப்பமூட்டப்பட்ட எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்க (ESI) மூலமானது 3.5 kV தெளிப்பு மின்னழுத்தம், 250°C நுண்குழாய் வெப்பநிலை, 60 AU (தன்னிச்சையான அலகுகள்) உறைக் காற்று ஓட்டம் மற்றும் 20 AU துணை காற்று ஓட்டம் ஆகியவற்றில் இயங்குகிறது. S வில்லை 60 AU-க்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது.
13C குறியிடப்பட்ட கரிம அமிலங்களின் அனயான் குரோமட்டோகிராபி-MS பகுப்பாய்வு. மீதமுள்ள வளர்சிதை மாற்ற வீழ்படிவு (55μl), QE-HF நிறை நிறமாலைமானியுடன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) இணைக்கப்பட்ட டையோனெக்ஸ் அயன் குரோமட்டோகிராபி அமைப்பைப் (ICS 5000+, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, 5μl வளர்சிதை மாற்றச் சாறு, HPLC (2 மிமீ × 250 மிமீ, துகள் அளவு 4μm, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பொருத்தப்பட்ட டையோனெக்ஸ் அயன்பேக் AS11-HC நிரலில், 1 என்ற நிரப்பு விகிதத்துடன் புஷ்-இன் பகுதி வளைய முறையில் செலுத்தப்பட்டது. டையோனெக்ஸ் அயன்பேக் AG11-HC பாதுகாப்பு நிரல் (2 மிமீ x 50 மிமீ, 4μm, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்). நிரலின் வெப்பநிலை 30°C இல் பராமரிக்கப்படுகிறது, மற்றும் ஆட்டோசாம்பிளர் 6°C க்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது. எலுயன்ட் ஜெனரேட்டர் வழியாக ஒரு பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடு சாய்வை உருவாக்க, அயனியகற்றப்பட்ட நீருடன் கூடிய பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடு கார்ட்ரிட்ஜைப் பயன்படுத்தவும். 380μl/நிமிடம் என்ற பாய்வு விகிதத்தில், பின்வரும் சாய்வுமுறையைப் பயன்படுத்தி வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் பிரிக்கப்பட்டன: 0 முதல் 3 நிமிடங்கள் வரை, 10 mM KOH; 3 முதல் 12 நிமிடங்கள் வரை, 10 முதல் 50 mM KOH; 12 முதல் 19 நிமிடங்கள் வரை, 50 முதல் 100 mM KOH; 19 முதல் 21 நிமிடங்கள் வரை, 100 mM KOH; 21 முதல் 21.5 நிமிடங்கள் வரை, 100 முதல் 10 mM KOH. அந்த நிரல் 8.5 நிமிடங்களுக்கு 10 mM KOH-இன் கீழ் மீண்டும் சமநிலைப்படுத்தப்பட்டது.
வெளியேற்றப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள், நிரலுக்குப் பிறகு 150μl/min ஐசோபுரோப்பனால் துணை ஓட்டத்துடன் இணைக்கப்பட்டு, பின்னர் எதிர்மறை அயனியாக்க முறையில் இயங்கும் உயர்-பிரிதிறன் நிறை நிறமாலைமானிக்கு (mass spectrometer) அனுப்பப்படுகின்றன. MS ஆனது m/z 50 முதல் 750 வரையிலான நிறை வரம்பை 60,000 பிரிதிறனுடன் கண்காணிக்கிறது. AGC 1×10⁶ என அமைக்கப்பட்டுள்ளது, மற்றும் அதிகபட்ச அயனி நேரம் 100 ms ஆக வைக்கப்பட்டுள்ளது. வெப்பமூட்டப்பட்ட ESI மூலமானது 3.5 kV தெளிப்பு மின்னழுத்தத்தில் இயக்கப்பட்டது. அயனி மூலத்தின் மற்ற அமைப்புகள் பின்வருமாறு: நுண்குழாய் வெப்பநிலை 275°C; உறை வாயு ஓட்டம், 60 AU; துணை வாயு ஓட்டம், 300°C-ல் 20 AU, மற்றும் S வில்லை அமைப்பு 60 AU.
13C லேபிளிடப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களின் தரவு பகுப்பாய்வு. ஐசோடோப் விகிதத்தின் தரவு பகுப்பாய்விற்காக TraceFinder மென்பொருளை (பதிப்பு 4.2, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தவும். ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் அடையாளமும் ஒரு நம்பகமான குறிப்பு சேர்மத்தால் சரிபார்க்கப்பட்டு சுயாதீனமாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஐசோடோப் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வைச் செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு 13C ஐசோடோப்பின் (Mn) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அயன் குரோமடோகிராமின் (XIC) பரப்பளவு [M + H] + இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டது, இங்கு n என்பது இலக்கு சேர்மத்தின் கார்பன் எண் ஆகும், இது அமினோ அமிலங்களைப் பகுப்பாய்வு செய்யப் பயன்படுகிறது அல்லது [MH] + எதிர்மின் அயனிகளைப் பகுப்பாய்வு செய்யப் பயன்படுகிறது. XIC இன் நிறை துல்லியம் ஒரு மில்லியனுக்கு ஐந்து பாகங்களுக்கும் குறைவாகும், மற்றும் RT இன் துல்லியம் 0.05 நிமிடங்கள் ஆகும். கண்டறியப்பட்ட ஒவ்வொரு ஐசோடோப்பின் விகிதத்தையும், அதனுடன் தொடர்புடைய சேர்மத்தின் அனைத்து ஐசோடோப்புகளின் கூட்டுத்தொகையுடன் கணக்கிடுவதன் மூலம் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. இந்த விகிதங்கள் ஒவ்வொரு ஐசோடோப்பிற்கும் சதவீத மதிப்புகளாக வழங்கப்படுகின்றன, மேலும் முடிவுகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி (42) மோலார் சதவீத செறிவூட்டலாக (MPE) வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன.
