இக்கட்டுரை, “நோய்க்கிருமிகள் மற்றும் பூச்சிகளுக்கு எதிராகப் பயறு வகைகளின் எதிர்ப்பாற்றலை மேம்படுத்துதல்” என்ற ஆய்வுத் தலைப்பின் ஒரு பகுதியாகும், அனைத்து 5 கட்டுரைகளையும் காண்க.
பூஞ்சைத் தாவர நோயான நெக்ரோசிஸின் காரணியான ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் (லிப்.) டி பேரி, வெவ்வேறு ஓம்புயிரித் தாவரங்களைத் தொற்ற ஒரு பல-படிநிலை உத்தியைப் பயன்படுத்துகிறது. சூடோமோனாஸ் ஸ்க்லெரோடியோரம் மூலம் ஏற்படும் வெண்பூஞ்சைக்கு எதிராக ஃபேசியோலஸ் வல்காரிஸ் எல். தாவரத்தின் மூலக்கூறு, உடலியல் மற்றும் உயிர்வேதியியல் எதிர்வினைகளை மேம்படுத்துவதற்கான ஒரு மாற்று மேலாண்மை உத்தியாக, மற்ற அத்தியாவசிய அமினோ அமிலங்களின் தொகுப்பைத் தூண்டும் ஒரு புரதமற்ற அமினோ அமிலமான டயமைன் எல்-ஆர்னிதைனின் பயன்பாட்டை இந்த ஆய்வு முன்மொழிகிறது. ஆய்வகச் சோதனைகள், எல்-ஆர்னிதைன் எஸ். பைரினாய்டோசாவின் பூஞ்சை இழைகளின் வளர்ச்சியை அதன் அளவைப் பொறுத்து குறிப்பிடத்தக்க அளவில் தடுத்ததைக் காட்டின. மேலும், பசுமைக்குடில் சூழ்நிலைகளில் இது வெண்பூஞ்சையின் தீவிரத்தைக் கணிசமாகக் குறைக்க முடிந்தது. அதுமட்டுமின்றி, எல்-ஆர்னிதைன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் வளர்ச்சியைத் தூண்டியது, இது சோதிக்கப்பட்ட எல்-ஆர்னிதைனின் செறிவுகள் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களுக்கு நச்சுத்தன்மையற்றவை என்பதைக் குறிக்கிறது. கூடுதலாக, எல்-ஆர்னித்தின் நொதியற்ற ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட்கள் (மொத்த கரையக்கூடிய ஃபீனாலிக்கள் மற்றும் ஃபிளாவனாய்டுகள்) மற்றும் நொதி சார்ந்த ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட்கள் (கேடலேஸ் (CAT), பெராக்ஸிடேஸ் (POX), மற்றும் பாலிஃபீனால் ஆக்ஸிடேஸ் (PPO)) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டை மேம்படுத்தியதுடன், ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட் தொடர்பான மூன்று மரபணுக்களின் (PvCAT1, PvSOD, மற்றும் PvGR) வெளிப்பாட்டையும் அதிகரித்தது. மேலும், கணினி வழிப் பகுப்பாய்வானது, S. sclerotiorum மரபணுத்தொகுதியில் ஒரு சாத்தியமான ஆக்சாலோஅசிட்டேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (SsOAH) புரதம் இருப்பதைக் கண்டறிந்தது. இது செயல்பாட்டுப் பகுப்பாய்வு, பாதுகாக்கப்பட்ட களங்கள் மற்றும் இடவியல் ஆகியவற்றின் அடிப்படையில், Aspergillus fijiensis (AfOAH) மற்றும் Penicillium sp. (PlOAH) ஆகியவற்றின் ஆக்சாலோஅசிட்டேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (SsOAH) புரதங்களுடன் மிகவும் ஒத்திருந்தது. சுவாரஸ்யமாக, உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பு (PDB) ஊடகத்தில் எல்-ஆர்னிதைனைச் சேர்ப்பது, எஸ். ஸ்க்லெரோஷியோரம் மைசீலியாவில் SsOAH மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. இதேபோல், எல்-ஆர்னிதைனை வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்துவது, சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட பூஞ்சை மைசீலியாவில் SsOAH மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. இறுதியாக, எல்-ஆர்னிதைன் பயன்பாடு PDB ஊடகம் மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட இலைகள் இரண்டிலும் ஆக்சாலிக் அமிலச் சுரப்பைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. முடிவாக, எல்-ஆர்னிதைன், பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் ரெடாக்ஸ் நிலையைப் பராமரிப்பதிலும், அவற்றின் பாதுகாப்பு எதிர்வினையை மேம்படுத்துவதிலும் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கிறது. இந்த ஆய்வின் முடிவுகள், வெள்ளைப் பூஞ்சையைக் கட்டுப்படுத்தவும், அவரை உற்பத்தி மற்றும் பிற பயிர்கள் மீதான அதன் தாக்கத்தைக் குறைக்கவும் புதுமையான, சுற்றுச்சூழலுக்கு உகந்த முறைகளை உருவாக்க உதவக்கூடும்.
ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் (லிப்.) டி பேரி என்ற நெக்ரோட்ரோபிக் பூஞ்சையால் ஏற்படும் வெள்ளைப் பூஞ்சை நோய், உலகளாவிய அவரை (ஃபேசியோலஸ் வல்காரிஸ் எல்.) உற்பத்திக்கு ஒரு கடுமையான அச்சுறுத்தலை ஏற்படுத்தும், விளைச்சலைக் குறைக்கும் ஒரு பேரழிவு நோயாகும் (போல்டன் மற்றும் பலர், 2006). ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் என்பது கட்டுப்படுத்துவதற்கு மிகவும் கடினமான, மண்ணில் பரவும் பூஞ்சைத் தாவர நோய்க்காரணிகளில் ஒன்றாகும். இது 600-க்கும் மேற்பட்ட தாவர இனங்களைத் தாக்கும் பரந்த வரம்பையும், குறிப்பிட்ட தன்மையற்ற முறையில் புரவலன் திசுக்களை விரைவாகச் சிதைக்கும் திறனையும் கொண்டுள்ளது (லியாங் மற்றும் ரோலின்ஸ், 2018). சாதகமற்ற சூழ்நிலைகளில், இது தனது வாழ்க்கைச் சுழற்சியின் ஒரு முக்கியமான கட்டத்தை அடைகிறது. அப்போது, ​​மண்ணில் 'ஸ்க்லெரோஷியா' எனப்படும் கருப்பு, கடினமான, விதை போன்ற அமைப்புகளாகவோ அல்லது பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் மைசீலியம் அல்லது தண்டு மையத்தில் வெள்ளை, பஞ்சுபோன்ற வளர்ச்சிகளாகவோ நீண்ட காலத்திற்கு செயலற்ற நிலையில் இருக்கும் (ஷ்வார்ட்ஸ் மற்றும் பலர், 2005). எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம், ஸ்க்லரோஷியாக்களை உருவாக்கும் திறன் கொண்டது. இது, பாதிக்கப்பட்ட வயல்களில் நீண்ட காலத்திற்கு உயிர்வாழவும், நோய் ஏற்படும்போது நிலைத்திருக்கவும் உதவுகிறது (ஷ்வார்ட்ஸ் மற்றும் பலர், 2005). ஸ்க்லரோஷியாக்கள் ஊட்டச்சத்துக்கள் நிறைந்தவை, மண்ணில் நீண்ட காலத்திற்கு நிலைத்திருக்கக்கூடியவை, மேலும் அடுத்தடுத்த தொற்றுகளுக்கு முதன்மை நோய்க்காரணியாகச் செயல்படுகின்றன (ஷ்வார்ட்ஸ் மற்றும் பலர், 2005). சாதகமான சூழ்நிலைகளில், ஸ்க்லரோஷியாக்கள் முளைத்து, காற்றில் பரவும் வித்துக்களை உருவாக்குகின்றன. இந்த வித்துக்கள், பூக்கள், தண்டுகள் அல்லது காய்கள் உட்பட, தாவரத்தின் தரைக்கு மேலுள்ள அனைத்துப் பகுதிகளையும் பாதிக்கக்கூடும் (ஷ்வார்ட்ஸ் மற்றும் பலர், 2005).
ஸ்க்லரோடினியா ஸ்க்லரோடியம், தனது ஓம்புயிரித் தாவரங்களைத் தொற்றுவதற்கு, ஸ்க்லரோஷியல் முளைத்தல் முதல் அறிகுறித் தோற்றம் வரையிலான தொடர்ச்சியான ஒருங்கிணைந்த நிகழ்வுகளை உள்ளடக்கிய ஒரு பல-படிநிலை உத்தியைப் பயன்படுத்துகிறது. தொடக்கத்தில், எஸ். ஸ்க்லரோடியம், அப்போதீஷியா எனப்படும் காளான் போன்ற அமைப்புகளிலிருந்து காற்றில் மிதக்கும் வித்துக்களை (ஆஸ்கோஸ்போர்கள் என அழைக்கப்படுகின்றன) உருவாக்குகிறது. இவை காற்றில் பரவி, பாதிக்கப்பட்ட தாவரக் கழிவுகளில் அசையாத ஸ்க்லரோஷியாவாக வளர்கின்றன (போல்டன் மற்றும் பலர், 2006). பின்னர் அந்தப் பூஞ்சை, தாவர செல் சுவரின் pH அளவைக் கட்டுப்படுத்தவும், நொதிச் சிதைவு மற்றும் திசு ஊடுருவலை ஊக்குவிக்கவும் (ஹெகெடஸ் மற்றும் ரிம்மர், 2005), மற்றும் ஓம்புயிரித் தாவரத்தின் ஆக்சிஜனேற்ற வெடிப்பை அடக்கவும், ஒரு வீரியக் காரணியான ஆக்சாலிக் அமிலத்தைச் சுரக்கிறது. இந்த அமிலமாக்கல் செயல்முறை தாவர செல் சுவரைப் பலவீனப்படுத்துகிறது. இது பூஞ்சையின் செல் சுவரைச் சிதைக்கும் நொதிகள் (CWDEs) இயல்பாகவும் திறமையாகவும் செயல்படுவதற்குச் சாதகமான சூழலை வழங்குகிறது. இதனால் நோய்க்காரணியானது பௌதீகத் தடையைத் தாண்டி ஓம்புயிரித் திசுக்களுக்குள் ஊடுருவ முடிகிறது (மார்சியானோ மற்றும் பலர், 1983). ஊடுருவியவுடன், எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் பாலிகலக்டுரோனேஸ் மற்றும் செல்லுலேஸ் போன்ற பல CWDE-களைச் சுரக்கிறது. இவை பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களில் அதன் பரவலை எளிதாக்கி, திசு சிதைவை ஏற்படுத்துகின்றன. புண்கள் மற்றும் பூஞ்சை இழைப் படலங்களின் வளர்ச்சி, வெண்பூஞ்சையின் சிறப்பியல்பு அறிகுறிகளுக்கு வழிவகுக்கிறது (ஹெகெடஸ் மற்றும் ரிம்மர், 2005). இதற்கிடையில், புரவலன் தாவரங்கள், வடிவ அங்கீகார ஏற்பிகள் (PRRs) மூலம் நோய்க்கிருமியுடன் தொடர்புடைய மூலக்கூறு வடிவங்களை (PAMPs) அடையாளம் கண்டு, தொடர்ச்சியான சமிக்ஞை நிகழ்வுகளைத் தூண்டுகின்றன. இவை இறுதியில் பாதுகாப்பு எதிர்வினைகளைச் செயல்படுத்துகின்றன.
