Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த பலன்களைப் பெற, உங்கள் உலாவியின் புதிய பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதி செய்வதற்காக, நாங்கள் இந்தத் தளத்தை வடிவமைப்பு அல்லது ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காண்பிக்கிறோம்.
ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறு போன்ற நரம்பியல் வளர்ச்சிக் கோளாறுகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் பங்கை ஆய்வு செய்ய புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) பயன்படுத்தப்படுகிறது. PPA, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியல், வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் சுழற்சி ஆகியவற்றைச் சீர்குலைப்பதாக அறியப்படுகிறது. இருப்பினும், இந்த வழிமுறைகளின் சிக்கலான கால இயல்பு காரணமாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல், பிளவு மற்றும் இணைவு ஆகியவற்றின் மீதான PPA-வின் விளைவுகள் இன்னும் சிக்கலாகவே உள்ளன. இங்கே, நியூரான் போன்ற SH-SY5Y செல்களில் PPA எவ்வாறு மைட்டோகாண்ட்ரியல் மீநுண் கட்டமைப்பு, உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலைப் பாதிக்கிறது என்பதை ஆராய, நிரப்பு அளவுசார் படமாக்கல் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்துகிறோம். PPA (5 mM) மைட்டோகாண்ட்ரியல் பரப்பளவு (p < 0.01), ஃபெரெட் விட்டம் மற்றும் சுற்றளவு (p < 0.05), மற்றும் பகுதி 2 (p < 0.01) ஆகியவற்றில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தியது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு இருப்பிடப் பகுப்பாய்வு, பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் (p < 0.05) காட்டியது, இதன் மூலம் அழுத்தமான சூழ்நிலைகளின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பின் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரித்தது. கூடுதலாக, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) மற்றும் OPA1 (p < 0.05) ஆகியவற்றின் mRNA வெளிப்பாடு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைக்கப்பட்டது. இது, அழுத்தமான சூழ்நிலைகளில் செயல்பாட்டைப் பராமரிப்பதற்காக மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றின் மறுவடிவமைப்பை விளக்குகிறது. எங்கள் தரவுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியலில் PPA ஏற்படுத்தும் விளைவுகள் குறித்த புதிய பார்வையை வழங்குகின்றன, மேலும் மைட்டோகாண்ட்ரிய அழுத்த எதிர்வினைகளில் ஈடுபட்டுள்ள சிக்கலான ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளைப் படிப்பதற்குப் படமெடுக்கும் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டையும் எடுத்துக்காட்டுகின்றன.
மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள், ஆற்றல் உற்பத்தி மற்றும் உயிரியக்கவியலில் தங்களின் வழக்கமான பங்குகளைத் தாண்டி, பல்வேறு செல் செயல்பாடுகளில் ஒருங்கிணைந்த பங்கேற்பாளர்களாக உள்ளன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் என்பது கால்சியம் சமிக்ஞை, வளர்சிதை மற்றும் ரெடாக்ஸ் சமநிலை, அழற்சி சமிக்ஞை, புறமரபணு மாற்றங்கள், செல் பெருக்கம், வேறுபடுதல் மற்றும் திட்டமிடப்பட்ட செல் இறப்பு¹ ஆகியவற்றின் ஒரு முக்கிய ஒழுங்குபடுத்தியாகும். குறிப்பாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் நரம்பணுக்களின் வளர்ச்சி, உயிர்வாழ்வு மற்றும் செயல்பாட்டிற்கு இன்றியமையாததுடன், நரம்பியல் நோயியலின் பல்வேறு வெளிப்பாடுகளிலும் பரவலாகத் தொடர்புடையதாக உள்ளது²,³,⁴.
கடந்த பத்தாண்டுகளில், வளர்சிதை மாற்ற நிலை என்பது நரம்பணு உருவாக்கம், வேறுபடுதல், முதிர்ச்சி மற்றும் நெகிழ்வுத்தன்மை ஆகியவற்றின் மைய ஒழுங்குபடுத்தியாக உருவெடுத்துள்ளது5,6. சமீபத்தில், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவமைப்பும் இயக்கவியலும், செல்களுக்குள் ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் தொகுப்பைப் பராமரிக்கும் ஒரு ஆற்றல்மிக்க செயல்முறையான மைட்டோசிஸின் மிக முக்கியமான கூறுகளாக மாறியுள்ளன. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியல், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உயிரியக்கவியல் மற்றும் உயிர் ஆற்றலியல் முதல் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் பிளவு, இணைவு, கடத்துதல் மற்றும் அகற்றுதல் வரையிலான சிக்கலான, ஒன்றையொன்று சார்ந்த பாதைகளால் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது7,8. இந்த ஒருங்கிணைந்த வழிமுறைகளில் ஏதேனும் ஒன்றில் ஏற்படும் சீர்குலைவு, ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் வலைப்பின்னல்களைப் பராமரிப்பதைக் குறைத்து, நரம்பு வளர்ச்சிக்கு ஆழமான செயல்பாட்டு விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது9,10. உண்மையில், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியலில் ஏற்படும் ஒழுங்கின்மை, ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறுகள் (ASD) உட்பட பல மனநல, நரம்பு சிதைவு மற்றும் நரம்பு வளர்ச்சிக் கோளாறுகளில் காணப்படுகிறது11,12.
ASD என்பது ஒரு சிக்கலான மரபணு மற்றும் புறமரபணு கட்டமைப்பைக் கொண்ட ஒரு பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த நரம்பு வளர்ச்சிக் கோளாறு ஆகும். ASD-யின் பரம்பரைத்தன்மை மறுக்க முடியாதது, ஆனால் அதன் அடிப்படையான மூலக்கூறு நோய்க்காரணம் இன்னும் முழுமையாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. மருத்துவத்திற்கு முந்தைய மாதிரிகள், மருத்துவ ஆய்வுகள் மற்றும் பல-ஓமிக்ஸ் மூலக்கூறு தரவுத்தொகுப்புகளிலிருந்து திரட்டப்படும் தரவுகள், ASD-யில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கான சான்றுகளை அதிகரித்து வருகின்றன¹³,¹⁴. நாங்கள் முன்னர் ASD நோயாளிகளின் ஒரு குழுவில் மரபணுத்தொகுதி முழுவதுமான டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் திரையிடலை மேற்கொண்டோம், மேலும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றப் பாதைகளில் தொகுக்கப்பட்ட வேறுபட்ட மெத்திலேஷன் செய்யப்பட்ட மரபணுக்களைக் கண்டறிந்தோம்¹⁵. அதைத் தொடர்ந்து, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியலின் மைய ஒழுங்குபடுத்திகளின் வேறுபட்ட மெத்திலேஷனைப் பற்றி நாங்கள் அறிக்கை செய்தோம், இது ASD-யில் அதிகரித்த mtDNA நகல் எண்ணிக்கை மற்றும் மாற்றப்பட்ட சிறுநீர் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரத்துடன் தொடர்புடையதாக இருந்தது¹⁶. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மற்றும் சமநிலை ஆகியவை ASD-யின் நோயியலில் ஒரு மையப் பங்கை வகிக்கின்றன என்பதற்கு எங்கள் தரவுகள் பெருகிவரும் சான்றுகளை வழங்குகின்றன. எனவே, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல், உருவவியல் மற்றும் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவின் இயந்திரவியல் புரிதலை மேம்படுத்துவது, இரண்டாம் நிலை மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பால் வகைப்படுத்தப்படும் நரம்பியல் நோய்கள் குறித்த தற்போதைய ஆராய்ச்சியின் ஒரு முக்கிய இலக்காகும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்த எதிர்வினைகளில் குறிப்பிட்ட மரபணுக்களின் பங்கை ஆய்வு செய்ய மூலக்கூறு நுட்பங்கள் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், மைட்டோடிக் கட்டுப்பாட்டு வழிமுறைகளின் பன்முக மற்றும் தற்காலிக தன்மையால் இந்த அணுகுமுறை வரையறுக்கப்படலாம். மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்களின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு என்பது செயல்பாட்டு மாற்றங்களின் ஒரு மறைமுகக் குறிகாட்டியாகும், குறிப்பாக பொதுவாக ஒரு குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான மரபணுக்கள் மட்டுமே பகுப்பாய்வு செய்யப்படுவதால். எனவே, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மற்றும் உயிர் ஆற்றலியலை ஆய்வு செய்வதற்கான மிகவும் நேரடியான முறைகள் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன¹⁷. மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவம், இணைப்பு மற்றும் அமைப்பு ஆகியவை ஆற்றல் உற்பத்திக்கும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் செல் உயிர்வாழ்விற்கும் முக்கியமானவை⁵,¹⁸. மேலும், மைட்டோசிஸின் பல்வேறு கூறுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களில் கவனம் செலுத்துகின்றன, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் பயனுள்ள இறுதிப் புள்ளிகளாகச் செயல்படக்கூடும் மற்றும் அடுத்தடுத்த வழிமுறை ஆய்வுகளுக்கு ஒரு அடிப்படையை வழங்குகிறது.
டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பை நேரடியாகக் காண முடியும், இது செல்லின் நுண் கட்டமைப்பை விரிவாக ஆய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது. TEM ஆனது, செல் தொகுதிகளில் உள்ள மரபணு படியெடுத்தல், புரத வெளிப்பாடு அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயல்பாட்டு அளவுருக்களை மட்டுமே சார்ந்திருக்காமல், தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் தெளிவுத்திறனில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கிரிஸ்டேக்களின் உருவ அமைப்பு, வடிவம் மற்றும் கட்டமைப்பை நேரடியாகக் காட்சிப்படுத்துகிறது¹⁷,¹⁹,²⁰. மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயல்பாடு மற்றும் சமநிலையைப் பேணுவதில் முக்கியப் பங்கு வகிக்கும் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் மற்றும் ஆட்டோஃபாஜோசோம்கள் போன்ற பிற நுண்ணுறுப்புகளுக்கும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவுக்கும் இடையிலான இடைவினைகளை ஆய்வு செய்வதை TEM எளிதாக்குகிறது²¹,²². எனவே, குறிப்பிட்ட பாதைகள் அல்லது மரபணுக்களில் கவனம் செலுத்துவதற்கு முன்பு, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயலிழப்பை ஆய்வு செய்வதற்கு TEM ஒரு நல்ல தொடக்கப் புள்ளியாக அமைகிறது. நரம்பியல் நோயியலுக்கு மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயல்பாடு பெருகிய முறையில் முக்கியத்துவம் பெறுவதால், ஆய்வக நரம்பணு மாதிரிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பு மற்றும் இயக்கவியலை நேரடியாகவும் அளவறிந்து ஆய்வு செய்ய வேண்டிய தெளிவான தேவை உள்ளது.