உறைந்த நியூரான் பெல்லட், பனிக்கட்டி போன்ற குளிர்ந்த 80% மெத்தனால் (v/v) இல் ஒருபடித்தாக்கப்பட்டு, சுழற்றப்பட்டு, -20°C இல் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டது. மாதிரியை மீண்டும் சுழற்றி, +4°C இல் 30 நிமிடங்களுக்குக் கிளறவும். மாதிரி 4°C இல் 5 நிமிடங்களுக்கு 21,000 g இல் மையவிலக்கப்பட்டு, பின்னர் விளைந்த சூப்பர்நேட்டன்ட் சேகரிக்கப்பட்டு, அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்விற்காக ஸ்பீட்வேக் கான்சென்ட்ரேட்டரைப் பயன்படுத்தி 25°C இல் உலர்த்தப்பட்டது. மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி, வரிசைப்படுத்தப்பட்ட செல்களின் அமினோ அமிலங்களில் LC-MS பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ட்ரேஸ்ஃபைண்டரைப் (பதிப்பு 4.2, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி, ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் மோனோஐசோடோபிக் நிறையைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. வளர்சிதை மாற்றத் தரவின் குவாண்டைல் ​​இயல்பாக்கம் ப்ரீபிராசஸ்கோர் மென்பொருள் தொகுப்பைப் (57) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.
துண்டு தயாரிப்பு. எலிக்கு கார்பன் டை ஆக்சைடு மூலம் விரைவாக மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டு, அதன் தலை துண்டிக்கப்பட்டது. மண்டையோட்டிலிருந்து மூளை விரைவாக அகற்றப்பட்டது, மேலும் பனிக்கட்டி நிரப்பப்பட்ட அதிர்வு கத்தியைப் (HM-650 V, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்டோர்ஃப், ஜெர்மனி) பயன்படுத்தி அது 300 முதல் 375 μm வரையிலான சஜிடல் பிரிவுகளாக வெட்டப்பட்டது. குளிர் கார்பன் வாயுவாக்கம் (95% O2 மற்றும் 5% CO2) குறைந்த Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 6.0 mM MgCl2) pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 330 mOsm வரை சரிசெய்யவும். பெறப்பட்ட மூளைத் துண்டுகளை, அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 4.0 mM CaCl2 மற்றும் 3.5 mM MgCl2) (pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mOsm) கொண்ட ஒரு அறைக்கு மாற்றவும். பதிவு செய்வதற்கு முன்பு அவற்றை மீட்டெடுப்பதற்காக, துண்டுகளை 20 முதல் 30 நிமிடங்கள் வரை சேமித்து வைக்கவும்.
பதிவு செய்தல். அனைத்துப் பதிவுகளுக்கும், ஒரு நிலையான பதிவு அறை மற்றும் 20x நீர் மூழ்கும் புறவில்லை (Scientifica) பொருத்தப்பட்ட ஒரு நுண்ணோக்கி மேடை பயன்படுத்தப்பட்டது. அனுமானிக்கப்பட்ட புர்கின்ஜே செல்கள் (i) உடல் அளவு, (ii) சிறுமூளையின் உடற்கூறியல் இருப்பிடம், மற்றும் (iii) ஒளிரும் mtYFP ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவின் வெளிப்பாடு ஆகியவற்றின் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்டன. 5 முதல் 11 மெகா ஓம் முனை மின்தடையைக் கொண்ட பேட்ச் பிப்பெட், ஒரு போரோசிலிகேட் கண்ணாடி நுண்குழாய் (GB150-10, 0.86 மிமீ×1.5 மிமீ×100 மிமீ, Science Products, Hofheim, Germany) மற்றும் ஒரு கிடைமட்ட பிப்பெட் இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ் (P-1000, Sutter), Novato, CA) ஆகியவற்றால் வெளியே இழுக்கப்பட்டது. அனைத்துப் பதிவுகளும் ELC-03XS npi பேட்ச் கிளாம்ப் பெருக்கி (npi electronic GmbH, Tam, Germany) மூலம் செய்யப்பட்டன, இது சிக்னல் (பதிப்பு 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) மென்பொருளால் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது. இந்தச் சோதனை 12.5 kHz மாதிரி விகிதத்தில் பதிவு செய்யப்பட்டது. சமிக்ஞையானது, முறையே 1.3 மற்றும் 10 kHz துண்டிப்பு அதிர்வெண்களைக் கொண்ட இரண்டு குறுகிய-கடப்பு பெசல் வடிப்பான்கள் மூலம் வடிகட்டப்படுகிறது. சவ்வு மற்றும் குழாயின் மின்தேக்கமானது, பெருக்கியைப் பயன்படுத்தும் ஈடுசெய் சுற்று மூலம் ஈடுசெய்யப்படுகிறது. அனைத்து சோதனைகளும் ஓர் ஓர்கா-ஃபிளாஷ் 4.0 கேமராவின் (ஹமாமாட்சு, கெர்டன், ஜெர்மனி) கட்டுப்பாட்டின் கீழ் செய்யப்பட்டன, இது ஹோகாவோ மென்பொருளால் (பதிப்பு 2.8, ஹமாமாட்சு, கெர்டன், ஜெர்மனி) கட்டுப்படுத்தப்பட்டது.