பல தசாப்தங்களாக நோய்க் கட்டுப்பாட்டு முயற்சிகள் மேற்கொள்ளப்பட்ட போதிலும், நோய்க்கிருமியின் எதிர்ப்புத்திறன், உயிர்வாழ்தல் மற்றும் தகவமைத்துக் கொள்ளும் திறன் காரணமாக, மற்ற வணிகப் பயிர்களைப் போலவே அவரையிலும் போதுமான எதிர்ப்புத் திறன் கொண்ட மரபணு வளங்களுக்குப் பற்றாக்குறை நீடிக்கிறது. எனவே, நோய் மேலாண்மை மிகவும் சவாலானது மற்றும் இதற்கு சாகுபடி முறைகள், உயிரியல் கட்டுப்பாடு மற்றும் இரசாயன பூஞ்சைக்கொல்லிகள் ஆகியவற்றின் கலவையை உள்ளடக்கிய ஒரு ஒருங்கிணைந்த, பன்முக உத்தி தேவைப்படுகிறது (ஓ'சல்லிவன் மற்றும் பலர், 2021). வெள்ளைப் பூஞ்சை நோயை இரசாயன முறையில் கட்டுப்படுத்துவதே மிகவும் பயனுள்ளது, ஏனெனில் பூஞ்சைக்கொல்லிகளைச் சரியாகவும் சரியான நேரத்திலும் பயன்படுத்தும்போது, ​​அவை நோயின் பரவலைத் திறம்படக் கட்டுப்படுத்தவும், நோய்த்தொற்றின் தீவிரத்தைக் குறைக்கவும், மகசூல் இழப்புகளைக் குறைக்கவும் முடியும். இருப்பினும், பூஞ்சைக்கொல்லிகளை அதிகமாகப் பயன்படுத்துவதும், அவற்றை அதிகமாகச் சார்ந்திருப்பதும் எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் (S. sclerotiorum) நோய்க்கிருமியின் எதிர்ப்புத் திறன் கொண்ட திரிபுகள் உருவாக வழிவகுக்கும் மற்றும் இலக்கற்ற உயிரினங்கள், மண் ஆரோக்கியம் மற்றும் நீரின் தரம் ஆகியவற்றில் எதிர்மறையான தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் (லெ கொய்ன்டே மற்றும் பலர், 2016; செரெசினி மற்றும் பலர், 2024). எனவே, சுற்றுச்சூழலுக்கு உகந்த மாற்று வழிகளைக் கண்டறிவது ஒரு முதன்மை முன்னுரிமையாக மாறியுள்ளது.
புட்ரெசின், ஸ்பெர்மிடின், ஸ்பெர்மின் மற்றும் கடாவெரின் போன்ற பாலிஅமைன்கள் (PAs), மண்ணில் பரவும் தாவர நோய்க்கிருமிகளுக்கு எதிராக நம்பிக்கைக்குரிய மாற்றுகளாகச் செயல்பட முடியும். இதன் மூலம், அபாயகரமான இரசாயன பூஞ்சைக்கொல்லிகளின் பயன்பாட்டை முழுமையாகவோ அல்லது பகுதியாகவோ குறைக்கலாம் (நெஹேலா மற்றும் பலர், 2024; யீ மற்றும் பலர், 2024). உயர் தாவரங்களில், பாலிஅமைன்கள் செல் பிரிவு, வேறுபடுதல் மற்றும் உயிரற்ற மற்றும் உயிருள்ள அழுத்தங்களுக்கு எதிர்வினையாற்றுதல் உள்ளிட்ட பல உடலியல் செயல்முறைகளில் ஈடுபட்டுள்ளன (கில்லினி மற்றும் நெஹேலா, 2020). அவை ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட்களாகச் செயல்படலாம், வினைத்திறன் மிக்க ஆக்ஸிஜன் இனங்களை (ROS) அகற்ற உதவலாம், ரெடாக்ஸ் ஹோமியோஸ்டாசிஸைப் பராமரிக்கலாம் (நெஹேலா மற்றும் கில்லினி, 2023), பாதுகாப்பு தொடர்பான மரபணுக்களைத் தூண்டலாம் (ரொமெரோ மற்றும் பலர், 2018), பல்வேறு வளர்சிதை மாற்றப் பாதைகளை ஒழுங்குபடுத்தலாம் (நெஹேலா மற்றும் கில்லினி, 2023), அகத்தாவர ஹார்மோன்களை மாற்றியமைக்கலாம் (நெஹேலா மற்றும் கில்லினி, 2019), அமைப்புசார்ந்த பெறப்பட்ட எதிர்ப்பை (SAR) நிறுவலாம், மற்றும் தாவர-நோய்க்கிருமி இடைவினைகளை ஒழுங்குபடுத்தலாம் (நெஹேலா மற்றும் கில்லினி, 2020; அசிஜா மற்றும் பலர், 2022; செர்வோனிக், 2022). தாவரப் பாதுகாப்பில் PA-க்களின் குறிப்பிட்ட வழிமுறைகளும் பங்குகளும் தாவர இனங்கள், நோய்க்கிருமிகள் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் நிலைமைகளைப் பொறுத்து மாறுபடுகின்றன என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. தாவரங்களில் மிகவும் அதிகமாகக் காணப்படும் PA, அத்தியாவசிய பாலிஅமைனான L-ஆர்னிதைனிலிருந்து உயிரியக்க முறையில் தொகுக்கப்படுகிறது (கில்லினி மற்றும் நெஹேலா, 2020).
எல்-ஆர்னித்தின் தாவர வளர்ச்சி மற்றும் மேம்பாட்டில் பலதரப்பட்ட பங்குகளை வகிக்கிறது. உதாரணமாக, முந்தைய ஆய்வுகள் அரிசியில் (Oryza sativa), ஆர்னித்தின் நைட்ரஜன் மறுசுழற்சி (Liu et al., 2018), அரிசி மகசூல், தரம் மற்றும் நறுமணம் (Lu et al., 2020), மற்றும் நீர் அழுத்த எதிர்வினை (Yang et al., 2000) ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம் என்று காட்டியுள்ளன. மேலும், வெளிப்புறமாக எல்-ஆர்னித்தின் பயன்பாடு சர்க்கரை பீட் (Beta vulgaris) தாவரத்தில் வறட்சி சகிப்புத்தன்மையை கணிசமாக அதிகரித்தது (Hussein et al., 2019) மற்றும் வெங்காயம் (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) மற்றும் முந்திரி (Anacardium occidentale) தாவரங்களில் (da Rocha et al., 2012) உப்பு அழுத்தத்தைக் குறைத்தது. உயிரற்ற அழுத்தப் பாதுகாப்பில் எல்-ஆர்னித்தினின் சாத்தியமான பங்கு, சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களில் புரோலின் திரட்சியில் அதன் ஈடுபாட்டின் காரணமாக இருக்கலாம். உதாரணமாக, ஆர்னிதைன் டெல்டா அமினோட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் (டெல்டா-OAT) மற்றும் புரோலின் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (ProDH1 மற்றும் ProDH2) மரபணுக்கள் போன்ற புரோலின் வளர்சிதை மாற்றத்துடன் தொடர்புடைய மரபணுக்கள், விருந்தோம்பி அல்லாத சூடோமோனாஸ் சிரிங்கே விகாரங்களுக்கு எதிராக நிக்கோடியானா பெந்தாமியானா மற்றும் அரபிடோப்சிஸ் தாலியானாவின் பாதுகாப்பில் ஈடுபட்டுள்ளதாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது (செந்தில்-குமார் மற்றும் மைசூர், 2012). மறுபுறம், பூஞ்சை ஆர்னிதைன் டீகார்பாக்சிலேஸ் (ODC) நோய்க்கிருமியின் வளர்ச்சிக்குத் தேவைப்படுகிறது (சிங் மற்றும் பலர், 2020). விருந்தோம்பி-தூண்டப்பட்ட மரபணு அமைதியாக்கம் (HIGS) மூலம் ஃபுசாரியம் ஆக்சிஸ்போரம் f. sp. லைகோபெர்சிசியின் ODC-ஐ இலக்கு வைப்பது, ஃபுசாரியம் வாடல் நோய்க்கு எதிராக தக்காளி தாவரங்களின் எதிர்ப்பை கணிசமாக அதிகரித்தது (சிங் மற்றும் பலர், 2020). இருப்பினும், தாவர நோய்க்கிருமிகள் போன்ற உயிரியல் அழுத்தங்களுக்கு எதிராக வெளிப்புற ஆர்னிதைன் பயன்பாட்டின் சாத்தியமான பங்கு நன்கு ஆய்வு செய்யப்படவில்லை. மிக முக்கியமாக, நோய் எதிர்ப்புத் திறன் மீதான ஆர்னிதைனின் விளைவுகளும், அதனுடன் தொடர்புடைய உயிர்வேதியியல் மற்றும் உடலியல் நிகழ்வுகளும் பெருமளவில் ஆராயப்படாமல் உள்ளன.
பயறு வகைத் தாவரங்களில் ஏற்படும் எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் நோய்த்தொற்றின் சிக்கலான தன்மையைப் புரிந்துகொள்வது, பயனுள்ள கட்டுப்பாட்டு உத்திகளை உருவாக்குவதற்கு முக்கியமானது. இந்த ஆய்வில், ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் நோய்த்தொற்றுக்கு எதிராக பயறு வகைத் தாவரங்களின் பாதுகாப்பு வழிமுறைகளையும் எதிர்ப்பாற்றலையும் மேம்படுத்துவதில், எல்-ஆர்னித்தின் என்ற டயமைனின் முக்கியப் பங்கை அடையாளம் காண்பதை நோக்கமாகக் கொண்டோம். பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் பாதுகாப்பு எதிர்வினைகளை மேம்படுத்துவதோடு மட்டுமல்லாமல், அவற்றின் ரெடாக்ஸ் நிலையைப் பராமரிப்பதிலும் எல்-ஆர்னித்தின் முக்கியப் பங்கு வகிக்கிறது என்று நாங்கள் கருதுகோள் கொள்கிறோம். எல்-ஆர்னித்தினின் சாத்தியமான விளைவுகள், நொதிய மற்றும் நொதியல்லாத ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட் பாதுகாப்பு வழிமுறைகளின் ஒழுங்குமுறை மற்றும் பூஞ்சையின் நோயுண்டாக்கும் தன்மை/வீரியக் காரணிகள் மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய புரதங்களில் குறுக்கிடுவது ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையவை என்று நாங்கள் முன்மொழிகிறோம். எல்-ஆர்னித்தினின் இந்த இரட்டைச் செயல்பாடு, வெள்ளைப் பூஞ்சையின் தாக்கத்தைக் குறைப்பதற்கும், இந்த சக்திவாய்ந்த பூஞ்சை நோய்க்கிருமிக்கு எதிராகப் பொதுவான பயறு வகைப் பயிர்களின் எதிர்ப்பாற்றலை மேம்படுத்துவதற்கும் ஒரு நிலையான உத்திக்கான நம்பிக்கைக்குரிய தேர்வாக அமைகிறது. தற்போதைய ஆய்வின் முடிவுகள், வெள்ளைப் பூஞ்சையைக் கட்டுப்படுத்தவும், பயறு வகை உற்பத்தியில் அதன் தாக்கத்தைக் குறைக்கவும் புதுமையான, சுற்றுச்சூழலுக்கு உகந்த முறைகளை உருவாக்க உதவக்கூடும்.