இந்தக் கட்டுரையில், ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறில் (ASD) உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் ஒரு நரம்பணு மாதிரியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை நாங்கள் ஆராய்கிறோம். ASD15-ல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரோபியோனைல்-கோஏ கார்பாக்சிலேஸ் நொதியான PCC-யின் ஒரு துணை அலகான புரோபியோனைல்-கோஏ கார்பாக்சிலேஸ் பீட்டாவின் (PCCB) வேறுபட்ட மெத்திலேஷனை நாங்கள் முன்னர் தெரிவித்திருந்தோம். PCC-யின் ஒழுங்கற்ற செயல்பாடு, புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA)23,24,25 உட்பட, புரோபியோனைல் வழிப்பொருட்களின் நச்சுத்தன்மை வாய்ந்த திரட்சியை ஏற்படுத்துவதாக அறியப்படுகிறது. PPA, நரம்பணுக்களின் வளர்சிதை மாற்றத்தைச் சீர்குலைப்பதாகவும், உயிருள்ள உயிரினங்களில் (in vivo) நடத்தையை மாற்றுவதாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது. மேலும் இது ASD-யில் ஈடுபட்டுள்ள நரம்பியல் வளர்ச்சி வழிமுறைகளைப் படிப்பதற்கான ஒரு நிறுவப்பட்ட விலங்கு மாதிரியாகும்26,27,28. கூடுதலாக, PPA, ஆய்வகச் சூழலில் (in vitro) மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு மின்னழுத்தம், உயிரியக்கவியல் மற்றும் சுவாசத்தைச் சீர்குலைப்பதாகத் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது. மேலும் இது நரம்பணுக்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மாதிரியாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது29,30. இருப்பினும், PPA-ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலில் ஏற்படுத்தும் தாக்கம் இன்னும் முழுமையாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.
இந்த ஆய்வு, SH-SY5Y செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல், இயக்கவியல் மற்றும் செயல்பாட்டின் மீது PPA ஏற்படுத்தும் விளைவுகளை அளவிடுவதற்கு, நிரப்புப் படமாக்கல் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்துகிறது. முதலில், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல் மற்றும் மீநுண் கட்டமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் காட்சிப்படுத்த, நாங்கள் ஒரு TEM முறையை உருவாக்கினோம்¹⁷,³¹,³². மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயங்கு தன்மையைக்³³ கருத்தில் கொண்டு, PPA அழுத்தத்தின் கீழ் பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளுக்கு இடையிலான சமநிலை, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை மற்றும் கனஅளவு ஆகியவற்றில் ஏற்படும் மாற்றங்களை அளவிடுவதற்கு, நாங்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு இடங்காட்டி (MEL) பகுப்பாய்வையும் பயன்படுத்தினோம். இறுதியாக, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவை, உயிரியக்கவியல், பிளவு மற்றும் இணைவு ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ள மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்களுடன் தொடர்புடையதா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். ஒட்டுமொத்தமாக, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்தும் வழிமுறைகளின் சிக்கலான தன்மையை விளக்குவதில் உள்ள சவாலை எங்கள் தரவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன. SH-SY5Y செல்களில் மைட்டோசிஸின் அளவிடக்கூடிய ஒருங்குநிலை இறுதிப் புள்ளியாக மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியலைப் படிப்பதில் TEM-இன் பயன்பாட்டை நாங்கள் முன்னிலைப்படுத்துகிறோம். கூடுதலாக, வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக இயங்குநிலை நிகழ்வுகளையும் பதிவுசெய்யும் படமாக்கல் நுட்பங்களுடன் இணைக்கப்படும்போது, ​​TEM தரவுகள் மிகவும் செழுமையான தகவல்களை வழங்குகின்றன என்பதையும் நாங்கள் முன்னிலைப்படுத்துகிறோம். நரம்பு செல் பிரிதலை ஆதரிக்கும் மூலக்கூறு ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளை மேலும் வகைப்படுத்துவது, நரம்பு மண்டலம் மற்றும் நரம்பு சிதைவு நோய்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கூறு குறித்த முக்கியமான புரிதலை வழங்கக்கூடும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்தைத் தூண்டுவதற்காக, SH-SY5Y செல்கள் 3 mM மற்றும் 5 mM சோடியம் புரோபியோனேட் (NaP) பயன்படுத்தி PPA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. TEM-க்கு முன்பு, மாதிரிகள் உயர் அழுத்த உறைதல் மற்றும் உறையவைத்தல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி கிரையோஜெனிக் மாதிரி தயாரிப்புக்கு உட்படுத்தப்பட்டன (படம் 1a). மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பாப்புலேஷன்களின் எட்டு உருவவியல் அளவுருக்களை அளவிட, நாங்கள் ஒரு தானியங்கி மைட்டோகாண்ட்ரியல் பட பகுப்பாய்வு பைப்லைனை உருவாக்கினோம். PPA சிகிச்சையானது பகுதி 2, சுற்றளவு மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் ஆகிய நான்கு அளவுருக்களைக் குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றியதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1b–e). 3 mM மற்றும் 5 mM PPA சிகிச்சை இரண்டிலும் பகுதி 2 குறிப்பிடத்தக்க வகையில் குறைந்தது (முறையே p = 0.0183 மற்றும் p = 0.002) (படம் 1b), அதே நேரத்தில் பகுதி (p = 0.003), சுற்றளவு (p = 0.0106) மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் ஆகிய அனைத்தும் குறிப்பிடத்தக்க வகையில் குறைந்தன. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது 5 mM சிகிச்சைக் குழுவில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பு (p = 0.0172) இருந்தது (படம் 1c–e). பரப்பளவு மற்றும் சுற்றளவில் ஏற்பட்ட குறிப்பிடத்தக்க குறைவுகள், 5 mM PPA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களில் சிறிய, அதிக வட்டமான மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் இருப்பதையும், மேலும் இந்தக் மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் கட்டுப்பாட்டு செல்களில் உள்ளவற்றை விடக் குறைவாக நீளமாக இருப்பதையும் காட்டின. இது, துகள் விளிம்புகளுக்கு இடையேயான மிகப்பெரிய தூரத்தில் ஏற்படும் குறைவைக் குறிக்கும் ஒரு சுயாதீனமான அளவுருவான ஃபெரெட் விட்டத்தில் ஏற்பட்ட குறிப்பிடத்தக்க குறைவுடனும் ஒத்துப்போகிறது. கிரிஸ்டேக்களின் மீநுண் அமைப்பில் மாற்றங்கள் காணப்பட்டன: PPA அழுத்தத்தின் தாக்கத்தின் கீழ் கிரிஸ்டேக்கள் குறைவாகத் தெளிவாகத் தெரிந்தன (படம் 1a, பகுதி B). இருப்பினும், எல்லாப் படங்களும் கிரிஸ்டேக்களின் மீநுண் அமைப்பைத் தெளிவாகப் பிரதிபலிக்கவில்லை, எனவே இந்த மாற்றங்களின் அளவுசார் பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்படவில்லை. இந்த TEM தரவுகள் மூன்று சாத்தியமான சூழ்நிலைகளைப் பிரதிபலிக்கக்கூடும்: (1) PPA பிளவை அதிகரிக்கிறது அல்லது இணைப்பைத் தடுக்கிறது, இதனால் ஏற்கனவே உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் அளவில் சுருங்குகின்றன; (2) மேம்படுத்தப்பட்ட உயிரியக்கவியல் புதிய, சிறிய மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களை உருவாக்குகிறது அல்லது (3) இரண்டு வழிமுறைகளையும் ஒரே நேரத்தில் தூண்டுகிறது. இந்த நிலைமைகளை TEM மூலம் வேறுபடுத்தி அறிய முடியாது என்றாலும், குறிப்பிடத்தக்க உருவவியல் மாற்றங்கள் PPA அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் சமநிலை மற்றும் இயக்கவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் குறிக்கின்றன. அதனைத் தொடர்ந்து, இந்த இயக்கவியலையும் அவற்றுக்கு அடிப்படையாக அமையக்கூடிய சாத்தியமான பொறிமுறைகளையும் மேலும் விவரிப்பதற்காக, நாங்கள் கூடுதல் அளவுருக்களை ஆராய்ந்தோம்.
புரோப்பியோனிக் அமிலம் (PPA) மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவமைப்பை மாற்றியமைக்கிறது. (அ) PPA சிகிச்சை அதிகரிக்கும்போது மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் அளவு குறைவதையும், அவை சிறியதாகவும் மேலும் வட்டமாகவும் மாறுவதையும் காட்டும் மாதிரி டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) படங்கள்; முறையே 0 mM (சிகிச்சையளிக்கப்படாதது), 3 mM மற்றும் 5 mM. சிவப்பு அம்புக்குறிகள் மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் குறிக்கின்றன. (ஆ–இ) 24 மணி நேரம் PPA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்கள் TEM-க்காகத் தயாரிக்கப்பட்டு, அதன் முடிவுகள் Fiji/ImageJ-ஐப் பயன்படுத்திப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. எட்டு அளவுருக்களில் நான்கு, கட்டுப்பாடு (சிகிச்சையளிக்கப்படாதது, 0 mM PPA) மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட (3 mM மற்றும் 5 mM PPA) செல்களுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் காட்டின. (ஆ) பகுதி 2, (இ) பரப்பளவு, (ஈ) சுற்றளவு, (உ) ஃபெரெட் விட்டம். குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை (p < 0.05) தீர்மானிக்க, ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (கட்டுப்பாடு எதிர் சிகிச்சை) மற்றும் டன்னெட்டின் பல ஒப்பீட்டுச் சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டன. தரவுப் புள்ளிகள் ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட செல்லுக்குமான சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் மதிப்பைக் குறிக்கின்றன, மற்றும் பிழைக் கோடுகள் சராசரி ± SEM-ஐக் குறிக்கின்றன. காட்டப்பட்டுள்ள தரவுகள் n = 3, ஒவ்வொரு பிரதிக்கும் குறைந்தது 24 செல்கள்; மொத்தம் 266 படங்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன; * என்பது p < 0.05 என்பதையும், ** என்பது p < 0.01 என்பதையும் குறிக்கிறது.