வழக்கமான முழு-செல் உள்ளமைவு மற்றும் பகுப்பாய்வு. பதிவு செய்வதற்குச் சற்று முன்பு, பின்வரும் பொருட்களைக் கொண்ட உள் கரைசலால் பிப்பெட்டை நிரப்பவும்: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM பொட்டாசியம் குளுக்கோனேட், 10.0 mM ஹெப்ஸ், 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM குவானோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (GTP) (Na) மற்றும் 10.0 mM கிரியேட்டினின் பாஸ்பேட் ஆகியவை pH 7.25-க்கு சரிசெய்யப்பட்டன, மேலும் சவ்வூடுபரவல் அழுத்தம் 290 mOsm (சுக்ரோஸ்) ஆக இருந்தது. சவ்வை உடைப்பதற்காக 0 pA விசையைப் பயன்படுத்திய உடனேயே, ஓய்வுநிலை சவ்வு மின்னழுத்தம் அளவிடப்பட்டது. -40, -30, -20, மற்றும் -10 pA அளவிலான ஹைப்பர்போலரைஸ்டு மின்னோட்டங்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் உள்ளீட்டு மின்தடை அளவிடப்படுகிறது. மின்னழுத்தப் பதிலின் அளவை அளந்து, ஓம் விதியைப் பயன்படுத்தி உள்ளீட்டு மின்தடையைக் கணக்கிடவும். மின்னழுத்தக் கட்டுப்பாட்டில் 5 நிமிடங்களுக்குத் தன்னிச்சையான செயல்பாடு பதிவு செய்யப்பட்டது, மேலும் Igor Pro (பதிப்பு 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) மென்பொருளில் ஒரு பகுதி-தானியங்கி அங்கீகார ஸ்கிரிப்டைப் பயன்படுத்தி sPSC அடையாளம் காணப்பட்டு அளவிடப்பட்டது. மின்கலத்தை வெவ்வேறு மின்னழுத்தங்களில் (-110 mV-இல் தொடங்கி) கட்டுப்படுத்தி, மின்னழுத்தத்தை 5 mV படிகளில் அதிகரிப்பதன் மூலம் IV வளைவு மற்றும் நிலைத்த மின்னோட்டம் அளவிடப்படுகின்றன. மின்னழுத்தக் குறைப்பு மின்னோட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் AP உருவாக்கம் சோதிக்கப்பட்டது. மின்னழுத்தக் குறைப்பு மின்னோட்டத் துடிப்பைப் பயன்படுத்தும்போது மின்கலத்தை -70 mV-இல் கட்டுப்படுத்தவும். ஒவ்வொரு பதிவு அலகின் படி அளவையும் தனித்தனியாகச் சரிசெய்யவும் (10 முதல் 60 pA வரை). அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணை ஏற்படுத்தும் துடிப்பு கூர்முனைகளைக் கைமுறையாக எண்ணுவதன் மூலம் அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணைக் கணக்கிடவும். ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட AP-களை முதலில் தூண்டும் மின்னழுத்தக் குறைப்புத் துடிப்பின் இரண்டாம் வகைக்கெழுவைப் பயன்படுத்தி AP வரம்பு பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது.
துளையிடப்பட்ட பேட்ச் உள்ளமைவு மற்றும் பகுப்பாய்வு. நிலையான நெறிமுறைகளைப் பயன்படுத்தி துளையிடப்பட்ட பேட்ச் பதிவைச் செய்யவும். பின்வரும் பொருட்கள் இல்லாத ATP மற்றும் GTP இல்லாத ஒரு பிப்பெட்டைப் பயன்படுத்தவும்: 128 mM குளுக்கோனேட் K, 10 mM KCl, 10 mM ஹெப்ஸ், 0.1 mM EGTA மற்றும் 2 mM MgCl2, மற்றும் pH 7.2 க்கு சரிசெய்யவும் (KOH ஐப் பயன்படுத்தி). செல் சவ்வின் கட்டுப்பாடற்ற ஊடுருவலைத் தடுக்க, செல் உள் கரைசலில் இருந்து ATP மற்றும் GTP தவிர்க்கப்படுகின்றன. துளையிடப்பட்ட பேட்ச் பதிவைப் பெறுவதற்காக, பேட்ச் பிப்பெட் ஆம்போடெரிசின் கொண்ட உள் கரைசலால் (தோராயமாக 200 முதல் 250μg/ml; G4888, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) நிரப்பப்படுகிறது. ஆம்போடெரிசின் டைமெத்தில் சல்ஃபாக்சைடில் (இறுதிச் செறிவு: 0.1 முதல் 0.3%; DMSO; D8418, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) கரைக்கப்பட்டது. பயன்படுத்தப்பட்ட DMSO-வின் செறிவு, ஆய்வு செய்யப்பட்ட நியூரான்களில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவை ஏற்படுத்தவில்லை. துளையிடும் செயல்முறையின் போது, ​​சேனல் மின்தடை (Ra) தொடர்ந்து கண்காணிக்கப்பட்டது, மேலும் Ra மற்றும் AP-யின் வீச்சு நிலைபெற்ற பிறகு (20-40 நிமிடங்கள்) பரிசோதனை தொடங்கப்பட்டது. தன்னிச்சையான செயல்பாடு 2 முதல் 5 நிமிடங்களுக்கு மின்னழுத்தம் மற்றும்/அல்லது மின்னோட்டக் கட்டுப்பாட்டில் அளவிடப்படுகிறது. தரவுப் பகுப்பாய்வானது Igor Pro (பதிப்பு 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (பதிப்பு 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) மற்றும் GraphPad Prism (பதிப்பு 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. தன்னிச்சையான AP-களை அடையாளம் காண, IgorPro-வின் NeuroMatic v3.0c செருகுநிரல் பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஒவ்வொரு பதிவிற்கும் தனித்தனியாக சரிசெய்யப்படும் ஒரு குறிப்பிட்ட வரம்பைப் பயன்படுத்தி AP-களைத் தானாகவே அடையாளம் காணவும். ஸ்பைக் இடைவெளியைப் பயன்படுத்தி, அதிகபட்ச உடனடி ஸ்பைக் அதிர்வெண் மற்றும் சராசரி ஸ்பைக் அதிர்வெண்ணுடன் கூடிய ஸ்பைக் அதிர்வெண்ணைத் தீர்மானிக்கவும்.