இந்த ஆய்வில், எளிதில் பாதிப்படையக்கூடிய வணிக ரகமான கிசா 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) சோதனைப் பொருளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. எகிப்தில் உள்ள வேளாண் ஆராய்ச்சி மையத்தின் (ARC) கீழ் இயங்கும் வயல் பயிர் ஆராய்ச்சி நிறுவனத்தின் (FCRI) பயறு ஆராய்ச்சித் துறையால் ஆரோக்கியமான விதைகள் அன்புடன் வழங்கப்பட்டன. பசுமைக்குடில் சூழலில் (25 ± 2 °C, ஒப்பு ஈரப்பதம் 75 ± 1%, 8 மணிநேர ஒளி/16 மணிநேர இருள்), எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் (S. sclerotiorum) பூஞ்சையால் பாதிக்கப்பட்ட மண் நிரப்பப்பட்ட நெகிழித் தொட்டிகளில் (உள் விட்டம் 35 செ.மீ, ஆழம் 50 செ.மீ) ஐந்து விதைகள் விதைக்கப்பட்டன. விதைத்த 7-10 நாட்களுக்குப் பிறகு (DPS), ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் சீரான வளர்ச்சியுடனும், முழுமையாக விரிந்த மூன்று இலைகளுடனும் இரண்டு நாற்றுகள் மட்டுமே இருக்கும்படி அவை நீக்கப்பட்டன. அனைத்துத் தொட்டிச் செடிகளுக்கும் இரண்டு வாரங்களுக்கு ஒருமுறை தண்ணீர் பாய்ச்சப்பட்டது மற்றும் கொடுக்கப்பட்ட ரகத்திற்குப் பரிந்துரைக்கப்பட்ட அளவில் மாதந்தோறும் உரமிடப்பட்டது.
500 மி.கி/லி செறிவில் எல்-ஆர்னித்தின்டையமைன் ((+)-(S)-2,5-டையமினோபென்டானோயிக் அமிலம் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) தயாரிக்க, முதலில் 50 மி.கி அளவு 100 மி.லி கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் கரைக்கப்பட்டது. பின்னர், அந்த மூலக் கரைசல் நீர்த்துப்போகச் செய்யப்பட்டு, அடுத்தடுத்த சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஆறு வகையான எல்-ஆர்னித்தின் செறிவுகள் (12.5, 25, 50, 75, 100, மற்றும் 125 மி.கி/லி) ஆய்வகத்தில் சோதிக்கப்பட்டன. மேலும், கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர் ஒரு எதிர்மறைக் கட்டுப்பாடாகவும் (போலி), வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான “ரிசோலெக்ஸ்-டி” 50% ஈரமாக்கக்கூடிய தூள் (டோக்ளோஃபோஸ்-மெத்தில் 20% + திராம் 30%; கே.இசட்-காஃப்ர் எல் சயாத் பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் இரசாயனங்கள் நிறுவனம், காஃப்ர் எல் சயாத், கர்பியா மாகாணம், எகிப்து) ஒரு நேர்மறைக் கட்டுப்பாடாகவும் பயன்படுத்தப்பட்டது. வணிகப் பூஞ்சைக் கொல்லியான “ரிசோலெக்ஸ்-டி”, ஐந்து செறிவுகளில் (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) ஆய்வகத்தில் பரிசோதிக்கப்பட்டது.
வணிகப் பண்ணைகளிலிருந்து, வெள்ளைப் பூஞ்சையின் பொதுவான அறிகுறிகளைக் காட்டும் (பாதிப்பு விகிதம்: 10–30%) அவரைக்காய் தண்டுகள் மற்றும் காய்களின் மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டன. பாதிக்கப்பட்ட தாவரப் பொருட்களில் பெரும்பாலானவை இனம்/வகையின் அடிப்படையில் (பாதிக்கப்படக்கூடிய வணிக வகை Giza 3) அடையாளம் காணப்பட்டாலும், மற்றவை, குறிப்பாக உள்ளூர் சந்தைகளிலிருந்து பெறப்பட்டவை, அறியப்படாத இனத்தைச் சேர்ந்தவையாக இருந்தன. சேகரிக்கப்பட்ட பாதிக்கப்பட்ட பொருட்கள் முதலில் 0.5% சோடியம் ஹைப்போகுளோரைட் கரைசலைக் கொண்டு 3 நிமிடங்களுக்கு மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டன, பின்னர் கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் பலமுறை அலசப்பட்டு, அதிகப்படியான நீரை அகற்ற கிருமியழிக்கப்பட்ட வடிகட்டித் தாளைக் கொண்டு உலர்த்தப்பட்டன. பின்னர், பாதிக்கப்பட்ட உறுப்புகள் ஆரோக்கியமான மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களுக்கு இடையில் உள்ள நடுத் திசுவிலிருந்து சிறு துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டு, உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் அகார் (PDA) ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்டு, ஸ்க்லரோஷியா உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்காக 5 நாட்களுக்கு 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 12 மணி நேர ஒளி/12 மணி நேர இருள் சுழற்சியில் அடைகாக்கப்பட்டன. கலப்பு அல்லது அசுத்தமான வளர்ப்புகளிலிருந்து பூஞ்சைத் தனிமங்களைத் தூய்மைப்படுத்த மைசீலியல் நுனி முறையும் பயன்படுத்தப்பட்டது. தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட பூஞ்சைத் தனிமம், முதலில் அதன் வளர்ப்பு உருவவியல் பண்புகளின் அடிப்படையில் அடையாளம் காணப்பட்டது. பின்னர், நுண்ணோக்கி அம்சங்களின் அடிப்படையில் அது எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் (S. sclerotiorum) என உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. இறுதியாக, கோக்கின் கோட்பாடுகளைப் பூர்த்தி செய்யும் வகையில், தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட அனைத்துத் தனிமங்களும், எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய பொதுவான அவரை இரகமான கிசா 3 (Giza 3) மீது நோயுண்டாக்கும் தன்மைக்காகச் சோதிக்கப்பட்டன.
கூடுதலாக, மிகவும் ஊடுருவும் S. sclerotiorum தனிமம் (தனிமம் #3), White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ஆகியோரால் விவரிக்கப்பட்டபடி, உள் படியெடுக்கப்பட்ட இடைவெளி (ITS) வரிசைமுறைப்படுத்தலின் அடிப்படையில் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, தனிமங்கள் உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பில் (PDB) வளர்க்கப்பட்டு, 5–7 நாட்களுக்கு 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டன. பின்னர் பூஞ்சை மைசீலியம் சேகரிக்கப்பட்டு, சீஸ்க்ளாத் வழியாக வடிகட்டப்பட்டு, கிருமியழிக்கப்பட்ட நீரால் இருமுறை கழுவப்பட்டு, கிருமியழிக்கப்பட்ட வடிகட்டித் தாளால் உலர்த்தப்பட்டது. Quick-DNA™ பூஞ்சை/பாக்டீரியா மினிப்ரிப் கிட் (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) பயன்படுத்தி மரபணு டி.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. பின்னர், ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; எதிர்பார்க்கப்படும் அளவு: 540 bp) என்ற குறிப்பிட்ட பிரைமர் ஜோடியைப் பயன்படுத்தி ITS rDNA பகுதி பெருக்கப்பட்டது (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). சுத்திகரிக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்புகள் வரிசைப்படுத்துதலுக்காகச் சமர்ப்பிக்கப்பட்டன (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA வரிசைமுறைகள் சாங்கர் வரிசைப்படுத்துதல் முறையைப் பயன்படுத்தி இரு திசைகளிலும் வரிசைப்படுத்தப்பட்டன. பின்னர், தொகுக்கப்பட்ட வினவல் வரிசைமுறைகள், BLASTn மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி ஜென்பேங்க் மற்றும் தேசிய உயிரி தொழில்நுட்பத் தகவல் மையத்தில் (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) உள்ள சமீபத்திய தரவுகளுடன் ஒப்பிடப்பட்டன. மூலக்கூறு பரிணாம மரபியல் பகுப்பாய்வுத் தொகுப்பில் (MEGA-11; பதிப்பு 11) (குமார் மற்றும் பலர், 2024) உள்ள ClustalW-ஐப் பயன்படுத்தி, வினவல் வரிசையானது NCBI ஜென்பேங்கில் உள்ள சமீபத்திய தரவுகளிலிருந்து (துணை அட்டவணை S1) பெறப்பட்ட மற்ற 20 S. sclerotiorum திரிபுகள்/தனிமங்களுடன் ஒப்பிடப்பட்டது. பரிணாமப் பகுப்பாய்வானது பெரும நிகழ்தகவு முறை மற்றும் பொதுவான நேர-மீளக்கூடிய நியூக்ளியோடைடு பதிலீட்டு மாதிரி (நெய் மற்றும் குமார், 2000) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. மிக உயர்ந்த மடக்கை-நிகழ்தகவைக் கொண்ட மரம் காட்டப்பட்டுள்ளது. அண்டை-இணைப்பு (NJ) மரம் (குமார் மற்றும் பலர், 2024) மற்றும் பெரும சிக்கன (MP) மரம் ஆகியவற்றுக்கு இடையே அதிக மடக்கை-நிகழ்தகவைக் கொண்ட மரத்தைத் தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலம், ஊகத் தேடலுக்கான ஆரம்ப மரம் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. பொதுவான நேர-மீளக்கூடிய மாதிரியைப் (நெய் மற்றும் குமார், 2000) பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்ட ஒரு ஜோடி இடைவெளி அணியைப் பயன்படுத்தி NJ மரம் கட்டமைக்கப்பட்டது.
எல்-ஆர்னித்தின் மற்றும் “ரிசோலெக்ஸ்-டி” என்ற பாக்டீரியா கொல்லியின் பாக்டீரியா எதிர்ப்புச் செயல்பாடு, அகார் பரவல் முறை மூலம் ஆய்வகத்தில் (in vitro) தீர்மானிக்கப்பட்டது. செய்முறை: எல்-ஆர்னித்தின் மூலக் கரைசலில் (500 மி.கி/லி) இருந்து தகுந்த அளவு எடுத்து, அதை 10 மிலி PDA ஊட்டச்சத்து ஊடகத்துடன் நன்கு கலந்து, முறையே 12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 மி.கி/லி இறுதிச் செறிவுகளைக் கொண்ட கரைசல்களைத் தயாரிக்கவும். “ரிசோலெக்ஸ்-டி” என்ற பூஞ்சைக் கொல்லியின் ஐந்து செறிவுகளும் (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) மற்றும் கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரும் கட்டுப்பாட்டு மாதிரியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ஊடகம் கெட்டியான பிறகு, புதிதாகத் தயாரிக்கப்பட்ட 4 மி.மீ விட்டம் கொண்ட ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் வளர்ப்பின் பூஞ்சை இழைத் துண்டு, பெட்ரி தட்டின் மையத்திற்கு மாற்றப்பட்டு, பூஞ்சை இழை முழு கட்டுப்பாட்டு பெட்ரி தட்டையும் மூடும் வரை 25±2°C வெப்பநிலையில் வளர்க்கப்பட்டது. அதன் பிறகு, பூஞ்சை வளர்ச்சி பதிவு செய்யப்பட்டது. சமன்பாடு 1-ஐப் பயன்படுத்தி S. sclerotiorum-இன் ஆர வளர்ச்சித் தடுப்பின் சதவீதத்தைக் கணக்கிடுங்கள்:
இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது; ஒவ்வொரு கட்டுப்பாட்டுக்/சோதனைக் குழுவிற்கும் ஆறு உயிரியல் பிரதிகள் மற்றும் ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதிக்கும் ஐந்து தொட்டிகள் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு செடிகள்) பயன்படுத்தப்பட்டன. சோதனை முடிவுகளின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மீண்டும் பெறக்கூடிய தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் இரண்டு முறை (இரண்டு தொழில்நுட்பப் பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கூடுதலாக, அரை-அதிகபட்ச தடுப்புச் செறிவு (IC50) மற்றும் IC99 (பிரென்டிஸ், 1976) ஆகியவற்றைக் கணக்கிட புரோபிட் பின்னடைவுப் பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது.