PPA-விற்கு மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் எவ்வாறு பதிலளிக்கிறது என்பதை மேலும் வகைப்படுத்த, நாங்கள் டெட்ராமெதில்ரோடமைன் எத்தில் எஸ்டர் (TMRE) கொண்டு மைட்டோகாண்ட்ரியாவிற்குச் சாயம் பூசி, 3 மற்றும் 5 mM PPA-வில் 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இருப்பிடத்தைக் கண்டறிந்து அளவிடுவதற்கு டைம்-லேப்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபி மற்றும் MEL பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தினோம். பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளின் சிகிச்சை. (படம் 2a). MEL பகுப்பாய்விற்குப் பிறகு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் அவற்றின் சராசரி கன அளவை அளவிடுவதற்காக மைட்டோகாண்ட்ரியா மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] அளவில் பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் ஒரு சிறிய ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். மேலும், 5 mM [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] அளவில் பிளவு [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] மற்றும் இணைவு [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] நிகழ்வுகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தன (படம் 3b). மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] மற்றும் 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] ஆகிய இரண்டு செறிவுகளிலும் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது (படம் 3c), அதே நேரத்தில் ஒவ்வொரு மைட்டோகாண்ட்ரியல் அமைப்பின் சராசரி கனஅளவும் மாறாமல் இருந்தது (படம் 3c). 3d). ஒட்டுமொத்தமாகப் பார்க்கும்போது, ​​மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியலில் ஏற்படும் மறுவடிவமைப்பு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பின் ஒருமைப்பாட்டை வெற்றிகரமாகப் பராமரிக்கும் ஒரு ஈடுசெய்யும் எதிர்வினையாகச் செயல்படுகிறது என்பதை இது உணர்த்துகிறது. 3 mM PPA அளவில் பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கை அதிகரிப்பது, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை அதிகரிப்பு ஓரளவு மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவினால் ஏற்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. ஆனால், சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கன அளவு அடிப்படையில் மாறாமல் இருப்பதால், ஒரு கூடுதல் ஈடுசெய்யும் எதிர்வினையாக உயிரியக்கவியலை நிராகரிக்க முடியாது. இருப்பினும், இந்தத் தரவுகள் TEM மூலம் காணப்பட்ட சிறிய, வட்டமான மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன. மேலும், PPA-ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் ஏற்படும் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களையும் இவை நிரூபிக்கின்றன.
புரோப்பியோனிக் அமிலம் (PPA) வலையமைப்பின் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்க, மாறும் தன்மையுடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் மறுவடிவமைப்பைத் தூண்டுகிறது. SH-SY5Y செல்கள் வளர்க்கப்பட்டு, 24 மணி நேரத்திற்கு 3 மற்றும் 5 mM PPA கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு, TMRE மற்றும் ஹோச்ஸ்ட் 33342 கொண்டு சாயமேற்றப்பட்டு, அதைத் தொடர்ந்து MEL பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. (அ) ஒவ்வொரு நிலைக்கும் நேரம் 2 (t2)-இல் உள்ள நிறம் மற்றும் இருமயமாக்கப்பட்ட அதிகபட்ச செறிவு வீழல்களைக் காட்டும் பிரதிநிதித்துவ நேர-தாமத நுண்ணோக்கிப் படங்கள். ஒவ்வொரு இருமயப் படத்திலும் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பகுதிகள் மேம்படுத்தப்பட்டு, காலப்போக்கில் ஏற்படும் இயக்கவியலை விளக்குவதற்காக மூன்று வெவ்வேறு நேரக் கட்டங்களில் (t1-t3) முப்பரிமாணத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன; இணைவு நிகழ்வுகள் பச்சை நிறத்தில் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டுள்ளன; பிளவு நிகழ்வுகள் பச்சை நிறத்தில் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டுள்ளன. சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (ஆ) ஒவ்வொரு நிலைக்கும் சராசரி மாறும் நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கை. (இ) ஒரு செல்லுக்கு சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் எண்ணிக்கை. (ஈ) ஒரு செல்லுக்கு ஒவ்வொரு மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்பின் சராசரி கன அளவு (µm3). காட்டப்பட்டுள்ள தரவுகள் ஒவ்வொரு சிகிச்சைக் குழுவிற்கும் n = 15 செல்களின் பிரதிநிதித்துவமாகும். காட்டப்பட்டுள்ள பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± SEM-ஐக் குறிக்கின்றன, அளவுகோல் பட்டை = 10 μm, * p < 0.05.
புரோப்பியோனிக் அமிலம் (PPA) மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் படியெடுத்தல் அடக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. SH-SY5Y செல்கள் 24 மணி நேரத்திற்கு 3 மற்றும் 5 mM PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. சார்பு மரபணு அளவீடு RT-qPCR ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது மற்றும் B2M க்கு இயல்பாக்கப்பட்டது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியல் மரபணுக்கள் (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 மற்றும் (d) NFE2L2. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் பிளவு மரபணுக்கள் (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 மற்றும் (i) DRP1. குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் (p < 0.05) ஒருவழி ANOVA (கட்டுப்பாடு vs. சிகிச்சை) மற்றும் டன்னெட்டின் பல ஒப்பீட்டுச் சோதனையைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டன: * p < 0.05 என்பதையும், ** p < 0.01 என்பதையும், மற்றும் **** p < 0.0001 என்பதையும் குறிக்கிறது. பட்டைகள் சராசரி வெளிப்பாடு ± SEM ஐக் குறிக்கின்றன. காட்டப்பட்டுள்ள தரவுகள் n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), மற்றும் n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) உயிரியல் பிரதிகளைக் குறிக்கின்றன.
TEM மற்றும் MEL பகுப்பாய்வுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட தரவுகள், PPA மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவமைப்பையும் இயக்கவியலையும் மாற்றியமைக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன. இருப்பினும், இந்த பிம்ப நுட்பங்கள் இந்த செயல்முறைகளை இயக்கும் அடிப்படை இயக்கமுறைகள் குறித்த உள்ளுணர்வை வழங்குவதில்லை. எனவே, PPA சிகிச்சைக்குப் பதிலளிக்கும் விதமாக, மைட்டோகாண்ட்ரிய இயக்கவியல், உயிரியக்கவியல் மற்றும் மைட்டாசிஸ் ஆகியவற்றின் ஒன்பது முக்கிய ஒழுங்குபடுத்திகளின் mRNA வெளிப்பாட்டை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். 3 mM மற்றும் 5 mM PPA உடனான 24 மணி நேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு, செல் மைலோமா ஆன்கோஜீன் (cMYC), உட்கரு சுவாசக் காரணி (NRF1), மைட்டோகாண்ட்ரியல் படியெடுத்தல் காரணி 1 (TFAM), NFE2-போன்ற படியெடுத்தல் காரணி BZIP (NFE2L2), காஸ்ட்ரின்-போன்ற புரதம் 2 (STOML2), பார்வை நரம்பு சிதைவு 1 (OPA1), மிட்டோஃபூசின் 1 (MFN1), மிட்டோஃபூசின் 2 (MFN2) மற்றும் டைனமின்-தொடர்புடைய புரதம் 1 (DRP1) ஆகியவற்றின் அளவை நாங்கள் அளவிட்டோம். நாங்கள் 3 mM (முறையே p = 0.0053, p = 0.0415 மற்றும் p < 0.0001) மற்றும் 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA சிகிச்சையைக் கவனித்தோம். (படம் 3a–c). mRNA வெளிப்பாட்டில் ஏற்பட்ட குறைவு, மருந்தளவைப் பொறுத்ததாக இருந்தது: cMYC, NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு 3 mM அளவில் முறையே 5.7, 2.6 மற்றும் 1.9 மடங்கும், 5 mM அளவில் 11.2, 3 மற்றும் 2.2 மடங்கும் குறைந்தது. இதற்கு மாறாக, மைய ரெடாக்ஸ் உயிரியக்கவியல் மரபணுவான NFE2L2, PPA-வின் எந்தவொரு செறிவிலும் மாற்றமடையவில்லை, இருப்பினும், மருந்தளவைப் பொறுத்தவாறு வெளிப்பாடு குறையும் இதேபோன்ற ஒரு போக்கு காணப்பட்டது (படம் 3d).
பிளவு மற்றும் இணைவின் ஒழுங்குமுறையில் ஈடுபட்டுள்ள பாரம்பரிய மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டையும் நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். STOML2 இணைவு, மைட்டோஃபாஜி மற்றும் உயிர்ப்பிறப்பியல் ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ளதாகக் கருதப்படுகிறது, மேலும் அதன் வெளிப்பாடு 3 mM (2.4 மடங்கு மாற்றம்) மற்றும் 5 mM (2.8 மடங்கு மாற்றம்) PPA-ஆல் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைக்கப்பட்டது (p < 0.0001) (படம் 1). 3d). இதேபோல், OPA1 இணைவு மரபணு வெளிப்பாடு 3 mM (1.6 மடங்கு மாற்றம்) மற்றும் 5 mM (1.9 மடங்கு மாற்றம்) PPA-இல் குறைக்கப்பட்டது (முறையே p = 0.006 மற்றும் p = 0.0024) (படம் 3f). இருப்பினும், 24 மணி நேர PPA அழுத்தத்தின் கீழ் இணைவு மரபணுக்களான MFN1, MFN2 அல்லது பிளவு மரபணுவான DRP1 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை நாங்கள் காணவில்லை (படம் 3g–i). மேலும், நான்கு இணைவு மற்றும் பிளவுப் புரதங்களின் (OPA1, MFN1, MFN2 மற்றும் DRP1) அளவுகள் அதே நிலைமைகளின் கீழ் மாறவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 4a–d). இந்தத் தரவுகள் ஒரு குறிப்பிட்ட காலக்கட்டத்தை மட்டுமே பிரதிபலிக்கின்றன என்பதையும், PPA அழுத்தத்தின் ஆரம்ப கட்டங்களில் புரத வெளிப்பாடு அல்லது செயல்பாட்டு நிலைகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களைப் பிரதிபலிக்காமல் இருக்கலாம் என்பதையும் கவனத்தில் கொள்வது அவசியம். இருப்பினும், cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் ஏற்படும் குறிப்பிடத்தக்க குறைவுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றில் குறிப்பிடத்தக்க படியெடுத்தல் ஒழுங்கின்மையைக் குறிக்கின்றன. மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் ஏற்படும் இறுதிநிலை மாற்றங்களை நேரடியாக ஆய்வு செய்வதற்குப் படமெடுக்கும் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை இந்தத் தரவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன.