PN பிரித்தெடுத்தல். முன்னர் வெளியிடப்பட்ட நெறிமுறையைத் தழுவி, ஒரு குறிப்பிட்ட கட்டத்தில் (58) எலியின் சிறுமூளையிலிருந்து PN-கள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, சிறுமூளை துண்டாக்கப்பட்டு, பனிக்கட்டி குளிர்ச்சியான பிரிப்பு ஊடகத்தில் [HBSS Ca2+ மற்றும் Mg2+ இல்லாமல், 20 mM குளுக்கோஸ், பென்சிலின் (50 U/ml) மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 mg/ml) சேர்க்கப்பட்டது] சிறு துண்டுகளாக்கப்பட்டது, பின்னர் அந்த ஊடகம் பாப்பேனில் [HBSS, 1-சிஸ்டைன்·HCl (1 mg/ml), பாப்பேன் (16 U/ml) மற்றும் டீஆக்ஸிரைபோநியூக்ளியேஸ் I (DNase I; 0.1 mg/ml) சேர்க்கப்பட்டது] செரிக்கப்பட்டு, 30°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு பதப்படுத்தப்பட்டது. முதலில், நொதி செரிமானத்தைத் தடுப்பதற்காக, முட்டை சளி (10 மி.கி/மி.லி), BSA (10 மி.கி/மி.லி) மற்றும் DNase (0.1 மி.கி/மி.லி) ஆகியவற்றைக் கொண்ட HBSS ஊடகத்தில் திசுக்களை அறை வெப்பநிலையில் கழுவவும். பின்னர், 20 mM குளுக்கோஸ், பென்சிலின் (50 U/மி.லி), ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 மி.கி/மி.லி) மற்றும் DNase (0.1 மி.கி/மி.லி) ஆகியவற்றைக் கொண்ட HBSS ஊடகத்தில் மெதுவாக அரைப்பதன் மூலம் தனித்தனி செல்களைப் பிரித்தெடுக்கவும். இதன் விளைவாகக் கிடைத்த செல் கூழ்மமானது 70μm செல் வடிகட்டி வழியாக வடிகட்டப்பட்டது. பின்னர், செல்கள் மையவிலக்கு முறை மூலம் (1110 rpm, 5 நிமிடங்கள், 4°C) திரட்டப்பட்டு, பிரித்தெடுக்கும் ஊடகத்தில் [HBSS, 20 mM குளுக்கோஸ், 20% கரு மாட்டு சீரம், பென்சிலின் (50 U/மி.லி) மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 மி.கி/மி.லி) சேர்க்கப்பட்டது] மீண்டும் கரைக்கப்பட்டன. புரோபிடியம் அயோடைடு கொண்டு செல்களின் உயிர்வாழும் திறனை மதிப்பிட்டு, செல் அடர்த்தியை 1×10⁶ முதல் 2×10⁶ செல்கள்/மிலி வரை சரிசெய்யவும். ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரிக்கு முன், அந்தக் கலவை 50 μm செல் வடிகட்டி வழியாக வடிகட்டப்பட்டது.
ஃப்ளோ சைட்டோமீட்டர். FACSAria III இயந்திரம் (BD பயோசயின்சஸ்) மற்றும் FACSDiva மென்பொருள் (BD பயோசயின்சஸ், பதிப்பு 8.0.1) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி 4°C வெப்பநிலையில் செல் பிரித்தல் செய்யப்பட்டது. செல் சஸ்பென்ஷன், 100 μm முனையைப் பயன்படுத்தி 20 psi அழுத்தத்தில், வினாடிக்கு ~2800 நிகழ்வுகள் என்ற விகிதத்தில் பிரிக்கப்பட்டது. பாரம்பரிய கேட்டிங் அளவுகோல்கள் (செல் அளவு, இருமுனைப் பாகுபாடு மற்றும் சிதறல் பண்புகள்) மற்ற செல் வகைகளிலிருந்து PN-ஐ சரியாகப் பிரித்தெடுப்பதை உறுதி செய்ய முடியாததால், mitoYFP+ ​​மற்றும் கட்டுப்பாட்டு mitoYFP− எலிகளில் YFP செறிவு மற்றும் தன்னொளிர்வு ஆகியவற்றின் நேரடி ஒப்பீட்டின் அடிப்படையில் கேட்டிங் உத்தி அமைக்கப்பட்டது. 488 nm லேசர் கோடு மூலம் மாதிரியை ஒளியூட்டுவதன் மூலம் YFP தூண்டப்பட்டது, மேலும் அந்த சமிக்ஞை 530/30 nm பேண்ட் பாஸ் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி கண்டறியப்பட்டது. mitoYFP+ ​​எலிகளில், நியூரான் உடல் மற்றும் ஆக்சான் துண்டுகளை வேறுபடுத்துவதற்காக Rosa26-mitoYFP ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவின் சார்பு வலிமையும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இறந்த செல்களை விலக்குவதற்காக, 7-AAD ஆனது 561 nm மஞ்சள் லேசர் மூலம் தூண்டப்பட்டு, 675/20 nm பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி மூலம் கண்டறியப்படுகிறது. அதே நேரத்தில் ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளைப் பிரிப்பதற்காக, செல் சஸ்பென்ஷன் ACSA-2-APC கொண்டு சாயமிடப்பட்டது, பின்னர் அந்த மாதிரி 640 nm லேசர் கற்றை மூலம் கதிர்வீச்சுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது, மேலும் சிக்னலைக் கண்டறிய 660/20 nm பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி பயன்படுத்தப்பட்டது.