பசுமைக்குடில் சூழ்நிலைகளில் எல்-ஆர்னிதைனின் திறனை மதிப்பிடுவதற்காக, அடுத்தடுத்து இரண்டு தொட்டிச் சோதனைகள் நடத்தப்பட்டன. சுருக்கமாக, தொட்டிகளில் கிருமியழிக்கப்பட்ட களிமண்-மணல் கலவை (3:1) நிரப்பப்பட்டு, புதிதாகத் தயாரிக்கப்பட்ட எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம் வளர்ப்பு ஊடகம் இடப்பட்டது. முதலில், எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரத்தின் மிகவும் ஆக்கிரமிப்புத் திறன் கொண்ட தனிமம் (தனிமம் #3) வளர்க்கப்பட்டது. இதற்காக, ஒரு ஸ்க்லரோஷியம் பாதியாக வெட்டப்பட்டு, ஒரு PDA மீது தலைகீழாக வைக்கப்பட்டு, பூஞ்சை இழைகளின் வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக 4 நாட்களுக்கு 25°C வெப்பநிலையில் தொடர்ச்சியான இருளில் (24 மணிநேரம்) அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர், அதன் முனையிலிருந்து 5 மிமீ விட்டம் கொண்ட நான்கு அகார் துண்டுகள் எடுக்கப்பட்டு, 100 கிராம் கிருமியழிக்கப்பட்ட கோதுமை மற்றும் அரிசித் தவிடு (1:1, கன அளவு) கலவை இடப்பட்டது. அனைத்துக் குடுவைகளும் ஸ்க்லரோஷியா உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்காக 5 நாட்களுக்கு 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில், 12 மணிநேர ஒளி/12 மணிநேர இருள் சுழற்சியின் கீழ் அடைகாக்கப்பட்டன. மண் சேர்ப்பதற்கு முன், அனைத்துக் குடுவைகளின் உள்ளடக்கங்களும் ஒருபடித்தான தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக நன்கு கலக்கப்பட்டன. பின்னர், நோய்க்கிருமிகளின் செறிவு சீராக இருப்பதை உறுதி செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் 100 கிராம் வளரும் தவிடு கலவை சேர்க்கப்பட்டது. பூஞ்சை வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக, நுண்ணுயிரேற்றம் செய்யப்பட்ட தொட்டிகளுக்கு நீர் பாய்ச்சப்பட்டு, 7 நாட்களுக்குப் பசுமைக்குடில் சூழலில் வைக்கப்பட்டன.
பின்னர், ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் கிசா 3 ரகத்தைச் சேர்ந்த ஐந்து விதைகள் விதைக்கப்பட்டன. எல்-ஆர்னிதைன் மற்றும் ரைசோலெக்ஸ்-டி என்ற பூஞ்சைக்கொல்லி கொண்டு பதப்படுத்தப்பட்ட தொட்டிகளில், கிருமியழிக்கப்பட்ட விதைகள் முதலில், முறையே சுமார் 250 மி.கி/லி மற்றும் 50 மி.கி/லி என்ற இறுதி IC99 செறிவு கொண்ட அந்த இரண்டு சேர்மங்களின் நீர்க்கரைசலில் இரண்டு மணி நேரம் ஊறவைக்கப்பட்டு, பின்னர் விதைப்பதற்கு முன் ஒரு மணி நேரம் காற்றில் உலர்த்தப்பட்டன. மறுபுறம், எதிர்மறைக் கட்டுப்பாடாக விதைகள் கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் ஊறவைக்கப்பட்டன. 10 நாட்களுக்குப் பிறகு, முதல் நீர்ப்பாசனத்திற்கு முன், ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் இரண்டு நேர்த்தியான நாற்றுகள் மட்டுமே இருக்கும்படி, நாற்றுகள் அடர்த்தி குறைக்கப்பட்டன. கூடுதலாக, எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் நோய்த்தொற்றை உறுதி செய்வதற்காக, ஒரே வளர்ச்சி நிலையில் (10 நாட்கள்) உள்ள அவரைச் செடிகளின் தண்டுகள், கிருமியழிக்கப்பட்ட அறுவைக்கத்தியைப் பயன்படுத்தி இரண்டு வெவ்வேறு இடங்களில் வெட்டப்பட்டு, ஒவ்வொரு காயத்திலும் சுமார் 0.5 கிராம் வளரும் தவிடு கலவை வைக்கப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து, நோய்த்தொற்று மற்றும் நோய் வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக, நோய்த்தொற்று செலுத்தப்பட்ட அனைத்து தாவரங்களிலும் அதிக ஈரப்பதம் கொடுக்கப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டுத் தாவரங்களும் இதேபோல் காயப்படுத்தப்பட்டு, சம அளவு (0.5 கிராம்) கிருமியழிக்கப்பட்ட, நோய்க்கிருமிகள் பரவாத தவிடு கலவையானது அந்தக் காயத்தில் இடப்பட்டு, நோய் வளர்ச்சிக்கான சூழலை உருவகப்படுத்தவும் சிகிச்சைக் குழுக்களிடையே நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்யவும் அதிக ஈரப்பதத்தின் கீழ் பராமரிக்கப்பட்டது.
சிகிச்சை முறை: அவரை நாற்றுகளுக்கு, 500 மிலி எல்-ஆர்னிதைன் (250 மி.கி/லி) அல்லது பூஞ்சைக் கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (50 மி.கி/லி) ஆகியவற்றின் நீர்க்கரைசல் கொண்டு மண்ணிற்கு நீர்ப்பாய்ச்சப்பட்டது. பின்னர், இந்தச் சிகிச்சை 10 நாட்கள் இடைவெளியில் மூன்று முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது. மருந்துப்போலி சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட கட்டுப்பாட்டுக் குழுக்களுக்கு 500 மிலி கிருமியழிக்கப்பட்ட காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர் கொண்டு நீர்ப்பாய்ச்சப்பட்டது. அனைத்து சிகிச்சைகளும் பசுமைக்குடில் சூழலில் (25 ± 2°C, 75 ± 1% ஒப்பு ஈரப்பதம், மற்றும் 8 மணி நேர ஒளி/16 மணி நேர இருள் கொண்ட ஒளிக்காலம்) மேற்கொள்ளப்பட்டன. அனைத்துத் தொட்டிகளுக்கும் பதினைந்து நாட்களுக்கு ஒருமுறை நீர்ப்பாய்ச்சப்பட்டது. மேலும், குறிப்பிட்ட இரகத்திற்கான பரிந்துரைகள் மற்றும் உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, மாதந்தோறும் 3–4 கி/லி செறிவில் சமச்சீர் NPK உரம் (20-20-20, 3.6% கந்தகம் மற்றும் TE நுண்ணூட்டச்சத்துக்களுடன்; ஸைன் சீட்ஸ், எகிப்து) இலைவழித் தெளிப்பாக இடப்பட்டது. வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய 72 மணி நேரத்தில் (hpt), ஒவ்வொரு உயிரியல் மாதிரியிலிருந்தும் முழுமையாக விரிந்த முதிர்ந்த இலைகள் (மேலிருந்து 2வது மற்றும் 3வது இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டு, கூழாக்கப்பட்டு, ஒன்றாகச் சேர்க்கப்பட்டு, மேலும் பகுப்பாய்வுகளுக்காக -80 °C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டன. இந்தப் பகுப்பாய்வுகளில், ஆக்சிஜனேற்ற அழுத்தக் குறிகாட்டிகளின் இடத்திலேயே நிகழும் திசுவேதியியல் இடவமைத்தல், கொழுப்பு ஆக்சிஜனேற்றம், நொதிய மற்றும் நொதியல்லாத ஆக்சிஜனேற்றத் தடுப்பான்கள் மற்றும் மரபணு வெளிப்பாடு ஆகியவை அடங்கும், ஆனால் இவை மட்டுமே அல்ல.
டெரான் மற்றும் குழுவினரால் (2006) மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெட்சோல்ட் மற்றும் டிக்சன் அளவுகோலை (1996) அடிப்படையாகக் கொண்ட 1–9 அளவுகோலைப் (துணை அட்டவணை S2) பயன்படுத்தி, நோய்த்தொற்று ஏற்படுத்திய 21 நாட்களுக்குப் பிறகு (dpi) வாரந்தோறும் வெள்ளைப்பூஞ்சை தொற்றின் தீவிரம் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, நோய்த்தொற்று ஏற்படுத்திய இடத்திலிருந்து தொடங்கி, கணுவிடைப் பகுதிகள் மற்றும் கணுக்களில் புண்களின் பரவலைக் கண்காணிக்க அவரைச் செடிகளின் தண்டுகளும் கிளைகளும் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. பின்னர், நோய்த்தொற்று ஏற்படுத்திய இடத்திலிருந்து தண்டு அல்லது கிளையின் மிகத் தொலைவான புள்ளி வரையிலான புண்ணின் தூரம் அளவிடப்பட்டு, புண்ணின் இருப்பிடத்தின் அடிப்படையில் 1–9 மதிப்பெண் வழங்கப்பட்டது. இதில் (1) என்பது நோய்த்தொற்று ஏற்படுத்திய இடத்திற்கு அருகில் கண்ணுக்குத் தெரியும் தொற்று இல்லை என்பதையும், (2–9) என்பது புண்ணின் அளவில் படிப்படியான அதிகரிப்பு மற்றும் கணுக்கள்/கணுவிடைப் பகுதிகளில் அதன் பரவல் ஆகியவற்றையும் குறிக்கிறது (துணை அட்டவணை S2). பின்னர், சூத்திரம் 2-ஐப் பயன்படுத்தி வெள்ளைப்பூஞ்சை தொற்றின் தீவிரம் சதவீதமாக மாற்றப்பட்டது:
மேலும், நோய் முன்னேற்ற வளைவின் கீழுள்ள பரப்பளவு (AUDPC), (ஷானர் மற்றும் ஃபின்னி, 1977) சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது; இந்தச் சூத்திரம், சமீபத்தில் (சௌஹான் மற்றும் பலர், 2020) சமன்பாடு 3-ஐப் பயன்படுத்தி, சாதாரண அவரைக்காயின் வெண் அழுகலுக்காகத் தழுவிக்கொள்ளப்பட்டது:
இதில் Yi = ti நேரத்தில் நோயின் தீவிரம், Yi+1 = அடுத்த நேரமான ti+1-இல் நோயின் தீவிரம், ti = முதல் அளவீட்டின் நேரம் (நாட்களில்), ti+1 = அடுத்த அளவீட்டின் நேரம் (நாட்களில்), n = மொத்த நேரப் புள்ளிகள் அல்லது கண்காணிப்புப் புள்ளிகளின் எண்ணிக்கை. அவரைச் செடியின் உயரம் (செ.மீ.), ஒரு செடிக்கு உள்ள கிளைகளின் எண்ணிக்கை, மற்றும் ஒரு செடிக்கு உள்ள இலைகளின் எண்ணிக்கை உள்ளிட்ட வளர்ச்சி அளவுருக்கள், அனைத்து உயிரியல் பிரதிகளிலும் 21 நாட்களுக்கு வாரந்தோறும் பதிவு செய்யப்பட்டன.
ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலும், சிகிச்சைக்குப் பிறகு 45-வது நாளில் (கடைசி சிகிச்சைக்கு 15 நாட்களுக்குப் பிறகு), இலை மாதிரிகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு செடிகள்). சுமார் 500 மி.கி நசுக்கப்பட்ட திசு, 4 °C வெப்பநிலையில் இருட்டில் 80% அசிட்டோனைப் பயன்படுத்தி ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளை (குளோரோபில் a, குளோரோபில் b மற்றும் கரோட்டினாய்டுகள்) பிரித்தெடுக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது. 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, மாதிரிகள் மையவிலக்கப்பட்டு, அதன் மேல்தேங்கிய திரவம் சேகரிக்கப்பட்டது. இது, (லிச்டெந்தாலர், 1987) முறையின்படி, மூன்று வெவ்வேறு அலைநீளங்களில் (A470, A646 மற்றும் A663 nm) உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம், UV-160A நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி நிறமானி முறையில் குளோரோபில் a, குளோரோபில் b மற்றும் கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கங்களைக் கண்டறியப் பயன்படுத்தப்பட்டது. இறுதியாக, லிச்செந்தாலர் (1987) விவரித்த பின்வரும் சூத்திரங்கள் 4–6 ஐப் பயன்படுத்தி ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளின் உள்ளடக்கம் கணக்கிடப்பட்டது.
சிகிச்சைக்குப் பிறகு 72 மணி நேரத்தில் (hpt), ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு (H2O2) மற்றும் சூப்பராக்சைடு அயனி (O2•−) ஆகியவற்றின் இன் சிட்டு ஹிஸ்டோகெமிக்கல் இடவமைத்தலுக்காக, ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் இலைகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்). முறையின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மீண்டும் செய்யக்கூடிய தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் இருமுறை (இரண்டு தொழில்நுட்ப பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ரொமெரோ-புவர்டாஸ் மற்றும் பலர் (2004) மற்றும் ஆடம் மற்றும் பலர் (1989) விவரித்த முறைகளை, சிறிய மாற்றங்களுடன் பின்பற்றி, H2O2 மற்றும் O2•− ஆகியவை முறையே 0.1% 3,3′-டயமினோபென்சிடின் (DAB; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) அல்லது நைட்ரோப்ளூ டெட்ராசோலியம் (NBT; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி கண்டறியப்பட்டன. H2O2-ஐ அதன் இயல் இடத்திலேயே திசுவேதியியல் முறையில் கண்டறிவதற்காக, இதழ்கள் 10 mM டிரிஸ் தாங்கல் கரைசலில் (pH 7.8) உள்ள 0.1% DAB உடன் வெற்றிட ஊடுருவலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டு, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 60 நிமிடங்கள் ஒளியில் அடைகாக்கப்பட்டன. இதழ்கள் 4:1 (v/v) எத்தனால்:குளோரோஃபார்மில் (அல்-கோம்ஹோரியா மருந்துகள் மற்றும் மருத்துவப் பொருட்கள், கெய்ரோ, எகிப்து) உள்ள 0.15% (v/v) TCA-இல் வெளுக்கப்பட்டு, பின்னர் அவை கருமையாகும் வரை ஒளியில் காட்டப்பட்டன. இதேபோல், O2•−-ஐ அதன் இயல் இடத்திலேயே திசுவேதியியல் முறையில் கண்டறிவதற்காக, வால்வுகள் 0.1 w/v % HBT-ஐக் கொண்ட 10 mM பொட்டாசியம் பாஸ்பேட் தாங்கல் கரைசலில் (pH 7.8) வெற்றிட ஊடுருவலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. இதழ்கள் அறை வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்கள் ஒளியில் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் மேலே குறிப்பிட்டபடி வெளுக்கப்பட்டு, அடர் நீலம்/ஊதாப் புள்ளிகள் தோன்றும் வரை ஒளியூட்டப்பட்டன. இதன் விளைவாக உருவான பழுப்பு (H2O2 குறிகாட்டியாக) அல்லது நீல-ஊதா (O2•− குறிகாட்டியாக) நிறத்தின் செறிவு, ImageJ என்ற படச் செயலாக்க மென்பொருளின் ஃபிஜி பதிப்பைப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது (http://fiji.sc; 7 மார்ச் 2024 அன்று அணுகப்பட்டது).
மாலோன்டியால்டிஹைடு (MDA; கொழுப்பு ஆக்சிஜனேற்றத்தின் ஒரு குறிப்பானாக) டு மற்றும் பிராம்லேஜ் (1992) முறையின்படி, சில சிறிய மாற்றங்களுடன் கண்டறியப்பட்டது. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் இலைகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சிகிச்சைக்குப் பிறகு 72 மணி நேரத்தில் (hpt) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலும் ஐந்து தொட்டிகள் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு செடிகள்) இருந்தன. இந்த முறையின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மீண்டும் செய்யக்கூடிய தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் இருமுறை (இரண்டு தொழில்நுட்பப் பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, 0.01% பியூட்டிலேட்டட் ஹைட்ராக்சிடொலுயீன் (BHT; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) கொண்ட 20% டிரைகுளோரோஅசிட்டிக் அமிலத்துடன் (TCA; மில்லிபோர்சிக்மா, பர்லிங்டன், MA, USA) MDA பிரித்தெடுப்பதற்காக 0.5 கிராம் அரைக்கப்பட்ட இலைத் திசு பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்னர், மேற்படிவத்தில் உள்ள MDA-வின் அளவு, UV-160A நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 532 மற்றும் 600 nm-ல் உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் நிறமானி முறையில் தீர்மானிக்கப்பட்டு, nmol g−1 FW என வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
நொதியற்ற மற்றும் நொதி சார்ந்த ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட்களை மதிப்பிடுவதற்காக, சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய 72 மணி நேரத்தில் (hpt), ஒவ்வொரு உயிரியல் மாதிரியிலிருந்தும் இலைகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் மாதிரியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்). ஒவ்வொரு உயிரியல் மாதிரியும் இருமுறை (இரண்டு தொழில்நுட்ப மாதிரிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. இரண்டு இலைகள் திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைக்கப்பட்டு, நொதி சார்ந்த மற்றும் நொதியற்ற ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட்கள், மொத்த அமினோ அமிலங்கள், புரோலின் உள்ளடக்கம், மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் ஆக்சலேட் அளவீடு ஆகியவற்றைக் கண்டறிய நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
கஹ்கோனென் மற்றும் அவரது குழுவினரால் (1999) விவரிக்கப்பட்ட முறையில் சில சிறிய மாற்றங்களுடன், ஃபோலின்-சியோகல்டியூ வினைப்பொருள் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) பயன்படுத்தி மொத்த கரையக்கூடிய ஃபீனாலிக் சேர்மங்கள் கண்டறியப்பட்டன. சுருக்கமாக, சுமார் 0.1 கிராம் கூழாக்கப்பட்ட இலைத் திசு, 20 மில்லி 80% மெத்தனால் கொண்டு 24 மணி நேரம் இருட்டில் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, மையவிலக்கு முறைக்குப் பிறகு மேல்தேங்கிய திரவம் சேகரிக்கப்பட்டது. மாதிரிச் சாற்றின் 0.1 மில்லி, 0.5 மில்லி ஃபோலின்-சியோகல்டியூ வினைப்பொருளுடன் (10%) கலக்கப்பட்டு, 30 விநாடிகள் குலுக்கப்பட்டு, 5 நிமிடங்கள் இருட்டில் வைக்கப்பட்டது. பின்னர், ஒவ்வொரு குழாயிலும் 0.5 மில்லி 20% சோடியம் கார்பனேட் கரைசல் (Na2CO3; அல்-கோம்ஹோரியா மருந்துகள் மற்றும் மருத்துவப் பொருட்கள் நிறுவனம், கெய்ரோ, எகிப்து) சேர்க்கப்பட்டு, நன்கு கலக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, வினைக்கலவையின் உறிஞ்சுதிறன், UV-160A நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 765 nm-ல் அளவிடப்பட்டது. மாதிரிச் சாறுகளில் உள்ள மொத்த கரையக்கூடிய ஃபீனால்களின் செறிவு, கேலிக் அமில அளவுத்திருத்த வளைகோட்டை (ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், NH, USA) பயன்படுத்தித் தீர்மானிக்கப்பட்டு, ஒரு கிராம் புதிய எடைக்கு மில்லிகிராம் கேலிக் அமிலச் சமானம் (mg GAE g-1 புதிய எடை) என வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டு உள்ளடக்கம், ஜெரிடேன் மற்றும் குழுவினரின் (2006) முறையின்படி, சில சிறிய மாற்றங்களுடன் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, மேற்கூறிய மெத்தனால் சாற்றின் 0.3 மிலி, 5% அலுமினியம் குளோரைடு கரைசலின் (AlCl3; ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், NH, USA) 0.3 மிலி உடன் கலக்கப்பட்டு, தீவிரமாகக் கலக்கப்பட்டு, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. அதனைத் தொடர்ந்து, 10% பொட்டாசியம் அசிடேட் கரைசலின் (அல்-கோம்ஹோரியா ஃபார்மசூட்டிகல்ஸ் அண்ட் மெடிக்கல் சப்ளைஸ், கெய்ரோ, எகிப்து) 0.3 மிலி சேர்க்கப்பட்டு, நன்கு கலக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் இருட்டில் அடைகாக்கப்பட்டது. அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, வினைக்கலவையின் உறிஞ்சுதிறன், UV-160A நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 430 nm-ல் அளவிடப்பட்டது. மாதிரிச் சாறுகளில் உள்ள மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டுகளின் செறிவு, ரூட்டின் அளவுத்திருத்த வளைகோட்டைப் (TCI America, Portland, OR, USA) பயன்படுத்தித் தீர்மானிக்கப்பட்டு, பின்னர் ஒரு கிராம் புதிய எடைக்கு மில்லிகிராம் ரூட்டின் சமானமாக (mg RE g-1 fresh weight) வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
யோகோயாமா மற்றும் ஹிரமாட்சு (2003) முன்மொழிந்த மற்றும் சன் மற்றும் குழுவினரால் (2006) மாற்றியமைக்கப்பட்ட முறையின் அடிப்படையில், பீன் இலைகளின் மொத்த தனி அமினோ அமில உள்ளடக்கம், மாற்றியமைக்கப்பட்ட நின்ஹைட்ரின் வினைப்பொருள் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்டாம், MA, USA) பயன்படுத்தி நிர்ணயிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, 0.1 கிராம் அரைக்கப்பட்ட திசு pH 5.4 தாங்கல் கரைசலுடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது, மற்றும் அதன் மேல்தேங்கிய திரவத்தின் 200 μL, 200 μL நின்ஹைட்ரின் (2%) மற்றும் 200 μL பைரிடின் (10%; ஸ்பெக்ட்ரம் கெமிக்கல், நியூ பிரன்சுவிக், NJ, USA) உடன் வினைபுரியச் செய்யப்பட்டு, கொதிக்கும் நீர் தொட்டியில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் குளிர்விக்கப்பட்டு, UV-160A நிறமாலைமானி (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 580 nm-ல் அளவிடப்பட்டது. மறுபுறம், புரோலின் பேட்ஸ் முறையின்படி (பேட்ஸ் மற்றும் குழுவினர், 1973) நிர்ணயிக்கப்பட்டது. புரோலின் 3% சல்போசாலிசிலிக் அமிலத்தைக் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்டாம், MA, USA) கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. மையவிலக்கலுக்குப் பிறகு, மேல்தேங்கிய திரவத்தின் 0.5 மிலி, 1 மிலி கிளேசியல் அசிட்டிக் அமிலம் (ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், NH, USA) மற்றும் நின்ஹைட்ரின் வினைப்பொருளுடன் கலக்கப்பட்டு, 90°C வெப்பநிலையில் 45 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, குளிர்விக்கப்பட்டது. பின்னர், மேலே குறிப்பிட்ட அதே நிறமாலைமானியைப் பயன்படுத்தி 520 nm-ல் அளவிடப்பட்டது. இலைச் சாறுகளில் உள்ள மொத்த தனி அமினோ அமிலங்கள் மற்றும் புரோலின் ஆகியவை முறையே கிளைசின் மற்றும் புரோலின் அளவுத்திருத்த வளைகோடுகளைப் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) பயன்படுத்தித் தீர்மானிக்கப்பட்டு, mg/g புதிய எடை என்ற அலகில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன.