புரோப்பியோனிக் அமில (PPA) சிகிச்சைக்குப் பிறகு இணைவு மற்றும் பிளவு காரணி புரத அளவுகள் மாறவில்லை. SH-SY5Y செல்கள் 24 மணி நேரத்திற்கு 3 மற்றும் 5 mM PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. புரத அளவுகள் வெஸ்டர்ன் பிளாட் பகுப்பாய்வு மூலம் அளவிடப்பட்டன, மேலும் வெளிப்பாட்டு அளவுகள் மொத்த புரதத்திற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. சராசரி புரத வெளிப்பாடு மற்றும் இலக்கு மற்றும் மொத்த புரதத்தின் பிரதிநிதித்துவ வெஸ்டர்ன் பிளாட்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. பட்டைகள் சராசரி ± SEM-ஐக் குறிக்கின்றன, மேலும் காட்டப்பட்டுள்ள தரவுகள் n = 3 உயிரியல் பிரதிகளின் பிரதிநிதித்துவமாகும். ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு மற்றும் டன்னெட் சோதனையைப் பயன்படுத்தி பல ஒப்பீடுகள் (p < 0.05) செய்யப்பட்டன. அசல் ஜெல் மற்றும் பிளாட் படம் S1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, வளர்சிதை மாற்ற, இருதய மற்றும் தசை நோய்கள் முதல் நரம்பியல் நோய்கள் வரையிலான பல அமைப்பு நோய்களுடன் தொடர்புடையது¹,¹⁰. பல நரம்பு சிதைவு நோய்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடையவை, இது மூளையின் வாழ்நாள் முழுவதும் இந்த நுண்ணுறுப்புகளின் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது. இந்த நோய்களில் பார்க்கின்சன் நோய், அல்சைமர் நோய் மற்றும் ASD³,⁴,¹⁸ ஆகியவை அடங்கும். இருப்பினும், இந்த நோய்களைப் பற்றி ஆய்வு செய்ய மூளைத் திசுக்களை அணுகுவது கடினம், குறிப்பாக இயக்கவியல் மட்டத்தில், இது செல்லுலார் மாதிரி அமைப்புகளை ஒரு அவசியமான மாற்றாக ஆக்குகிறது. இந்த ஆய்வில், நரம்பியல் நோய்களில், குறிப்பாக ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறுகளில் காணப்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மீண்டும் உருவாக்க, PPA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்களைப் பயன்படுத்தும் ஒரு செல்லுலார் மாதிரி அமைப்பை நாங்கள் பயன்படுத்துகிறோம். நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலைப் பற்றி ஆய்வு செய்ய இந்த PPA மாதிரியைப் பயன்படுத்துவது, ASD-யின் நோய்க்காரணவியல் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்கக்கூடும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் காண TEM-ஐப் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். அதன் செயல்திறனை அதிகரிக்க, TEM-ஐ சரியாகப் பயன்படுத்த வேண்டும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. கிரையோ-மாதிரிகளைத் தயாரிப்பது, செல்லுலார் கூறுகளை ஒரே நேரத்தில் நிலைநிறுத்துவதன் மூலமும், செயற்கைப் பிழைகள் உருவாவதைக் குறைப்பதன் மூலமும், நியூரான் கட்டமைப்புகளைச் சிறப்பாகப் பாதுகாக்க உதவுகிறது34. இதற்கு இணங்க, நியூரான் போன்ற SH-SY5Y செல்களில் சிதைவடையாத துணை-செல்லுலார் உறுப்புகளும் நீளமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவும் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1a). இது, நியூரான் செல் மாதிரிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பைப் படிப்பதற்கு கிரையோஜெனிக் தயாரிப்பு நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை எடுத்துக்காட்டுகிறது. TEM தரவுகளின் புறநிலை பகுப்பாய்விற்கு அளவுசார் அளவீடுகள் முக்கியமானவை என்றாலும், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பு மாற்றங்களை உறுதிப்படுத்த எந்த குறிப்பிட்ட அளவுருக்களை அளவிட வேண்டும் என்பதில் இன்னும் ஒருமித்த கருத்து இல்லை. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவ அமைப்பை அளவுரீதியாக ஆய்வு செய்த ஏராளமான ஆய்வுகளின் அடிப்படையில்17,31,32, நாங்கள் ஒரு தானியங்கி மைட்டோகாண்ட்ரியல் படப் பகுப்பாய்வு வழிமுறையை உருவாக்கினோம். இது எட்டு உருவ அமைப்பு அளவுருக்களை அளவிடுகிறது, அவை: பரப்பளவு, பரப்பளவு2, தோற்ற விகிதம், சுற்றளவு, வட்டத்தன்மை, டிகிரி, ஃபெரெட் விட்டம் மற்றும் உருண்டைத்தன்மை.
அவற்றுள், PPA ஆனது பகுதி 2, பரப்பளவு, சுற்றளவு மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் ஆகியவற்றைக் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைத்தது (படம் 1b–e). இது மைட்டோகாண்ட்ரியா சிறியதாகவும் மேலும் வட்டமாகவும் மாறியதைக் காட்டியது. இது, PPA30-ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்குப் பிறகு 72 மணி நேரத்தில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பரப்பளவு குறைவதைக் காட்டும் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது. இந்த உருவவியல் அம்சங்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவைக் குறிக்கலாம். இது, சேதமடைந்த கூறுகளை மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பிலிருந்து பிரித்து, மைட்டோஃபாஜி35,36,37 மூலம் அவற்றின் சிதைவை ஊக்குவிக்கத் தேவையான ஒரு செயல்முறையாகும். மறுபுறம், சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவில் ஏற்படும் குறைவானது, அதிகரித்த உயிரியக்கவியலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். இது சிறிய புதிதாக உருவாகும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவாக்கத்திற்கு வழிவகுக்கிறது. அதிகரித்த பிளவு அல்லது உயிரியக்கவியல் என்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கு எதிராக மைட்டோசிஸைப் பராமரிப்பதற்கான ஒரு ஈடுசெய்யும் எதிர்வினையாகும். இருப்பினும், குறைந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்ச்சி, குறைபாடுள்ள இணைவு அல்லது பிற நிலைமைகளை நிராகரிக்க முடியாது.
TEM மூலம் உருவாக்கப்படும் உயர்-தெளிவுத்திறன் படங்கள் தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியா மட்டத்தில் உருவவியல் பண்புகளைத் தீர்மானிக்க அனுமதித்தாலும், இந்த முறை ஒரு குறிப்பிட்ட நேரத்தில் எடுக்கப்பட்ட இரு பரிமாணப் படங்களை மட்டுமே உருவாக்குகிறது. வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கான மாறும் பதில்களைப் படிக்க, நாங்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியாவை TMRE கொண்டு சாயமேற்றி, MEL பகுப்பாய்வுடன் கூடிய டைம்-லேப்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தினோம். இது காலப்போக்கில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்களின் உயர்-செயல்திறன் கொண்ட 3D காட்சிப்படுத்தலை அனுமதிக்கிறது33,38. PPA அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் நுட்பமான ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 2). 3 mM அளவில், பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கை கணிசமாக அதிகரித்தது, அதே நேரத்தில் இணைவு நிகழ்வுகள் கட்டுப்பாட்டு மாதிரியில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தன. 5 mM PPA அளவில் பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகள் இரண்டின் எண்ணிக்கையிலும் அதிகரிப்பு காணப்பட்டது, ஆனால் இந்த மாற்றங்கள் ஏறக்குறைய விகிதாசாரமாக இருந்தன. இது அதிக செறிவுகளில் பிளவு மற்றும் இணைவு இயக்கவியல் சமநிலையை அடைகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 2b). சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கன அளவு 3 மற்றும் 5 mM PPA ஆகிய இரண்டிலும் மாறாமல் இருந்தது, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பின் ஒருமைப்பாடு பாதுகாக்கப்பட்டதைக் குறிக்கிறது (படம் 2d). மிதமான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, இயங்கு மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலைப்பின்னல்கள், வலைப்பின்னல் சிதைவை ஏற்படுத்தாமல், சமநிலையைத் திறம்படப் பராமரிக்கும் திறனை இது பிரதிபலிக்கிறது. 3 mM PPA அளவில், பிளவின் அதிகரிப்பு ஒரு புதிய சமநிலைக்கு மாறுவதை ஊக்குவிக்கப் போதுமானதாக உள்ளது, ஆனால் அதிக PPA செறிவுகளால் தூண்டப்படும் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, இன்னும் ஆழமான இயக்கவியல் மறுவடிவமைப்பு தேவைப்படுகிறது.
இரண்டு PPA அழுத்தச் செறிவுகளிலும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை அதிகரித்தது, ஆனால் சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கனஅளவு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மாறவில்லை (படம் 2c). இது அதிகரித்த உயிரியக்கவியல் அல்லது அதிகரித்த பிரிதல் காரணமாக இருக்கலாம்; இருப்பினும், சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கனஅளவில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு இல்லாத நிலையில், உயிரியக்கவியல் அதிகரிப்பதே அதிக வாய்ப்புள்ளது. ஆயினும், படம் 2-இல் உள்ள தரவுகள் இரண்டு ஈடுசெய்யும் வழிமுறைகளின் இருப்பை ஆதரிக்கின்றன: மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிரிதலின் மேம்பாட்டுடன் ஒத்துப்போகும் வகையில், பிரிதல் நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் ஒரு அதிகரிப்பு, மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியலுடன் ஒத்துப்போகும் வகையில், நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் ஒரு அதிகரிப்பு. இறுதியில், லேசான அழுத்தத்திற்கான மாறும் ஈடுசெய்தல் என்பது பிரிதல், இணைதல், உயிரியக்கவியல் மற்றும் மைட்டோஃபாஜி ஆகியவற்றை உள்ளடக்கிய ஒரே நேரத்தில் நிகழும் செயல்முறைகளைக் கொண்டிருக்கலாம். முந்தைய ஆய்வாளர்கள் PPA, மைட்டோசிஸ்30,39 மற்றும் மைட்டோஃபாஜி29 ஆகியவற்றை மேம்படுத்துகிறது என்று காட்டியிருந்தாலும், PPA-க்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிரிதல் மற்றும் இணைதல் இயக்கவியலின் மறுவடிவமைப்பிற்கான சான்றுகளை நாங்கள் வழங்குகிறோம். இந்தத் தரவுகள் TEM மூலம் காணப்பட்ட உருவவியல் மாற்றங்களை உறுதிப்படுத்துவதோடு, PPA-ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடைய வழிமுறைகள் குறித்த மேலதிகப் புரிதலையும் வழங்குகின்றன.