சேகரிக்கப்பட்ட செல்கள் மையவிலக்கு முறை மூலம் (1110 rpm, 5 நிமிடங்கள், 4°C) திரட்டப்பட்டு, பயன்படுத்தப்படும் வரை -80°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டன. செயல்முறை மாறுபாடுகளைக் குறைப்பதற்காக, Mfn2cKO எலிகளும் அவற்றின் குட்டிகளும் ஒரே நாளில் வகைப்படுத்தப்பட்டன. FACS தரவு வழங்கல் மற்றும் பகுப்பாய்வு ஆகியவை FlowJo மென்பொருளைப் (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டன.
மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி (59), வரிசைப்படுத்தப்பட்ட நியூரான்களிலிருந்து டிஎன்ஏ-வைப் பிரித்தெடுத்து, பின்னர் mtDNA-வை அளவிடுவதற்கு நிகழ்நேர பிசிஆர் பயன்படுத்தப்படுகிறது. நேரியல் தன்மை மற்றும் வரம்பு உணர்திறன் ஆகியவை ஆரம்பத்தில் வெவ்வேறு எண்ணிக்கையிலான செல்களில் qPCR-ஐ இயக்குவதன் மூலம் சோதிக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, 50 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% ட்வீன் 20 மற்றும் புரோட்டினேஸ் K (200 ng/ml) ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு லைசிஸ் பஃபரில் 300 PN-களை சேகரித்து, 55°C-ல் 120 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். புரோட்டினேஸ் K-ன் முழுமையான செயலிழப்பை உறுதி செய்வதற்காக, செல்கள் மேலும் 95°C-ல் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன. mt-Nd1-க்கு குறிப்பிட்ட ஒரு டாக்மேன் புரோபை (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி, 7900HT நிகழ்நேர பிசிஆர் அமைப்பில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) அரை-அளவு பிசிஆர் மூலம் mtDNA அளவிடப்பட்டது. mt-Nd6 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பட்டியல் எண் Mm04225274_s1), mt-Nd6 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பட்டியல் எண் AIVI3E8) மற்றும் 18S (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பட்டியல் எண் Hs99999901_s1) மரபணுக்கள்.
புரோட்டியோம் மாதிரி தயாரிப்பு. கரைசலை 95°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு சூடுபடுத்தி, பின்னர் லைசிஸ் பஃபரில் [6 M குவானிடின் குளோரைடு, 10 mM டிரிஸ்(2-கார்பாக்சியெத்தில்) பாஸ்பின் ஹைட்ரோகுளோரைடு, 10 mM குளோரோஅசிடமைடு மற்றும் HCl-இல் 100 mM டிரிஸ்-உறைந்த நியூரான் துகள்களை லைஸ் செய்தல்] சோனிகேட் செய்வதன் மூலம், பயோருப்டரில் (டயஜெனோட்) 10 நிமிடங்களுக்கு (30 வினாடிகள் பல்ஸ் / 30 வினாடிகள் இடைநிறுத்த காலம்) மாதிரி தயாரிக்கப்பட்டது. அந்த மாதிரி 20 mM டிரிஸ்-HCl (pH 8.0) கரைசலில் 1:10 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டு, 300 ng டிரிப்சின் கோல்டுடன் (புரோமேகா) கலக்கப்பட்டு, முழுமையான செரிமானத்தை அடைவதற்காக 37°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டது. இரண்டாம் நாளில், அந்த மாதிரி 20,000 g வேகத்தில் 20 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. மேல்கரைசல் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்துடன் நீர்க்கப்பட்டு, சுயமாகத் தயாரிக்கப்பட்ட ஸ்டேஜ்டிப்ஸ் கொண்டு கரைசலில் இருந்து உப்பு நீக்கப்பட்டது. மாதிரியானது ஸ்பீட்வேக் கருவியில் (எப்பண்டார்ஃப் கான்சென்ட்ரேட்டர் பிளஸ் 5305) 45°C வெப்பநிலையில் உலர்த்தப்பட்டது, பின்னர் பெப்டைடு 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் கரைக்கப்பட்டது. அனைத்து மாதிரிகளும் ஒரே நபரால் ஒரே நேரத்தில் தயாரிக்கப்பட்டன. ஆஸ்ட்ரோசைட் மாதிரிகளைப் பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக, 4 μg உப்பு நீக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள், 1:20 என்ற பெப்டைடு மற்றும் TMT வினைப்பொருள் விகிதத்தில், ஒரு டேன்டம் மாஸ் டேக் (TMT10plex, பட்டியல் எண் 90110, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) கொண்டு குறியிடப்பட்டன. TMT குறியிடுதலுக்காக, 0.8 mg TMT வினைப்பொருள் 70 μl நீரற்ற ACN-இல் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டது, மேலும் உலர்த்தப்பட்ட பெப்டைடு 9 μl 0.1 M TEAB (டிரையெதிலமோனியம் பைகார்பனேட்)-இல் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, அதனுடன் ACN-இல் உள்ள 7 μl TMT வினைப்பொருள் சேர்க்கப்பட்டது. இதன் செறிவு 43.75% ஆக இருந்தது. 