ஆக்ஸிஜனேற்ற நொதிகளின் நொதிச் செயல்பாட்டைத் தீர்மானிக்க, சுமார் 500 மி.கி. கூழாக்கப்பட்ட திசுவானது, 1 mM EDTA-Na2 (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) மற்றும் 7.5% பாலிவினைல்பைரோலிடோன் (PVP; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 3 மி.லி. 50 mM டிரிஸ் தாங்கல் கரைசல் (pH 7.8) கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. பின்னர் அது குளிரூட்டப்பட்ட நிலையில் (4 °C) 20 நிமிடங்களுக்கு 10,000 × g வேகத்தில் மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டு, அதன் மேல்தேங்கிய திரவம் (பதப்படுத்தப்படாத நொதிச் சாறு) சேகரிக்கப்பட்டது (எல்-நாகர் மற்றும் பலர், 2023; உஸ்மான் மற்றும் பலர், 2023). பின்னர், ஏபி (1984) முறையின்படி, சில சிறிய மாற்றங்களுடன் (எல்-நாகர் மற்றும் பலர், 2023; உஸ்மான் மற்றும் பலர், 2023) கேட்டலேஸின் (CAT) நொதிச் செயல்பாட்டைக் கண்டறிய, அது 2 மிலி 0.1 M சோடியம் பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசல் (pH 6.5; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO, USA) மற்றும் 100 μl 269 mM H2O2 கரைசலுடன் வினைபுரியச் செய்யப்பட்டது. குவாய்கால்-சார்ந்த பெராக்ஸிடேஸின் (POX) நொதிச் செயல்பாடு, ஹாராக் மற்றும் பலர் (2009) முறையைப் பயன்படுத்தி கண்டறியப்பட்டது. (2008) இல் இருந்து சிறு மாற்றங்களுடன் (எல்-நாகர் மற்றும் பலர்., 2023; உஸ்மான் மற்றும் பலர்., 2023) பாலிஃபீனால் ஆக்சிடேஸ் (PPO) இன் நொதிச் செயல்பாடு, 2.2 மிலி 100 mM சோடியம் பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசல் (pH 6.0), 100 μl குவாய்கால் (TCI கெமிக்கல்ஸ், போர்ட்லேண்ட், OR, USA) மற்றும் 100 μl 12 mM H2O2 உடன் வினைபுரிந்த பிறகு தீர்மானிக்கப்பட்டது. இந்த முறை (எல்-நாகர் மற்றும் பலர்., 2023; உஸ்மான் மற்றும் பலர்., 2023) இலிருந்து சிறிதளவு மாற்றியமைக்கப்பட்டது. 0.1 M பாஸ்பேட் இடையகக் கரைசலில் (pH 6.0) புதிதாகத் தயாரிக்கப்பட்ட 3 மிலி கேட்டகால் கரைசல் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்டாம், MA, USA) (0.01 M) உடன் வினைபுரிந்த பிறகு இந்தச் சோதனை செய்யப்பட்டது. UV-160A நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு, ஜப்பான்) பயன்படுத்தி, 240 nm-ல் (A240) H2O2-வின் சிதைவைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் CAT செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது; 436 nm-ல் (A436) உறிஞ்சுதலில் ஏற்படும் அதிகரிப்பைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் POX செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது; மற்றும் 3 நிமிடங்களுக்கு ஒவ்வொரு 30 வினாடிக்கும் 495 nm-ல் (A495) உறிஞ்சுதலில் ஏற்படும் ஏற்ற இறக்கங்களைப் பதிவு செய்வதன் மூலம் PPO செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது.
கடைசி சிகிச்சைக்கு 72 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, அவரை இலைகளில் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) பெராக்ஸிசோமல் கேட்டலேஸ் (PvCAT1; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். KF033307.1), சூப்பராக்சைடு டிஸ்முடேஸ் (PvSOD; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். XM_068639556.1), மற்றும் குளுட்டாதயோன் ரிடக்டேஸ் (PvGR; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். KY195009.1) உள்ளிட்ட மூன்று ஆன்டிஆக்ஸிடன்ட் தொடர்பான மரபணுக்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் அளவுகளைக் கண்டறிய நிகழ்நேர RT-PCR பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, சிம்ப்ளி பி டோட்டல் ஆர்என்ஏ எக்ஸ்ட்ராக்ஷன் கிட் (Cat. No. BSC52S1; பயோஃப்ளக்ஸ், பயோரி டெக்னாலஜி, சீனா) பயன்படுத்தி ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. பின்னர், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, டாப் ஸ்கிரிப்ட்™ சிடிஎன்ஏ சிந்தசிஸ் கிட் பயன்படுத்தி சிடிஎன்ஏ தொகுக்கப்பட்டது. மேற்கூறிய மூன்று மரபணுக்களின் பிரைமர் வரிசைகள் துணை அட்டவணை S3-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. PvActin-3 (GenBank அணுகல் எண்: XM_068616709.1) ஹவுஸ்கீப்பிங் மரபணுவாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் சார்பு மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCT முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது (லிவாக் மற்றும் ஷ்மிட்கென், 2001). உயிரியல் அழுத்தம் (பொதுவான பயறுவகைத் தாவரங்களுக்கும் ஆந்த்ராக்னோஸ் பூஞ்சையான கோலெட்ரோட்ரிச்சம் லிண்டெமுத்தியானத்திற்கும் இடையிலான பொருந்தாத தொடர்பு) மற்றும் உயிரற்ற அழுத்தம் (வறட்சி, உப்புத்தன்மை, குறைந்த வெப்பநிலை) ஆகியவற்றின் கீழ் ஆக்டினின் நிலைத்தன்மை நிரூபிக்கப்பட்டது (போர்ஜஸ் மற்றும் பலர், 2012).
நாங்கள் ஆரம்பத்தில், புரதம்-புரதம் BLAST கருவியைப் (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) பயன்படுத்தி, S. sclerotiorum-இல் உள்ள ஆக்சாலோஅசிட்டேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (OAH) புரதங்களின் மரபணுத்தொகுதி அளவிலான கணினிவழிப் பகுப்பாய்வை மேற்கொண்டோம். சுருக்கமாக, S. sclerotiorum-இல் உள்ள ஒத்த புரதத்தை (taxide: 5180) வரைபடமாக்குவதற்காக, Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank அணுகல் எண் XP_040799428.1; 342 அமினோ அமிலங்கள்) மற்றும் Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank அணுகல் எண் XP_056833920.1; 316 அமினோ அமிலங்கள்) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்ட OAH-ஐ வினவல் வரிசைகளாகப் பயன்படுத்தினோம். தேசிய உயிரித்தொழில்நுட்பத் தகவல் மையத்தின் (NCBI) இணையதளமான http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ இல் உள்ள ஜென்பேங்கில், மிகச் சமீபத்தில் கிடைக்கப்பெற்ற எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் மரபணுத் தரவுகளுக்கு எதிராக BLASTp நிகழ்த்தப்பட்டது.