TEM அல்லது MEL பகுப்பாய்வு, காணப்பட்ட உருவவியல் மாற்றங்களுக்குக் காரணமான மரபணு ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளுக்கு நேரடிச் சான்றுகளை வழங்காததால், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ள மரபணுக்களின் ஆர்.என்.ஏ வெளிப்பாட்டை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். cMYC புரோட்டோ-ஆன்கோஜீன் என்பது மைட்டோகாண்ட்ரியா, கிளைகோலிசிஸ், அமினோ அமிலம் மற்றும் கொழுப்பு அமில வளர்சிதை மாற்றம் ஆகியவற்றின் ஒழுங்குமுறையில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு படியெடுத்தல் காரணியாகும்40. கூடுதலாக, cMYC ஆனது NRF1 மற்றும் TFAM41 உட்பட, மைட்டோகாண்ட்ரியல் படியெடுத்தல், மொழிபெயர்ப்பு மற்றும் சிக்கலான ஒருங்கிணைப்பு ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ள கிட்டத்தட்ட 600 மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதாக அறியப்படுகிறது. NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவை மைட்டோசிஸின் இரண்டு மைய ஒழுங்குபடுத்திகளாகும், அவை PGC-1α-க்குக் கீழ் செயல்பட்டு mtDNA நகலாக்கத்தைச் செயல்படுத்துகின்றன. இந்த வழிமுறை cAMP மற்றும் AMPK சமிக்ஞைகளால் செயல்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் ஆற்றல் செலவினம் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு உணர்திறன் கொண்டது. PPA-வின் விளைவுகள் ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியலின் ஒரு ரெடாக்ஸ் ஒழுங்குபடுத்தியான NFE2L2-ஐயும் நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.
NFE2L2 வெளிப்பாடு மாறாமல் இருந்தபோதிலும், 3 mM மற்றும் 5 mM PPA உடனான 24 மணி நேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு cMYC, NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் ஒரு சீரான, மருந்தளவைப் பொறுத்த குறைவைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3a–c). cMYC வெளிப்பாட்டின் குறைவுபடுத்தல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கான ஒரு எதிர்வினையாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது42, இதற்கு நேர்மாறாக, cMYC வெளிப்பாட்டின் குறைவுபடுத்தல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், வலையமைப்பு இணைப்பு மற்றும் சவ்வு முனைவாக்கம் ஆகியவற்றை மறுவடிவமைப்பதன் மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை ஏற்படுத்தக்கூடும்43. சுவாரஸ்யமாக, cMYC மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு மற்றும் இணைவின் ஒழுங்குமுறையிலும் ஈடுபட்டுள்ளது42,43 மற்றும் செல் பிரிவின் போது DRP1 பாஸ்போரைலேஷன் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இருப்பிடத்தை அதிகரிப்பதாகவும் அறியப்படுகிறது44, அத்துடன் நரம்பியல் தண்டு செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மறுவடிவமைப்பிற்கு மத்தியஸ்தம் செய்கிறது45. உண்மையில், cMYC குறைபாடுள்ள ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள், PPA43 அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மாற்றங்களுக்கு ஏற்ப, குறைக்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவைக் காட்டுகின்றன. இந்தத் தரவுகள் cMYC மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுக்கு இடையே ஒரு சுவாரஸ்யமான ஆனால் இதுவரை தெளிவற்ற உறவை விளக்குகின்றன, இது PPA அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மறுவடிவமைப்பு பற்றிய எதிர்கால ஆய்வுகளுக்கு ஒரு சுவாரஸ்யமான இலக்கை வழங்குகிறது.
NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவற்றின் குறைவானது, cMYC ஒரு முக்கியமான படியெடுத்தல் தூண்டியாகச் செயல்படுவதோடு ஒத்துப்போகிறது. இந்தத் தரவுகள், மனித பெருங்குடல் புற்றுநோய் செல்களில் செய்யப்பட்ட முந்தைய ஆய்வுகளுடனும் ஒத்துப்போகின்றன. அந்த ஆய்வுகள், PPA ஆனது 22 மணி நேரத்தில் NRF1 mRNA வெளிப்பாட்டைக் குறைத்தது என்றும், இது ATP குறைபாடு மற்றும் அதிகரித்த ROS46 உடன் தொடர்புடையது என்றும் காட்டின. இந்த ஆய்வாளர்கள், TFAM வெளிப்பாடு 8.5 மணி நேரத்தில் அதிகரித்து, 22 மணி நேரத்தில் அதன் அடிப்படை நிலைக்குத் திரும்பியது என்றும் தெரிவித்தனர். இதற்கு மாறாக, கிம் மற்றும் குழுவினர் (2019) SH-SY5Y செல்களில் 4 மணி நேர PPA அழுத்தத்திற்குப் பிறகு TFAM mRNA வெளிப்பாடு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைந்ததைக் காட்டினர்; இருப்பினும், 72 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, TFAM புரத வெளிப்பாடு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது மற்றும் mtDNA நகல்களின் எண்ணிக்கையும் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது. எனவே, 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு நாம் கண்டறிந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியல் மரபணுக்களின் எண்ணிக்கைக் குறைவானது, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை அதிகரிப்பு முந்தைய நேரங்களில் உயிரியக்கவியல் செயல்படுத்தலுடன் தொடர்புடையது என்ற சாத்தியக்கூற்றை நிராகரிக்கவில்லை. முந்தைய ஆய்வுகள், SH-SY5Y செல்களில் 4 மணி 30 நிமிடங்களில் PPA ஆனது PGC-1α mRNA மற்றும் புரதத்தை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரிக்கிறது என்பதையும், அதே நேரத்தில் கன்று ஹெபடோசைட்டுகளில் 12 மணி 39 நிமிடங்களில் புரோபியோனிக் அமிலம் PGC-1α வழியாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியலை மேம்படுத்துகிறது என்பதையும் காட்டியுள்ளன. சுவாரஸ்யமாக, PGC-1α ஆனது NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவற்றின் நேரடி படியெடுத்தல் சீராக்கியாக இருப்பது மட்டுமல்லாமல், பிளவு மற்றும் இணைவை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் MFN2 மற்றும் DRP1 ஆகியவற்றின் செயல்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்துவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது47. இவை அனைத்தும் சேர்ந்து, PPA-ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஈடுசெய்யும் பதில்களை ஒழுங்குபடுத்தும் வழிமுறைகளின் நெருங்கிய இணைப்பை எடுத்துக்காட்டுகின்றன. மேலும், PPA அழுத்தத்தின் கீழ் உயிரியக்கவியல் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றத்தின் படியெடுத்தல் ஒழுங்குமுறையில் குறிப்பிடத்தக்க சீர்குலைவை எங்கள் தரவுகள் பிரதிபலிக்கின்றன.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 மற்றும் DRP1 மரபணுக்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு, இணைவு மற்றும் இயக்கவியலின் மைய ஒழுங்குபடுத்திகளில் அடங்கும்37,48,49. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் பல பிற மரபணுக்களும் ஈடுபட்டுள்ளன, இருப்பினும், STOML2, OPA1 மற்றும் MFN2 ஆகியவை ASD குழுக்களில் வேறுபட்ட மெத்திலேற்றம் செய்யப்பட்டுள்ளதாக முன்னர் கண்டறியப்பட்டுள்ளது,16 மேலும் பல சுயாதீன ஆய்வுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக இந்த படியெடுத்தல் காரணிகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களைப் பதிவு செய்துள்ளன50,51, 52. 3 mM மற்றும் 5 mM PPA சிகிச்சையால் OPA1 மற்றும் STOML2 இரண்டின் வெளிப்பாடும் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைக்கப்பட்டது (படம் 3e, f). OPA1 என்பது MFN1 மற்றும் 2 உடன் நேரடி தொடர்பு மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவின் பாரம்பரிய ஒழுங்குபடுத்திகளில் ஒன்றாகும், மேலும் இது கிரிஸ்டே மறுவடிவமைப்பு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் ஒரு பங்கைக் கொண்டுள்ளது53. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் STOML2 இன் துல்லியமான பங்கு இன்னும் தெளிவாக இல்லை, ஆனால் அது மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு, உயிரியக்கவியல் மற்றும் மைட்டோஃபாஜியில் ஒரு பங்கைக் கொண்டுள்ளது என்று சான்றுகள் தெரிவிக்கின்றன.
STOML2, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச இணைப்பைப் பராமரிப்பதிலும், சுவாசச் சங்கிலி வளாகங்களை உருவாக்குவதிலும் ஈடுபட்டுள்ளது54,55 மேலும் இது புற்றுநோய் செல்களின் வளர்சிதை மாற்றப் பண்புகளை ஆழமாக மாற்றுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது56. BAN மற்றும் கார்டியோலிபினுடன் இடைவினை புரிவதன் மூலம் STOML2, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு ஆற்றலையும் உயிரியக்கவியலையும் ஊக்குவிக்கிறது என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன55, 57, 58. கூடுதலாக, STOML2 மற்றும் PINK1 இடையேயான இடைவினை மைட்டோஃபாஜியை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்று தனிப்பட்ட ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன59,60. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், STOML2 நேரடியாக MFN2 உடன் இடைவினை புரிந்து அதை நிலைப்படுத்துவதாகவும், OPA1 சிதைவுக்குக் காரணமான புரோட்டியேஸைத் தடுப்பதன் மூலம் நீண்ட OPA1 ஐசோஃபார்ம்களை நிலைப்படுத்துவதில் ஒரு முக்கியப் பங்கை வகிப்பதாகவும் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது53,61,62. PPA வினைகளில் காணப்படும் STOML2 வெளிப்பாட்டின் குறைவு, இந்த இணைவுப் புரதங்களை யூபிகுவின் மற்றும் புரோட்டியோசோம் சார்ந்த பாதைகள் வழியாக சிதைவுக்கு உள்ளாவதற்கு அதிக வாய்ப்புள்ளதாக மாற்றக்கூடும்48. PPA-விற்கான மாறும் பதிலில் STOML2 மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றின் துல்லியமான பங்கு தெளிவாகத் தெரியவில்லை என்றாலும், இந்த இணைவு மரபணுக்களின் குறைக்கப்பட்ட வெளிப்பாடு (படம் 3), பிளவு மற்றும் இணைவுக்கு இடையிலான சமநிலையை சீர்குலைத்து, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் அளவு குறைவதற்கு வழிவகுக்கலாம் (படம் 3). 1).