60 நிமிட அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, 2 μl 5% ஹைட்ராக்சிலமைன் கொண்டு வினை நிறுத்தப்பட்டது. குறியிடப்பட்ட பெப்டைடுகள் சேகரிக்கப்பட்டு, உலர்த்தப்பட்டு, 200μl 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் (FA) மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, இரண்டாகப் பிரிக்கப்பட்டு, பின்னர் சுயமாகத் தயாரிக்கப்பட்ட ஸ்டேஜ்டிப்ஸைப் பயன்படுத்தி உப்பு நீக்கம் செய்யப்பட்டன. அல்டிமேட் 3000 அதி உயர் செயல்திறன் திரவ நிறப்பகுப்பாய்வியைப் (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) பயன்படுத்தி, அந்த இரண்டு பாதிகளில் ஒன்று, 130Å 1.7μm C18 துகள்களால் (வாட்டர்ஸ், பட்டியல் எண். SKU: 186006935) நிரப்பப்பட்ட 1mm x 150mm அக்விட்டி நிறப்பகுப்பாய்வுக் கலத்தில் பகுக்கப்பட்டது. (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்). பெப்டைடுகளை 30μl/நிமிடம் என்ற பாய்வு விகிதத்தில் பிரிக்கவும்; 1% முதல் 50% பஃபர் B வரை 85 நிமிடங்களுக்கு 96 நிமிடங்களின் படிப்படியான சாய்வில் பிரிக்கவும், பின்னர் 50% முதல் 95% பஃபர் B வரை 3 நிமிடங்களுக்குப் பிரிக்கவும், அதன்பின் 95% பஃபர் B-க்கு 8 நிமிடங்கள் பிரிக்கவும். பஃபர் A என்பது 5% ACN மற்றும் 10 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட் (ABC) ஆகும், மற்றும் பஃபர் B என்பது 80% ACN மற்றும் 10 mM ABC ஆகும். ஒவ்வொரு 3 நிமிடங்களுக்கும் பகுதிகளைச் சேகரித்து, அவற்றை இரண்டு குழுக்களாக (1 + 17, 2 + 18, போன்றவை) இணைத்து, ஒரு வெற்றிட மையவிலக்கியில் உலர்த்தவும்.
LC-MS/MS பகுப்பாய்வு. நிறை நிறமாலை அளவியலுக்காக, பெப்டைடுகள் (எண் r119.aq) 25 செ.மீ, 75 μm உள்விட்டம் கொண்ட பிகோஃப்ரிட் பகுப்பாய்வுக் கலத்தில் (புதிய புறவில்லை, பாக எண் PF7508250) பிரிக்கப்பட்டன. இக்கலம் 1.9 μm ரெப்ரோசில்-பூர் 120 C18-AQ ஊடகத்துடன் (டாக்டர். மைஷ், மாட்) பொருத்தப்பட்டிருந்தது. இதற்காக ஈஸி-என்எல்சி 1200 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஜெர்மனி) பயன்படுத்தப்பட்டது. இக்கலம் 50°C வெப்பநிலையில் பராமரிக்கப்பட்டது. இடையகங்கள் A மற்றும் B ஆகியவை முறையே நீரில் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் மற்றும் 80% ACN-இல் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் ஆகும். பெப்டைடுகள் 65 நிமிடங்களுக்கு 6% முதல் 31% இடையக B வரையிலும், 5 நிமிடங்களுக்கு 31% முதல் 50% இடையக B வரையிலும் 200 nl/min என்ற சாய்வு விகிதத்தில் பிரிக்கப்பட்டன. வெளியேற்றப்பட்ட பெப்டைடுகள் ஆர்பிட்ராப் ஃபியூஷன் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பெப்டைட் முன்னோடியின் m/z அளவீடு, 350 முதல் 1500 m/z வரையிலான வரம்பில் 120,000 பிரிதிறனுடன் செய்யப்படுகிறது. 27% இயல்பாக்கப்பட்ட மோதல் ஆற்றலைப் பயன்படுத்தி, 2 முதல் 6 வரையிலான மின்னூட்ட நிலை கொண்ட வலிமையான முன்னோடி, உயர் ஆற்றல் C ட்ராப் சிதைவு (HCD) பிளவிற்காகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. சுழற்சி நேரம் 1 வினாடியாக அமைக்கப்பட்டது. பெப்டைட் துண்டின் m/z மதிப்பு, 5×10⁴ என்ற மிகச்சிறிய AGC இலக்கு மற்றும் 86 ms என்ற அதிகபட்ச உட்செலுத்தல் நேரத்தைப் பயன்படுத்தி அயனிப் பொறியில் அளவிடப்பட்டது. துண்டாக்கத்திற்குப் பிறகு, அந்த முன்னோடி 45 வினாடிகளுக்கு டைனமிக் விலக்கு பட்டியலில் வைக்கப்பட்டது. TMT-குறியிடப்பட்ட பெப்டைடுகள் 50 செ.மீ, 75 μm அக்ளெய்ம் பெப்மேப் நிரலில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பட்டியல் எண் 164942) பிரிக்கப்பட்டன, மேலும் அவற்றின் இடப்பெயர்வு நிறமாலைகள், −50 மற்றும் −70 V ஆகிய இரண்டு ஈடுசெய் மின்னழுத்தங்களில் இயங்கும் உயர்-புல சமச்சீரற்ற அலைவடிவ அயனிகள் (FAIMS) கருவியுடன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பொருத்தப்பட்ட ஆர்பிட்ராப் லூமோஸ் ட்ரைபிரிட் நிறை நிறமாலைமானியில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. ஒத்திசைவு முன்னோடியின் அடிப்படையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட MS3, TMT அறிக்கை அயனி சமிக்ஞை அளவீட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. பெப்டைடு பிரித்தலானது, 90% நேரியல் சாய்வுப் பிரித்தெடுத்தல் முறையைப் பயன்படுத்தி, 6% முதல் 31% வரையிலான இடையகச் செறிவுடன் ஈஸி-என்எல்சி 1200-இல் மேற்கொள்ளப்பட்டது; இடையகக் கரைசல் A 0.1% FA ஆகவும், இடையகக் கரைசல் B 0.1% FA மற்றும் 80% ACN ஆகவும் இருந்தது. பகுப்பாய்வு நிரல் 50°C வெப்பநிலையில் இயக்கப்படுகிறது. FAIMS ஈடுசெய் மின்னழுத்தத்தின்படி அசல் கோப்பைப் பிரிக்க, FreeStyle (பதிப்பு 1.6, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும்.