மேலும், S. sclerotiorum-இலிருந்து கணிக்கப்பட்ட OAH மரபணு (SsOAH), A. fijiensis CBS 313.89-இலிருந்து AfOAH மற்றும் P. lagena-இலிருந்து PlOAH ஆகியவற்றின் பரிணாமப் பகுப்பாய்வு மற்றும் இனவகை மர வரைபடம் ஆகியவை MEGA11-இல் (Tamura et al., 2021) பெரும நிகழ்தகவு முறை மற்றும் JTT அணி அடிப்படையிலான மாதிரி (Jones et al., 1992) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஊகிக்கப்பட்டன. இந்த இனவகை மர வரைபடமானது, S. sclerotiorum-இலிருந்து கணிக்கப்பட்ட அனைத்து OAH மரபணுக்களின் (SsOAH) புரத வரிசைகள் மற்றும் வினவல் வரிசை ஆகியவற்றின் பன்முக சீரமைப்புப் பகுப்பாய்வுடன், கட்டுப்பாடு அடிப்படையிலான சீரமைப்பு கருவியைப் (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) பயன்படுத்தி இணைக்கப்பட்டது. மேலும், S. sclerotiorum-இலிருந்து பெறப்பட்ட SsOAH-இன் மிகச்சரியாகப் பொருந்தும் அமினோ அமில வரிசைகள், ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)-ஐப் பயன்படுத்தி வினவல் வரிசைகளுடன் (AfOAH மற்றும் PlOAH) (Larkin et al., 2007) சீரமைக்கப்பட்டன, மற்றும் அந்தச் சீரமைப்பில் உள்ள பாதுகாக்கப்பட்ட பகுதிகள் ESPript கருவியைப் (பதிப்பு 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
மேலும், S. sclerotiorum SsOAH-இன் கணிக்கப்பட்ட செயல்பாட்டுப் பிரதிநிதித்துவ டொமைன்கள் மற்றும் பாதுகாக்கப்பட்ட தளங்கள், InterPro கருவியைப் (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) பயன்படுத்தி ஊடாடும் வகையில் வெவ்வேறு குடும்பங்களாக வகைப்படுத்தப்பட்டன (Blum et al., 2021). இறுதியாக, கணிக்கப்பட்ட S. sclerotiorum SsOAH-இன் முப்பரிமாண (3D) கட்டமைப்பு மாதிரியாக்கம், புரத ஹோமாலஜி/அனாலஜி ரெகக்னிஷன் எஞ்சினைப் (Phyre2 சர்வர் பதிப்பு 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது (Kelley et al., 2015) மற்றும் SWISS-MODEL சர்வரைப் (https://swissmodel.expasy.org/) பயன்படுத்தி சரிபார்க்கப்பட்டது (Biasini et al., 2014). கணிக்கப்பட்ட முப்பரிமாண கட்டமைப்புகள் (PDB வடிவம்), UCSF-Chimera தொகுப்பைப் (பதிப்பு 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004) பயன்படுத்தி ஊடாடும் வகையில் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் (Sclerotinia sclerotiorum) பூஞ்சையின் மைசீலியாவில் உள்ள ஆக்சாலோஅசிடேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (SsOAH; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண்: XM_001590428.1) நொதியின் படியெடுத்தல் அளவைத் தீர்மானிக்க, அளவுசார் நிகழ்நேர ஃபுளோரசன்ஸ் பிசிஆர் (Quantitative real-time fluorescence PCR) பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, எஸ். ஸ்க்லெரோடியோரம் பூஞ்சையானது, PDB கொண்ட ஒரு குடுவையில் இடப்பட்டு, மைசீலியா வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக, ஒரு குலுக்கும் இன்குபேட்டரில் (மாடல்: I2400, நியூ பிரன்சுவிக் சயின்டிஃபிக் கோ., எடிசன், NJ, USA) 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில், 24 மணி நேரத்திற்கு 150 rpm வேகத்திலும், தொடர்ச்சியான இருளிலும் (24 மணி நேரம்) வைக்கப்பட்டது. அதன்பிறகு, அந்த செல்கள் எல்-ஆர்னிதைன் (L-ornithine) மற்றும் பூஞ்சைக்கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (Rizolex-T) ஆகியவற்றைக் கொண்டு இறுதி IC50 செறிவுகளில் (முறையே சுமார் 40 மற்றும் 3.2 மி.கி/லி) சிகிச்சையளிக்கப்பட்டு, பின்னர் அதே நிலைமைகளின் கீழ் மேலும் 24 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, வளர்ப்புகள் 5 நிமிடங்களுக்கு 2500 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டு, அதன் மேல்தேங்கிய திரவம் (பூஞ்சை மைசீலியம்) மரபணு வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்விற்காக சேகரிக்கப்பட்டது. இதேபோல், பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களின் மேற்பரப்பில் வெள்ளைப் பூஞ்சை மற்றும் பஞ்சு போன்ற மைசீலியம் உருவாகியிருந்த பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களிலிருந்து, தொற்று ஏற்பட்ட பிறகு 0, 24, 48, 72, 96, மற்றும் 120 மணி நேரங்களில் பூஞ்சை மைசீலியம் சேகரிக்கப்பட்டது. பூஞ்சை மைசீலியத்திலிருந்து ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, பின்னர் மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி சி.டி.என்.ஏ தொகுக்கப்பட்டது. SsOAH-க்கான பிரைமர் வரிசைகள் துணை அட்டவணை S3-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. SsActin (GenBank அணுகல் எண்: XM_001589919.1) பராமரிப்பு மரபணுவாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் சார்பு மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCT முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது (லிவாக் மற்றும் ஷ்மிட்கென், 2001).
ஸு மற்றும் ஜாங் (2000) முறையின்படி, சில சிறிய மாற்றங்களுடன், உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பு (PDB) மற்றும் ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் என்ற பூஞ்சை நோய்க்காரணியைக் கொண்ட தாவர மாதிரிகளில் ஆக்சாலிக் அமிலம் கண்டறியப்பட்டது. சுருக்கமாக, S. ஸ்க்லெரோடியோரம் தனிமங்கள் PDB கொண்ட குடுவைகளில் இடப்பட்டு, பின்னர் பூஞ்சை இழைகளின் வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக, ஒரு குலுக்கும் இன்குபேட்டரில் (மாடல் I2400, நியூ பிரன்சுவிக் சயின்டிஃபிக் கோ., எடிசன், NJ, USA) 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில், 3-5 நாட்களுக்குத் தொடர்ச்சியான இருளில் (24 மணிநேரம்) 150 rpm வேகத்தில் வளர்க்கப்பட்டன. அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, பூஞ்சை வளர்ப்பானது முதலில் வாட்மேன் #1 வடிகட்டித் தாள் வழியாக வடிகட்டப்பட்டு, பின்னர் மீதமுள்ள பூஞ்சை இழைகளை அகற்ற 5 நிமிடங்களுக்கு 2500 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. மேல்தேங்கிய திரவம் சேகரிக்கப்பட்டு, ஆக்சலேட்டின் மேலதிக அளவு நிர்ணயத்திற்காக 4°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டது. தாவர மாதிரிகளைத் தயாரிப்பதற்காக, சுமார் 0.1 கிராம் தாவரத் திசுத் துண்டுகள், காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரைக் கொண்டு மூன்று முறை (ஒவ்வொரு முறையும் 2 மிலி) பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. பின்னர் அந்த மாதிரிகள் 5 நிமிடங்களுக்கு 2500 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டன. அதிலிருந்து வடிக்கப்பட்ட தெளிந்த திரவமானது, வாட்மேன் எண் 1 வடிகட்டித் தாள் வழியாக உலர் வடிகட்டப்பட்டு, மேலதிக பகுப்பாய்விற்காக சேகரிக்கப்பட்டது.
ஆக்சாலிக் அமிலத்தின் அளவுசார் பகுப்பாய்விற்காக, வினைக்கலவையானது ஒரு கண்ணாடி அடைப்பான் கொண்ட குழாயில் பின்வரும் வரிசையில் தயாரிக்கப்பட்டது: 0.2 மிலி மாதிரி (அல்லது PDB வளர்ப்பு வடிகட்டி அல்லது ஆக்சாலிக் அமில தரநிலை கரைசல்), 0.11 மிலி புரோமோபீனால் நீலம் (BPB, 1 mM; ஃபிஷர் கெமிக்கல், பிட்ஸ்பர்க், PA, USA), 0.198 மிலி 1 M சல்ஃபியூரிக் அமிலம் (H2SO4; அல்-கோம்ஹோரியா மருந்துகள் மற்றும் மருத்துவப் பொருட்கள், கெய்ரோ, எகிப்து) மற்றும் 0.176 மிலி 100 mM பொட்டாசியம் டைக்ரோமேட் (K2Cr2O7; TCI கெமிக்கல்ஸ், போர்ட்லேண்ட், OR, USA). பின்னர், அந்தக் கரைசல் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் 4.8 மிலி-க்கு நீர்த்துப் போகச் செய்யப்பட்டு, தீவிரமாகக் கலக்கப்பட்டு, உடனடியாக 60 °C நீர்த் தொட்டியில் வைக்கப்பட்டது. 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, 0.5 மிலி சோடியம் ஹைட்ராக்சைடு கரைசல் (NaOH; 0.75 M) சேர்ப்பதன் மூலம் வினை நிறுத்தப்பட்டது. வினைக்கலவையின் உறிஞ்சுதிறன் (A600), UV-160 நிறமாலைமானியை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 600 nm-ல் அளவிடப்பட்டது. வளர்ப்பு வடிநீர்மங்கள் மற்றும் தாவர மாதிரிகளின் அளவை நிர்ணயிப்பதற்கு, முறையே PDB மற்றும் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர் ஆகியவை கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. வளர்ப்பு வடிநீர்மங்களில் உள்ள ஆக்சாலிக் அமிலச் செறிவுகள், ஒரு மில்லிலிட்டர் PDB ஊடகத்திற்கு மைக்ரோகிராம் ஆக்சாலிக் அமிலம் (μg.mL−1) என்ற அலகிலும், மற்றும் இலைச் சாறுகளில் உள்ள செறிவுகள், ஒரு கிராம் ஈர எடைக்கு மைக்ரோகிராம் ஆக்சாலிக் அமிலம் (μg.g−1 FW) என்ற அலகிலும், ஆக்சாலிக் அமில அளவுத்திருத்த வளைகோட்டைப் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்டாம், MA, USA) பயன்படுத்தி நிர்ணயிக்கப்பட்டன.
வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்பட்டாலன்றி, இந்த ஆய்வு முழுவதும், அனைத்து சோதனைகளும் முழுமையாக சமவாய்ப்பு வடிவமைப்பில் (CRD) வடிவமைக்கப்பட்டன; ஒவ்வொரு சிகிச்சைக்கும் ஆறு உயிரியல் பிரதிகள் மற்றும் ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதிக்கும் ஐந்து தொட்டிகள் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்) இருந்தன. உயிரியல் பிரதிகள் இரட்டிப்பாக (இரண்டு தொழில்நுட்பப் பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. தொழில்நுட்பப் பிரதிகள், அதே சோதனையின் மீண்டும் செய்யக்கூடிய தன்மையைச் சரிபார்க்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் தவறான பிரதிகளைத் தவிர்ப்பதற்காகப் புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்படவில்லை. தரவுகள், மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (ANOVA) மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து டக்கி-கிரேமர் நேர்மையான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு (HSD) சோதனை (p ≤ 0.05) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்திப் புள்ளிவிவர ரீதியாகப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. இன் விட்ரோ சோதனைகளுக்கு, IC50 மற்றும் IC99 மதிப்புகள் புரோபிட் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டு, 95% நம்பிக்கை இடைவெளிகள் கணக்கிடப்பட்டன.
எகிப்தின் எல் கபியா மாகாணத்தில் உள்ள வெவ்வேறு சோயாபீன் வயல்களில் இருந்து மொத்தம் நான்கு தனித்த மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டன. PDA ஊடகத்தில், அனைத்து தனித்த மாதிரிகளும் கிரீம் வெள்ளை நிற மைசீலியத்தை உருவாக்கின, அது விரைவாகப் பஞ்சு போன்ற வெள்ளை நிறமாகவும் (படம் 1A), பின்னர் ஸ்க்லரோஷியம் நிலையில் வெளிர் பழுப்பு அல்லது பழுப்பு நிறமாகவும் மாறியது. ஸ்க்லரோஷியங்கள் பொதுவாக அடர்த்தியானவை, கருப்பு நிறமானவை, கோள வடிவமானவை அல்லது ஒழுங்கற்றவை, 5.2 முதல் 7.7 மிமீ நீளமும் 3.4 முதல் 5.3 மிமீ விட்டமும் கொண்டவை (படம் 1B). 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 10-12 நாட்கள் அடைக்காத்தலுக்குப் பிறகு, நான்கு தனித்த மாதிரிகளும் வளர்ப்பு ஊடகத்தின் விளிம்பில் ஸ்க்லரோஷியங்களின் ஓர அமைப்பை உருவாக்கியிருந்தாலும் (படம் 1A), ஒரு தட்டில் உள்ள ஸ்க்லரோஷியங்களின் எண்ணிக்கை அவற்றுக்கிடையே குறிப்பிடத்தக்க அளவு வேறுபட்டிருந்தது (P < 0.001). தனித்த மாதிரி 3 அதிக எண்ணிக்கையிலான ஸ்க்லரோஷியங்களைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தட்டிற்கு 32.33 ± 1.53 ஸ்க்லரோஷியங்கள்; படம் 1C). அதேபோல், தனிமம் #3 மற்ற தனிமங்களை விட PDB-யில் அதிக ஆக்சாலிக் அமிலத்தை உற்பத்தி செய்தது (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; படம் 1D). தனிமம் #3, தாவர நோய்க்காரகப் பூஞ்சையான ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரத்தின் வழக்கமான உருவவியல் மற்றும் நுண்ணோக்கிப் பண்புகளைக் காட்டியது. உதாரணமாக, PDA-வில், தனிமம் #3-இன் காலனிகள் வேகமாக வளர்ந்தன, அவை கிரீம் வெள்ளை (படம் 1A), பின்புறம் பழுப்பு அல்லது வெளிர் சால்மன் மஞ்சள்-பழுப்பு நிறத்தில் இருந்தன, மேலும் 9 செ.மீ விட்டம் கொண்ட தட்டின் மேற்பரப்பை முழுமையாக மூட 25 ± 2°C வெப்பநிலையில் 6-7 நாட்கள் தேவைப்பட்டன. மேற்கூறிய உருவவியல் மற்றும் நுண்ணோக்கிப் பண்புகளின் அடிப்படையில், தனிமம் #3 ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் என அடையாளம் காணப்பட்டது.