மறுபுறம், 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகும் OPA1 புரத வெளிப்பாடு மாறாமல் இருந்தது, அதே சமயம் PPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு MFN1, MFN2 அல்லது DRP1 ஆகியவற்றின் mRNA மற்றும் புரத அளவுகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மாறவில்லை (படம் 3g-i, படம் 4). மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் பிளவில் ஈடுபட்டுள்ள இந்தக் காரணிகளின் ஒழுங்குமுறையில் எந்த மாற்றங்களும் இல்லை என்பதை இது குறிக்கலாம். இருப்பினும், இந்த நான்கு மரபணுக்களில் ஒவ்வொன்றும் புரதச் செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய மாற்றங்களாலும் (PTMs) ஒழுங்குபடுத்தப்படுகின்றன என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. OPA1 எட்டு மாற்றுப் பிளவு வகைகளைக் கொண்டுள்ளது, அவை மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் புரதச்சிதைவு மூலம் பிளவுபட்டு இரண்டு தனித்துவமான ஐசோஃபார்ம்களை உருவாக்குகின்றன 63. நீண்ட மற்றும் குறுகிய ஐசோஃபார்ம்களுக்கு இடையிலான சமநிலை, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பைப் பராமரிப்பதில் OPA1 இன் பங்கை இறுதியில் தீர்மானிக்கிறது 64. DRP1 செயல்பாடு கால்சியம்/கால்மோடூலின் சார்ந்த புரத கைனேஸ் II (CaMKII) பாஸ்போரிலேஷனால் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது, அதே சமயம் DRP1 சிதைவு யூபிகுவிடினேஷன் மற்றும் SUMOylation மூலம் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது 65. இறுதியாக, DRP1 மற்றும் MFN1/2 ஆகிய இரண்டும் GTPase-கள் ஆகும், எனவே மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் GTP உற்பத்தியின் விகிதத்தால் அவற்றின் செயல்பாடு பாதிக்கப்படலாம் 66. எனவே, இந்தப் புரதங்களின் வெளிப்பாடு நிலையானதாக இருந்தாலும், இது மாறாத புரதச் செயல்பாட்டையோ அல்லது இருப்பிடத்தையோ பிரதிபலிக்காது 67,68. உண்மையில், தற்போதுள்ள PTM புரதத் தொகுப்புகள், கடுமையான மன அழுத்த எதிர்வினைகளை மத்தியஸ்தம் செய்வதற்குப் பொறுப்பான முதல் நிலை பாதுகாப்பாக அடிக்கடி செயல்படுகின்றன. நமது மாதிரியில் மிதமான வளர்சிதை மாற்ற மன அழுத்தம் இருக்கும்போது, ​​mRNA அல்லது புரத மட்டத்தில் இந்த மரபணுக்களின் கூடுதல் செயல்படுத்தல் தேவைப்படாமல், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் ஒருமைப்பாட்டைப் போதுமான அளவு மீட்டெடுக்க, PTM ஆனது இணைவு மற்றும் பிளவு புரதங்களின் அதிகரித்த செயல்பாட்டை ஊக்குவிக்கிறது என்பது சாத்தியம்.
ஒட்டுமொத்தமாக, மேற்கண்ட தரவுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவமைப்பின் சிக்கலான மற்றும் காலத்தைச் சார்ந்த ஒழுங்குமுறையையும், இந்த வழிமுறைகளைத் தெளிவுபடுத்துவதில் உள்ள சவால்களையும் எடுத்துக்காட்டுகின்றன. மரபணு வெளிப்பாட்டை ஆய்வு செய்ய, முதலில் அந்தப் பாதையில் உள்ள குறிப்பிட்ட இலக்கு மரபணுக்களை அடையாளம் காண்பது அவசியம். இருப்பினும், ஒரே பாதையில் உள்ள மரபணுக்கள் ஒரே அழுத்தத்திற்கு ஒரே மாதிரியாகப் பதிலளிப்பதில்லை என்பதை எங்கள் தரவுகள் காட்டுகின்றன. உண்மையில், ஒரே பாதையில் உள்ள வெவ்வேறு மரபணுக்கள் வெவ்வேறு தற்காலிகப் பதிலளிப்பு விவரங்களைக் காட்டக்கூடும் என்று முந்தைய ஆய்வுகள் நிரூபித்துள்ளன30,46. மேலும், படியெடுத்தலுக்கும் மரபணுச் செயல்பாட்டிற்கும் இடையிலான உறவைச் சீர்குலைக்கும் சிக்கலான படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய வழிமுறைகளும் உள்ளன. புரோட்டியோமிக் ஆய்வுகள், படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய வழிமுறைகள் மற்றும் புரதச் செயல்பாட்டின் தாக்கம் குறித்த நுண்ணறிவை வழங்க முடியும், ஆனால் அவை குறைந்த செயல்திறன் முறைகள், அதிக சமிக்ஞை-இரைச்சல் விகிதங்கள் மற்றும் மோசமான தெளிவுத்திறன் உள்ளிட்ட சவால்களையும் முன்வைக்கின்றன.
இந்தச் சூழலில், TEM மற்றும் MEL-ஐப் பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியலைப் படிப்பது, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியல் மற்றும் செயல்பாட்டிற்கு இடையிலான உறவு மற்றும் இது நோயை எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பது பற்றிய அடிப்படைக் கேள்விகளுக்குப் பதிலளிப்பதற்கான பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டுள்ளது. மிக முக்கியமாக, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயலிழப்பு மற்றும் இயக்கவியலின் ஒருங்குசேரும் இறுதிப் புள்ளியாக மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியலை அளவிடுவதற்கு TEM ஒரு நேரடி முறையை வழங்குகிறது51. MEL ஆனது, ஒரு முப்பரிமாண செல்லுலார் சூழலில் பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளைக் காட்சிப்படுத்துவதற்கான ஒரு நேரடி முறையையும் வழங்குகிறது, இது மரபணு வெளிப்பாட்டில் மாற்றங்கள் இல்லாதபோதும் கூட, மாறும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மறுவடிவமைப்பை அளவிட அனுமதிக்கிறது33. இரண்டாம் நிலை மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் படமெடுக்கும் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை இங்கே நாம் முன்னிலைப்படுத்துகிறோம். இந்த நோய்கள் பொதுவாக, கடுமையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் சேதத்தை விட, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலைப்பின்னல்களின் நுட்பமான மறுவடிவமைப்பால் வகைப்படுத்தப்படும் நாள்பட்ட லேசான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்தால் வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், நாள்பட்ட அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோசிஸைப் பராமரிக்கத் தேவையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஈடுசெய்தல், ஆழமான செயல்பாட்டு விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது. நரம்பியல் சூழலில், இந்த ஈடுசெய்யும் வழிமுறைகளைப் பற்றிய சிறந்த புரிதல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடைய பன்மை விளைவு நரம்பியல் நோயியல் பற்றிய முக்கியமான தகவல்களை வழங்கக்கூடும்.
இறுதியாக, நரம்பணுக்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்தும் மரபணு வெளிப்பாடு, புரத மாற்றங்கள் மற்றும் புரதச் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சிக்கலான இடைவினைகளின் செயல்பாட்டு விளைவுகளைப் புரிந்துகொள்வதில், பிம்ப நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை எங்கள் தரவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன. ASD-யின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கூறு குறித்த நுண்ணறிவைப் பெறுவதற்காக, ஒரு நரம்பணு மாதிரியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மாதிரியாக்க நாங்கள் PPA-வைப் பயன்படுத்தினோம். PPA-வால் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் மாற்றங்களைக் காட்டின: TEM மூலம் பார்க்கும்போது, ​​மைட்டோகாண்ட்ரியா சிறியதாகவும் வட்டமாகவும் மாறின, மேலும் கிரிஸ்டேக்கள் தெளிவற்று இருந்தன. லேசான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலையமைப்பைப் பராமரிப்பதற்காக, பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளின் அதிகரிப்புடன் இந்த மாற்றங்கள் ஒரே நேரத்தில் நிகழ்கின்றன என்பதை MEL பகுப்பாய்வு காட்டுகிறது. மேலும், PPA மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் சமநிலையின் படியெடுத்தல் ஒழுங்குமுறையை கணிசமாக சீர்குலைக்கிறது. PPA அழுத்தத்தால் சீர்குலைக்கப்பட்ட முக்கிய மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஒழுங்குபடுத்திகளாக cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம்; இவை மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் செயல்பாட்டில் PPA-வால் தூண்டப்பட்ட மாற்றங்களுக்கு ஒரு பங்கைக் கொண்டிருக்கலாம். மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் புரதச் செயல்பாடு, இருப்பிடம் மற்றும் மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய மாற்றங்களில் PPA-வால் தூண்டப்பட்ட தற்காலிக மாற்றங்களை நன்கு வகைப்படுத்த எதிர்கால ஆய்வுகள் தேவைப்படுகின்றன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்த எதிர்வினையை நெறிப்படுத்தும் ஒழுங்குமுறைப் பொறிமுறைகளின் சிக்கலான தன்மையையும் ஒன்றையொன்று சார்ந்திருக்கும் தன்மையையும் எங்கள் தரவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன; மேலும், மிகவும் இலக்கு சார்ந்த பொறிமுறை ஆய்வுகளுக்கு TEM மற்றும் பிற படமெடுக்கும் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டையும் அவை நிரூபிக்கின்றன.
SH-SY5Y செல் வரிசை (ECACC, 94030304-1VL) சிக்மா-ஆல்ட்ரிச் நிறுவனத்திடமிருந்து வாங்கப்பட்டது. SH-SY5Y செல்கள், 20% கரு மாட்டு சீரம் (FBS) (10493106, தெர்மோஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 1% பென்சிலின்-ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (P4333-20ML, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) ஆகியவற்றால் செறிவூட்டப்பட்ட 25 செ.மீ² குடுவைகளில், 37 °C வெப்பநிலை மற்றும் 5% CO₂ சூழலில், டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் மீடியம்/F-12 ஊட்டச்சத்துக் கலவை (DMEM/F-12) மற்றும் எல்-குளுட்டமைன் (SC09411, சயின்செல்) ஆகியவற்றில் வளர்க்கப்பட்டன. 0.05% டிரிப்சின்-EDTA (15400054, தெர்மோஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி, செல்கள் 80% அடர்த்திக்கு துணை வளர்ப்பு செய்யப்பட்டு, 300 g வேகத்தில் மையவிலக்கி செய்யப்பட்டு, தோராயமாக 7 × 10⁵ செல்கள்/மிலி அடர்த்தியில் தட்டுகளில் இடப்பட்டன. அனைத்து சோதனைகளும் 19–22 தலைமுறைகளுக்கு இடைப்பட்ட வேறுபடுத்தப்படாத SH-SY5Y செல்களில் செய்யப்பட்டன. PPA, NaP ஆக நிர்வகிக்கப்படுகிறது. NaP தூளை (CAS எண். 137-40-6, வேதியியல் சூத்திரம் C3H5NaO2, P5436-100G, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) வெதுவெதுப்பான மில்லிQ நீரில் 1 M செறிவுக்குக் கரைத்து, 4 °C இல் சேமிக்கவும். சிகிச்சை நாளன்று, இந்தக் கரைசலை 1 M PPA உடன் சேர்த்து, சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் (L-குளுட்டமைனுடன் கூடிய DMEM/F-12) 3 mM மற்றும் 5 mM PPA ஆக நீர்க்கவும். அனைத்து சோதனைகளுக்குமான சிகிச்சைச் செறிவுகள், PPA இல்லாத நிலை (0 mM, கட்டுப்பாடு), 3 mM, மற்றும் 5 mM PPA என இருந்தன. சோதனைகள் குறைந்தபட்சம் மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் மேற்கொள்ளப்பட்டன.