புரதத்தை அடையாளம் காணுதல் மற்றும் அளவிடுதல். ஒருங்கிணைந்த ஆண்ட்ரோமெடா தேடுபொறியைப் பயன்படுத்தி, மேக்ஸ்குவாண்ட் பதிப்பு 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) மூலம் அசல் தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஏக்வோரியா விக்டோரியாவிலிருந்து பெறப்பட்ட கிரீ ரீகாம்பினேஸ் மற்றும் YFP வரிசைகளுடன் கூடுதலாக, எலி குறிப்பு புரோட்டியோமின் (புரோட்டியோம் ஐடி UP000000589, மே 2017 இல் யூனிபுரோட்டிலிருந்து பதிவிறக்கம் செய்யப்பட்டது) நியமன வரிசை மற்றும் ஐசோஃபார்ம் வரிசைக்காக பெப்டைட் துண்டு நிறமாலைகள் தேடப்பட்டன. மெத்தியோனைன் ஆக்சிஜனேற்றம் மற்றும் புரத N-முனை அசிட்டிலேற்றம் ஆகியவை மாறும் மாற்றங்களாக அமைக்கப்பட்டன; சிஸ்டைன் கார்பாமாயில் மெத்திலேற்றம் நிலையான மாற்றங்களாக அமைக்கப்பட்டது. செரிமான அளவுருக்கள் "குறிப்பிட்ட தன்மை" மற்றும் "டிரிப்சின்/P" என அமைக்கப்பட்டுள்ளன. புரதத்தை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தப்படும் பெப்டைடுகள் மற்றும் ரேசர் பெப்டைடுகளின் குறைந்தபட்ச எண்ணிக்கை 1 ஆகும்; தனித்துவமான பெப்டைடுகளின் குறைந்தபட்ச எண்ணிக்கை 0 ஆகும். பெப்டைட் வரைபடப் பொருத்தத்தின் நிபந்தனைகளின் கீழ், புரதத்தை அடையாளம் காணும் விகிதம் 0.01 ஆக இருந்தது. “இரண்டாவது பெப்டைட்” விருப்பம் இயக்கப்பட்டுள்ளது. வெவ்வேறு அசல் கோப்புகளுக்கு இடையில் வெற்றிகரமான அடையாளங்களை மாற்ற, “இயக்கங்களுக்கு இடையில் பொருத்து” விருப்பத்தைப் பயன்படுத்தவும். லேபிள் இல்லாத அளவீட்டிற்கு (LFQ) (60) LFQ குறைந்தபட்ச விகித எண்ணிக்கை 1 ஐப் பயன்படுத்தவும். ஒவ்வொரு நேரப் புள்ளியிலும் குறைந்தது ஒரு மரபணு வகைக் குழுவிலாவது குறைந்தது இரண்டு செல்லுபடியாகும் மதிப்புகளுக்கு LFQ தீவிரம் வடிகட்டப்படுகிறது, மேலும் இது 0.3 அகலம் மற்றும் 1.8 கீழ்நோக்கிய நகர்வுடன் கூடிய இயல்நிலைப் பரவலிலிருந்து புறச்செருகப்படுகிறது. LFQ முடிவுகளைப் பகுப்பாய்வு செய்ய பெர்சியஸ் கணினித் தளம் (https://maxquant.net/perseus/) மற்றும் R (https://r-project.org/) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தவும். வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்விற்காக லிம்மா மென்பொருள் தொகுப்பிலிருந்து இருவழி மிதமான t சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டது (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally மற்றும் pheatmap ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஆய்வுத் தரவுப் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. TMT-அடிப்படையிலான புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவு MaxQuant பதிப்பு 1.6.10.43 ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. செப்டம்பர் 2018-இல் பதிவிறக்கம் செய்யப்பட்ட யூனிபுரோட்டின் மனித புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தளத்திலிருந்து மூல புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவைத் தேடவும். இந்தப் பகுப்பாய்வில், உற்பத்தியாளரால் வழங்கப்பட்ட ஐசோடோப் தூய்மைத் திருத்தக் காரணி அடங்கும். வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்விற்காக R-இல் உள்ள லிம்மாவைப் பயன்படுத்தவும். அசல் தரவு, தரவுத்தளத் தேடல் முடிவுகள், தரவுப் பகுப்பாய்வுப் பணிப்பாய்வு மற்றும் முடிவுகள் அனைத்தும், PXD019690 என்ற தரவுத் தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியுடன் PRIDE கூட்டாளர் களஞ்சியத்தின் வழியாக புரோட்டியோம்எக்ஸ்சேஞ்ச் கூட்டணியில் சேமிக்கப்பட்டுள்ளன.