SH-SY5Y செல்கள் 25 cm5 குடுவைகளில் 5.5 × 105 செல்கள்/மிலி என்ற விகிதத்தில் இடப்பட்டு 24 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. அடைகாக்கும் 24 மணி நேரத்திற்கு முன்பு குடுவையில் PPA சிகிச்சை சேர்க்கப்பட்டது. சாதாரண பாலூட்டி திசு துணை வளர்ப்பு நெறிமுறைகளைப் பின்பற்றி (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளது) செல் துகள்களை சேகரிக்கவும். செல் துகளை 100 µl 2.5% குளுடரால்டிஹைட், 1× PBS இல் மீண்டும் கரைத்து, செயலாக்கும் வரை 4 °C இல் சேமிக்கவும். செல்களைத் துகள்களாக்கவும் மற்றும் 2.5% குளுடரால்டிஹைட், 1× PBS கரைசலை அகற்றவும் SH-SY5Y செல்கள் சுருக்கமாக மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன. படிமத்தை, காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் தயாரிக்கப்பட்ட 4% அகரோஸ் கூழில் மீண்டும் கரைக்கவும் (அகரோஸ் மற்றும் படிமத்தின் கன அளவு விகிதம் 1:1). அகரோஸ் துண்டுகள் தட்டையான தட்டுகளில் உள்ள கட்டங்களில் வைக்கப்பட்டு, உயர் அழுத்த உறைநிலைக்கு முன் 1-ஹெக்ஸாடெசீனால் பூசப்பட்டன. மாதிரிகள் 100% உலர்ந்த அசிட்டோனில் -90°C வெப்பநிலையில் 24 மணி நேரம் உறைய வைக்கப்பட்டன. பின்னர் வெப்பநிலை -80°C ஆக உயர்த்தப்பட்டு, 1% ஆஸ்மியம் டெட்ராக்சைடு மற்றும் 0.1% குளுடரால்டிஹைடு கரைசல் சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரிகள் -80°C வெப்பநிலையில் 24 மணி நேரம் சேமிக்கப்பட்டன. இதற்குப் பிறகு, வெப்பநிலை பல நாட்களில் படிப்படியாக அறை வெப்பநிலைக்கு உயர்த்தப்பட்டது: –80°C இலிருந்து –50°C க்கு 24 மணி நேரம், –30°C க்கு 24 மணி நேரம், –10°C க்கு 24 மணி நேரம் மற்றும் இறுதியாக அறை வெப்பநிலை.
குறைந்த வெப்பநிலைத் தயாரிப்பிற்குப் பிறகு, மாதிரிகளில் பிசின் செறிவூட்டப்பட்டு, லெய்கா ரீச்செர்ட் அல்ட்ராக்கட்ஸ் அல்ட்ராமைக்ரோடோமை (லெய்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தி மிக மெல்லிய பிரிவுகள் (∼100 நானோமீட்டர்) உருவாக்கப்பட்டன. அந்தப் பிரிவுகள் 2% யுரேனைல் அசிடேட் மற்றும் லெட் சிட்ரேட் கொண்டு சாயமிடப்பட்டன. மாதிரிகள், 200 kV-ல் (Lab6 டிரான்ஸ்மிட்டர்) இயங்கும் FEI டெக்னாய் 20 டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோப் (தெர்மோஃபிஷர் (முன்னர் FEI), ஐந்தோவன், நெதர்லாந்து) மற்றும் டிரைடியம் ஆற்றல் வடிகட்டி பொருத்தப்பட்ட கேடன் CCD கேமரா (கேடன், இங்கிலாந்து) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி உற்றுநோக்கப்பட்டன.
ஒவ்வொரு தொழில்நுட்ப நகலிலும், குறைந்தது 24 ஒற்றை செல் படங்கள் எடுக்கப்பட்டு, மொத்தம் 266 படங்கள் கிடைத்தன. அனைத்துப் படங்களும் ஆர்வப் பகுதி (ROI) மேக்ரோ மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியா மேக்ரோ ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மைட்டோகாண்ட்ரியா மேக்ரோ, வெளியிடப்பட்ட முறைகள்¹⁷,³¹,³²-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டது மற்றும் Fiji/ImageJ⁶⁹-இல் TEM படங்களின் பகுதி-தானியங்கி தொகுதி செயலாக்கத்தை அனுமதிக்கிறது. சுருக்கமாகச் சொன்னால்: உருளும் பந்து பின்னணி கழித்தல் (60 பிக்சல் ஆரம்) மற்றும் ஒரு FFT பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி (முறையே 60 மற்றும் 8 பிக்சல் மேல் மற்றும் கீழ் வரம்புகளைப் பயன்படுத்தி) மற்றும் 5% திசையமைவு சகிப்புத்தன்மையுடன் செங்குத்துக் கோடு அடக்குதல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி படம் தலைகீழாக்கப்பட்டு மீண்டும் தலைகீழாக்கப்படுகிறது. செயலாக்கப்பட்ட படம், அதிகபட்ச என்ட்ரோபி வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி தானாகவே வரம்பிடப்பட்டு, ஒரு இரும முகமூடி உருவாக்கப்படுகிறது. மூல TEM படங்களில் கைமுறையாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ROI-களுடன் தொடர்புடைய படப் பகுதிகள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் பண்புகள் விவரிக்கப்பட்டன, மேலும் பிளாஸ்மா சவ்வு மற்றும் பிற அதிக மாறுபாடுள்ள பகுதிகள் விலக்கப்பட்டன. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு ROI-க்கும், 600 பிக்சல்களை விடப் பெரிய இருமத் துகள்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மேலும், Fiji/ImageJ-இன் உள்ளமைக்கப்பட்ட அளவீட்டுச் செயல்பாடுகளைப் பயன்படுத்தி துகள் பரப்பளவு, சுற்றளவு, முதன்மை மற்றும் துணை அச்சுகள், ஃபெரெட் விட்டம், உருண்டைத்தன்மை மற்றும் வட்டவடிவம் ஆகியவை அளவிடப்பட்டன. மெரில், ஃபிளிப்போ மற்றும் ஸ்ட்ராக் (2017)-ஐப் பின்பற்றி, இந்தத் தரவுகளிலிருந்து பரப்பளவு 2, துகள் தோற்ற விகிதம் (முதன்மை மற்றும் துணை அச்சு விகிதம்) மற்றும் வடிவக் காரணி (FF) ஆகியவை கணக்கிடப்பட்டன, இங்கு FF = சுற்றளவு 2/4pi x பரப்பளவு. அளவுரு சூத்திரத்தின் வரையறையை மெரில், ஃபிளிப்போ மற்றும் ஸ்ட்ராக் (2017)-இல் காணலாம். குறிப்பிடப்பட்ட மேக்ரோக்கள் GitHub-இல் கிடைக்கின்றன (தரவு கிடைக்கும் தன்மை அறிக்கையைப் பார்க்கவும்). சராசரியாக, ஒவ்வொரு PPA சிகிச்சைக்கும் சுமார் 5,600 துகள்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, மொத்தமாக சுமார் 17,000 துகள்கள் (தரவு காட்டப்படவில்லை).
SH-SH5Y செல்கள், இரவு முழுவதும் ஒட்டிக்கொள்ள அனுமதிப்பதற்காக 8-அறை வளர்ப்புத் தட்டுகளில் (தெர்மோஃபிஷர், #155411) வைக்கப்பட்டன. பின்னர் அவை TMRE 1:1000 (தெர்மோஃபிஷர், #T669) மற்றும் ஹோச்ஸ்ட் 33342 1:200 (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், H6024) சாயமேற்றலுடன் அடைகாக்கப்பட்டன. 10 நிமிடச் சூழலில் 405 nm மற்றும் 561 nm லேசர்களைப் பயன்படுத்திப் படங்கள் பெறப்பட்டன. மேலும், அடுத்தடுத்த 12 நேரப் புள்ளிகளில், படச்சட்டங்களுக்கு இடையில் 0.2 μm az படியுடன் 10 பட நுண்படங்களைக் கொண்ட z-அடுக்குகளாக மூலப் படங்கள் பெறப்பட்டன. LCI பிளான் அப்போக்ரோமேட் 100x/1.4 ஆயில் DIC M27 லென்ஸைப் பயன்படுத்தி, கார்ல் செய்ஸ் LSM780 ELYRA PS.1 சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் பிளாட்ஃபார்ம் (கார்ல் செய்ஸ், ஓபர்கோசென், ஜெர்மனி) மூலம் படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன. முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட செயல்முறை மற்றும் ImageJ செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தி, இணைவு மற்றும் பிளவு நிகழ்வுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் சராசரி எண்ணிக்கை மற்றும் ஒரு செல்லுக்கான சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கனஅளவு³³ ஆகியவற்றை அளவிட, படங்கள் ImageJ-இல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. MEL மேக்ரோக்கள் GitHub-இல் கிடைக்கின்றன (தரவு கிடைக்கும் தன்மை அறிக்கையைப் பார்க்கவும்).
SH-SY5Y செல்கள், சிகிச்சைக்கு முன் 24 மணி நேரத்திற்கு, ஆறு-குழித் தட்டுகளில் 0.3 × 10⁶ செல்கள்/mL என்ற அடர்த்தியில் வளர்க்கப்பட்டன. RNA, Quick-RNA™ Miniprep நெறிமுறையை (ZR R1055, Zymo Research) பயன்படுத்தி, சில சிறிய மாற்றங்களுடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது: ஒவ்வொரு குழியையும் அகற்றுவதற்கு முன் 300 μl RNA லைசிஸ் பஃபரைச் சேர்க்கவும், மேலும் இறுதிப் படியாக ஒவ்வொரு மாதிரியையும் 30 μl DNase/RNase எலுஷன் கொண்டு லைஸ் செய்யவும். நானோட்ராப் ND-1000 UV-Vis ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி அனைத்து மாதிரிகளின் அளவும் தரமும் சரிபார்க்கப்பட்டன. செல் லைசேட்டுகளிலிருந்து மொத்தப் புரதம் 200 μl RIPA லைசிஸ் பஃபரைப் பயன்படுத்திப் பெறப்பட்டது, மேலும் புரதச் செறிவு பிராட்போர்டு புரத மதிப்பீடு70-ஐப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது.
சில மாற்றங்களுடன், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி டெட்ரோ™ cDNA தொகுப்பு கிட் (BIO-65043, மெரிடியன் பயோசயின்ஸ்) பயன்படுத்தி cDNA தொகுப்பு செய்யப்பட்டது. 0.7 முதல் 1 μg மொத்த RNA-ஐப் பயன்படுத்தி 20-μl வினைக்கலவைகளில் cDNA தொகுக்கப்பட்டது. முன்னர் வெளியிடப்பட்ட ஆய்வுக் கட்டுரைகள் 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (அட்டவணை S1) ஆகியவற்றிலிருந்து பிரைமர்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, மேலும் அதனுடன் இணைந்த புரோப்கள் இன்டகிரேட்டட் டிஎன்ஏ டெக்னாலஜிஸின் பிரைமர்குவெஸ்ட் கருவியைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டன. ஆர்வமுள்ள அனைத்து மரபணுக்களும் உட்கரு B2M மரபணுவிற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றின் மரபணு வெளிப்பாடு RT-qPCR மூலம் அளவிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு வினைக்கும் 10 μL இறுதி கனஅளவைப் பெறுவதற்காக, மாஸ்டர் மிக்ஸில் லூனா டாக் பாலிமரேஸ் (M3003L, நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்), 10 μM ஃபார்வர்டு மற்றும் ரிவர்ஸ் பிரைமர்கள், cDNA, மற்றும் PCR-தர நீர் ஆகியவை அடங்கியிருந்தன. பிரிவு மற்றும் பிளவு மரபணுக்களின் (DRP1, MFN1/2) வெளிப்பாடு, டாக்மேன் மல்டிபிளக்ஸ் அஸ்ஸேக்களைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. லூனா யுனிவர்சல் ப்ரோப் qPCR மாஸ்டர் மிக்ஸ் (M3004S, நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்), உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி சிறிய மாற்றங்களுடன் பயன்படுத்தப்பட்டது. மல்டிபிளக்ஸ் RT-qPCR மாஸ்டர் மிக்ஸில் 1X லூனா டாக் பாலிமரேஸ், 10 μM ஃபார்வர்டு மற்றும் ரிவர்ஸ் பிரைமர்கள், 10 μM ப்ரோப், cDNA, மற்றும் PCR-தர நீர் ஆகியவை அடங்கியுள்ளன, இதன் விளைவாக ஒவ்வொரு வினைக்கும் 20 μL இறுதி கனஅளவு கிடைக்கிறது. ரோட்டார்-ஜீன் Q 6-பிளெக்ஸ் (QIAGEN RG—வரிசை எண்: R0618110) பயன்படுத்தி RT-qPCR செய்யப்பட்டது. சுழற்சி நிலைமைகள் அட்டவணை S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. அனைத்து cDNA மாதிரிகளும் மும்மடங்காகப் பெருக்கப்பட்டு, பத்து மடங்கு நீர்த்தல் தொடரைப் பயன்படுத்தி ஒரு தரநிலை வளைவு உருவாக்கப்பட்டது. தரவு மறுஉருவாக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக, சுழற்சி வரம்பு திட்ட விலக்கம் (Ct) >0.5 கொண்ட மும்மடங்கு மாதிரிகளில் உள்ள புறத்தளவுகள் பகுப்பாய்விலிருந்து நீக்கப்பட்டன30,72. சார்பு மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCt79 முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.
புரத மாதிரிகள் (60 μg) 2:1 என்ற விகிதத்தில் லேம்லி லோடிங் பஃபருடன் கலக்கப்பட்டு, 12% நிறமற்ற புரத ஜெல் (பயோ-ராட் #1610184) மீது செலுத்தப்பட்டன. டிரான்ஸ்-பிளாட் டர்போ சிஸ்டம் (#170-4155, பயோ-ராட்) பயன்படுத்தி, புரதங்கள் ஒரு PVDF (பாலிவினைலிடீன் ஃபுளோரைடு) மென்படலத்திற்கு (#170-84156, பயோ-ராட்) மாற்றப்பட்டன. அந்த மென்படலம் தடுக்கப்பட்டு, பொருத்தமான முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் (OPA1, MFN1, MFN2, மற்றும் DRP1) (1:1000 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டது) உடன் 48 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து, இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் (1:10,000) உடன் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர், கிளாரிட்டி வெஸ்டர்ன் ECL சப்ஸ்ட்ரேட் (#170-5061, பயோ-ராட்) பயன்படுத்தி மென்படலங்கள் படமாக்கப்பட்டு, பயோ-ராட் கெமிடாக் MP சிஸ்டம் மூலம் பதிவு செய்யப்பட்டன. வெஸ்டர்ன் பிளாட் பகுப்பாய்விற்காக இமேஜ்லேப் பதிப்பு 6.1 பயன்படுத்தப்பட்டது. அசல் ஜெல் மற்றும் பிளாட் ஆகியவை படம் S1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. ஆன்டிபாடி தகவல்கள் அட்டவணை S2-இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
தரவுத் தொகுப்புகள், குறைந்தது மூன்று சுயாதீன மாதிரிகளின் சராசரி மற்றும் சராசரியின் திட்டப் பிழையாக (SEM) வழங்கப்படுகின்றன. காஸியன் பரவல் மற்றும் சமமான திட்ட விலகல்களைக் கருதி, பகுப்பாய்வுகளைத் தொடர்வதற்கு முன், தரவுத் தொகுப்புகள் ஷாபிரோ-வில்க்ஸ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி (வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்பட்டாலன்றி) இயல்புநிலைக்காகச் சோதிக்கப்பட்டன. தரவுத் தொகுப்பைப் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு மேலதிகமாக, ஃபிஷரின் MEL LSD (p < 0.05), ஒருவழி ANOVA (சிகிச்சை மற்றும் கட்டுப்பாட்டு சராசரிக்கு எதிராக), மற்றும் முக்கியத்துவத்தைத் தீர்மானிக்க டன்னெட்டின் பல ஒப்பீட்டுச் சோதனை (p < 0.05) ஆகியவையும் பயன்படுத்தப்பட்டன. குறிப்பிடத்தக்க p மதிப்புகள் வரைபடத்தில் *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 எனக் காட்டப்பட்டுள்ளன. அனைத்து புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வுகளும் வரைபடங்களும் GraphPad Prism 9.4.0-ஐப் பயன்படுத்திச் செய்யப்பட்டன மற்றும் உருவாக்கப்பட்டன.
TEM படப் பகுப்பாய்விற்கான Fiji/ImageJ மேக்ரோக்கள் GitHub-இல் பொதுவில் கிடைக்கின்றன: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு இருப்பிடங்காட்டி (MEL) மேக்ரோ GitHub-இல் பொதுவில் கிடைக்கிறது: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
மெய்லியானா ஏ., தேவி என்.எம் மற்றும் விஜயா ஏ. மைட்டோகாண்ட்ரியா: வளர்சிதை மாற்றம், சமநிலை, மன அழுத்தம், முதுமை மற்றும் புறமரபியல் ஆகியவற்றின் முதன்மை ஒழுங்குபடுத்திகள். இந்தோனேசிய உயிரியல் மருத்துவ அறிவியல் இதழ். 13, 221–241 (2021).
பென்-ஷச்சார், டி. ஸ்கிசோஃப்ரினியாவில் பன்முக மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, காம்ப்ளக்ஸ் I ஒரு சாத்தியமான நோயியல் இலக்காக. ஸ்கிசோஃப்ரினியா. ரிசோர்ஸ். 187, 3–10 (2017).
போஸ், ஏ. மற்றும் பீல், எம்.எஃப். பார்க்கின்சன் நோயில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு. ஜே. நியூரோகெமிஸ்ட்ரி. 139, 216–231 (2016).
ஷர்மா வி.கே., சிங் டி.ஜி. மற்றும் மேத்தா வி. அழுத்தத்திற்கு உள்ளான மைட்டோகாண்ட்ரியா: அல்சைமர் நோயில் படையெடுப்பின் இலக்குகள். மைட்டோகாண்ட்ரியா 59, 48–57 (2021).
பெலெங்குயர் பி., டுவார்டே ஜே.எம்.என்., ஷூக் பி.எஃப். மற்றும் ஃபெரைரா ஜி.கே. மைட்டோகாண்ட்ரியாவும் மூளையும்: உயிர் ஆற்றலியலும் மேலும் பலவும். நியூரோடாக்சின்ஸ். ரிசோர்ஸ். 36, 219–238 (2019).
ரங்கராஜு, வி. மற்றும் பலர். பல்பயன் மைட்டோகாண்ட்ரியா: நரம்பணு வளர்ச்சி மற்றும் நோய்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் தாக்கம். ஜே. நியூரோசயின்ஸ். 39, 8200–8208 (2019).
கார்டானோ-ராமோஸ், சி. மற்றும் மொரைஸ், வி.ஏ. நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியல்: எப்படி மற்றும் எங்கே. பன்னாட்டுத்தன்மை. ஜே. மோர். தி சயின்ஸ். 22, 13059 (2021).
யு, ஆர்., லெண்டால், யு., நிஸ்டர், எம். மற்றும் ஜாவோ, ஜே. பாலூட்டி மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலின் ஒழுங்குமுறை: வாய்ப்புகளும் சவால்களும். ஃபிரண்ட். எண்டோகிரைன். (லௌசான்) 11, 374 (2020).
காச்சோ, எம். மற்றும் ஸ்லாக், ஆர்.எஸ். நரம்பணு உருவாக்கத்தின் ஒழுங்குமுறையில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல்: வளரும் மூளையிலிருந்து முதிர்ந்த மூளை வரை. வளர்ச்சி. இயக்கவியல். 247, 47–53 (2018).