செயல்பாட்டு விளக்கங்கள் பகுப்பாய்வை வளப்படுத்துகின்றன. 8 வாரங்களில் தரவுத் தொகுப்பின் செயல்பாட்டு விளக்கச் சொற்களின் செழுமையைத் தீர்மானிக்க, இன்ஜென்யூட்டி பாத்வே அனாலிசிஸ் (QIAGEN) கருவி பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 1). சுருக்கமாக, LC-MS/MS (டாண்டம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி) தரவுப் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட அளவுசார் புரதப் பட்டியல் பின்வரும் வடிகட்டுதல் அளவுகோல்களுடன் பயன்படுத்தப்படுகிறது: மஸ் மஸ்குலஸ் இனமாகவும் பின்னணியாகவும் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது, மேலும் செறிவூட்டலுக்காக பெஞ்சமினியால் சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பு 0.05 அல்லது அதற்குக் குறைவாக உள்ள வகை குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்படுகிறது. இந்த வரைபடத்திற்காக, சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பின் அடிப்படையில் ஒவ்வொரு கிளஸ்டரிலும் உள்ள முதல் ஐந்து அதிகப்படியான வகைகள் காட்டப்பட்டுள்ளன. பெஞ்சமினி, கிரீகர் மற்றும் யெகுடியேலியின் (Q = 5%) இரு-நிலை நேரியல் பூஸ்ட் நிரலைப் பயன்படுத்தி, பல t-சோதனை மூலம், ஒவ்வொரு வகையிலும் அடையாளம் காணப்பட்ட முக்கியமான வேட்பாளர்களின் மீது காலப்போக்கு புரத வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது, மேலும் ஒவ்வொரு வரிசையும் தனித்தனியாகப் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. ஒரு சீரான திட்ட விலக்கத்தை (SD) ஏற்றுக்கொள்ள வேண்டிய அவசியமில்லை.
இந்த ஆய்வின் முடிவுகளை வெளியிடப்பட்ட தரவுத்தளங்களுடன் ஒப்பிட்டு, படம் 1 இல் ஒரு வென் வரைபடத்தை உருவாக்க, அளவுசார் புரதப் பட்டியலை MitoCarta 2.0 குறிப்புகளுடன் (24) இணைத்தோம். வரைபடத்தை உருவாக்க, Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) என்ற ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தவும்.
புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படும் புள்ளிவிவர நடைமுறைகள் குறித்த விரிவான தகவல்களுக்கு, 'பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்' பகுதியின் தொடர்புடைய பிரிவைப் பார்க்கவும். மற்ற அனைத்து சோதனைகளுக்கும், விரிவான தகவல்களை அதற்கான விளக்கக்குறிப்பில் காணலாம். வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்பட்டாலன்றி, அனைத்துத் தரவுகளும் சராசரி ± திட்டப் பிழை (SEM) என வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன, மேலும் அனைத்துப் புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வுகளும் GraphPad Prism 8.1.2 மென்பொருளைப் பயன்படுத்திச் செய்யப்பட்டன.
இந்தக் கட்டுரைக்கான கூடுதல் தகவல்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 என்ற இணைப்பைப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-நான்-கமர்ஷியல் உரிமத்தின் கீழ் விநியோகிக்கப்பட்ட ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரை ஆகும். இந்த உரிமம், இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக இல்லாத வரையிலும், அசல் படைப்பு சரியானது என்ற அடிப்படையிலும், எந்தவொரு ஊடகத்திலும் இதன் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது. மேற்கோள்.
குறிப்பு: நீங்கள் இந்தப் பக்கத்திற்குப் பரிந்துரைக்கும் நபர், இந்த மின்னஞ்சலை அவர்கள் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் அறிந்துகொள்வதற்காக மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் கேட்டுக்கொள்கிறோம். நாங்கள் எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் சேகரிக்க மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளர்தானா என்பதைச் சோதிப்பதற்கும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுப்பதற்கும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
இ. மோட்டோரி, ஐ. அடானாசோவ், எஸ்.எம்.வி. கோச்சன், கே. ஃபோல்ஸ்-டோனாஹூ, வி. சக்திவேலு, பி. கியாவலிஸ்கோ, என். டோனி, ஜே. புயல், என்.-ஜி. லார்சன்
செயலிழந்த நரம்பணுக்களின் புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வில், நரம்புச் சிதைவை எதிர்கொள்வதற்காக வளர்சிதை மாற்றத் திட்டங்கள் செயல்படுத்தப்படுகின்றன என்பது தெரியவந்துள்ளது.
இ. மோட்டோரி, ஐ. அடானாசோவ், எஸ்.எம்.வி. கோச்சன், கே. ஃபோல்ஸ்-டோனாஹூ, வி. சக்திவேலு, பி. கியாவலிஸ்கோ, என். டோனி, ஜே. புயல், என்.-ஜி. லார்சன்
செயலிழந்த நரம்பணுக்களின் புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வில், நரம்புச் சிதைவை எதிர்கொள்வதற்காக வளர்சிதை மாற்றத் திட்டங்கள் செயல்படுத்தப்படுகின்றன என்பது தெரியவந்துள்ளது.
©2020 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS ஆனது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.