படம் 1. பொதுவான பயறு வகைப் பயிர்களிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம் (S. sclerotiorum) பூஞ்சைகளின் பண்புகளும் நோயுண்டாக்கும் தன்மையும். (A) PDA ஊடகத்தில் நான்கு எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம் பூஞ்சைகளின் பூஞ்சை இழை வளர்ச்சி, (B) நான்கு எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம் பூஞ்சைகளின் ஸ்க்லரோஷியா, (C) ஸ்க்லரோஷியாக்களின் எண்ணிக்கை (ஒரு தட்டுக்கு), (D) PDB ஊடகத்தில் ஆக்சாலிக் அமிலச் சுரப்பு (μg.mL−1), மற்றும் (E) பசுமைக்குடில் சூழலில், எளிதில் பாதிப்படையக்கூடிய வணிகப் பயறு இரகமான கிசா 3 (Giza 3) மீது நான்கு எஸ். ஸ்க்லரோஷியோரம் பூஞ்சைகளின் நோய் தீவிரம் (%). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன. வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையே புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05). (F–H) பூஞ்சை #3-ஐக் கொண்டு நோயூட்டப்பட்ட 10 நாட்களுக்குப் பிறகு (dpi), முறையே தரைக்கு மேலுள்ள தண்டுகளிலும் காய்களிலும் வழக்கமான வெள்ளைப் பூஞ்சை அறிகுறிகள் தோன்றின. (I) S. sclerotiorum தனிமம் #3-இன் உள் படியெடுக்கப்பட்ட இடைவெளி (ITS) பகுதியின் பரிணாமப் பகுப்பாய்வானது, பெரும நிகழ்தகவு முறையைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டு, தேசிய உயிரித்தொழில்நுட்பத் தகவல் மையத்தின் (NCBI) தரவுத்தளத்திலிருந்து (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) பெறப்பட்ட 20 குறிப்புத் தனிமங்கள்/விகாரங்களுடன் ஒப்பிடப்பட்டது. தொகுப்பாக்கக் கோடுகளுக்கு மேலே உள்ள எண்கள் பகுதிப் பரவலையும் (%), தொகுப்பாக்கக் கோடுகளுக்குக் கீழே உள்ள எண்கள் கிளை நீளத்தையும் குறிக்கின்றன.
மேலும், நோயுண்டாக்கும் தன்மையை உறுதிப்படுத்த, பெறப்பட்ட நான்கு எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமங்கள், பசுமைக்குடில் சூழலில், எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய வணிக பீன் இரகமான கிசா 3-இல் நோயூட்டப் பயன்படுத்தப்பட்டன. இது கோக்கின் கோட்பாடுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் 1E). பெறப்பட்ட அனைத்து பூஞ்சைத் தனிமங்களும் நோயுண்டாக்கும் தன்மை கொண்டவையாகவும், பச்சை பீன் (கிசா 3 இரகம்) செடியைத் தாக்கக்கூடியவையாகவும் இருந்தபோதிலும், நோயூட்டம் செய்த 10 நாட்களுக்குப் பிறகு (dpi), தரைக்கு மேலுள்ள அனைத்துப் பாகங்களிலும் (படம் 1F), குறிப்பாகத் தண்டுகளிலும் (படம் 1G) மற்றும் காய்களிலும் (படம் 1H) வழக்கமான வெண்பூஞ்சை அறிகுறிகளை ஏற்படுத்தின. இருப்பினும், இரண்டு தனித்தனி சோதனைகளில் தனிமம் 3 மிகவும் வீரியம் மிக்கதாக இருந்தது. பீன் செடிகளில் தனிமம் 3 மிக உயர்ந்த நோய் தீவிரத்தைக் (%) கொண்டிருந்தது (நோய்த்தொற்றுக்குப் பிறகு 7, 14, மற்றும் 21 நாட்களில் முறையே 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, மற்றும் 76.7 ± 3.1; படம் 1F).
மிகவும் ஆக்கிரமிப்புத் திறன் கொண்ட S. sclerotiorum தனிமம் #3-இன் அடையாளம், அகப் படியெடுக்கப்பட்ட இடைவெளி (ITS) வரிசைமுறைப்படுத்தலின் அடிப்படையில் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம் 1I). தனிமம் #3 மற்றும் 20 குறிப்புத் தனிமங்கள்/வகைகளுக்கு இடையேயான மரபுவழிப் பகுப்பாய்வு, அவற்றுக்கிடையே அதிக ஒற்றுமையைக் (>99%) காட்டியது. S. sclerotiorum தனிமம் #3 (533 bp), உலர்ந்த பட்டாணி விதைகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அமெரிக்க S. sclerotiorum தனிமம் LPM36 (GenBank அணுகல் எண் MK896659.1; 540 bp) மற்றும் ஊதா (Matthiola incana) தண்டு அழுகலை ஏற்படுத்தும் சீன S. sclerotiorum தனிமம் YKY211 (GenBank அணுகல் எண் OR206374.1; 548 bp) ஆகியவற்றுடன் அதிக ஒற்றுமையைக் கொண்டுள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இவை அனைத்தும் மரக்கிளை வரைபடத்தின் (படம் 1I) மேற்பகுதியில் தனித்தனியாகக் குழுவாக அமைந்துள்ளன. புதிய வரிசைமுறை NCBI தரவுத்தளத்தில் பதிவேற்றப்பட்டு, “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank அணுகல் எண் PV202792) எனப் பெயரிடப்பட்டுள்ளது. தனிமம் 3 மிகவும் ஊடுருவும் தன்மை கொண்டது என்பது தெளிவாகிறது; எனவே, அடுத்தடுத்த அனைத்து சோதனைகளிலும் ஆய்வுக்காக இந்தத் தனிமமே தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.
S. sclerotiorum தனிமம் 3-க்கு எதிராக, டயமைன் எல்-ஆர்னிதைனின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) வெவ்வேறு செறிவுகளில் (12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 மி.கி/லி) உள்ள பாக்டீரியா எதிர்ப்புச் செயல்பாடு ஆய்வகத்தில் ஆராயப்பட்டது. எல்-ஆர்னிதைன் ஒரு பாக்டீரியா எதிர்ப்பு விளைவை ஏற்படுத்தியதும், S. sclerotiorum ஹைஃபாக்களின் ஆர வளர்ச்சியை அதன் அளவைப் பொறுத்து படிப்படியாகத் தடுத்ததும் குறிப்பிடத்தக்கது (படம் 2A, B). சோதிக்கப்பட்ட மிக உயர்ந்த செறிவில் (125 மி.கி/லி), எல்-ஆர்னிதைன் மிக உயர்ந்த மைசீலியல் வளர்ச்சித் தடுப்பு விகிதத்தை (99.62 ± 0.27%; படம் 2B) வெளிப்படுத்தியது. இது, சோதிக்கப்பட்ட மிக உயர்ந்த செறிவில் (10 மி.கி/லி) உள்ள வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி-யின் (தடுப்பு விகிதம் 99.45 ± 0.39%; படம் 2C) செயல்திறனுக்குச் சமமாக இருந்தது, இது ஒத்த செயல்திறனைக் குறிக்கிறது.
படம் 2. ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம்-க்கு எதிரான எல்-ஆர்னிதைனின் இன் விட்ரோ பாக்டீரியா எதிர்ப்புச் செயல்பாடு. (A) எஸ். ஸ்க்லெரோடியோரம்-க்கு எதிரான எல்-ஆர்னிதைனின் வெவ்வேறு செறிவுகளின் பாக்டீரியா எதிர்ப்புச் செயல்பாட்டை, வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (10 மி.கி/லி) உடன் ஒப்பிடுதல். (B, C) முறையே எல்-ஆர்னிதைன் (12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 மி.கி/லி) அல்லது ரிசோலெக்ஸ்-டி (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) ஆகியவற்றின் வெவ்வேறு செறிவுகளுடன் சிகிச்சையளித்த பிறகு எஸ். ஸ்க்லெரோடியோரம் மைசீலியல் வளர்ச்சியின் தடுப்பு விகிதம் (%). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன. வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05). (D, E) முறையே எல்-ஆர்னிதைன் மற்றும் வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி ஆகியவற்றின் ப்ரோபிட் மாதிரி பின்னடைவுப் பகுப்பாய்வு. ப்ரோபிட் மாதிரி பின்னடைவுக் கோடு அடர் நீலக் கோடாகவும், நம்பிக்கை இடைவெளி (95%) புள்ளியிட்ட சிவப்புக் கோடாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது.
மேலும், ப்ரோபிட் பின்னடைவு பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது மற்றும் அதற்கான வரைபடங்கள் அட்டவணை 1 மற்றும் படங்கள் 2D,E-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. சுருக்கமாக, வணிகரீதியான பூஞ்சைக்கொல்லியான Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 மற்றும் p < 0.0001) உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​L-ஆர்னிதைனின் ஏற்றுக்கொள்ளக்கூடிய சாய்வு மதிப்பு (y = 2.92x − 4.67) மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய குறிப்பிடத்தக்க புள்ளிவிவரங்கள் (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 மற்றும் p < 0.0001; படம் 2D) ஆகியவை S. sclerotiorum-க்கு எதிராக மேம்பட்ட பூஞ்சை எதிர்ப்புச் செயல்பாட்டைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன (அட்டவணை 1).
அட்டவணை 1. எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம்-க்கு எதிரான எல்-ஆர்னிதைன் மற்றும் வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான “ரிசோலெக்ஸ்-டி” ஆகியவற்றின் அரை-அதிகபட்ச தடுப்புச் செறிவு (IC50) மற்றும் IC99 (mg/l) மதிப்புகள்.
ஒட்டுமொத்தமாக, சிகிச்சையளிக்கப்படாத எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம்-பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களுடன் (கட்டுப்பாடு; படம் 3A) ஒப்பிடும்போது, ​​எல்-ஆர்னிதைன் (250 மி.கி/லி) சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட பொதுவான அவரைச் செடிகளில் வெள்ளைப்பூஞ்சையின் வளர்ச்சியையும் தீவிரத்தையும் கணிசமாகக் குறைத்தது. சுருக்கமாக, சிகிச்சையளிக்கப்படாத பாதிக்கப்பட்ட கட்டுப்பாட்டுத் தாவரங்களின் நோய்த் தீவிரம் படிப்படியாக அதிகரித்தபோதிலும் (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, மற்றும் 92.33 ± 3.06%), பரிசோதனை முழுவதும் எல்-ஆர்னிதைன் நோய்த் தீவிரத்தை (%) கணிசமாகக் குறைத்தது (சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய 7, 14, மற்றும் 21 நாட்களில் முறையே 8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, மற்றும் 26.36 ± 3.07) (படம் 3A). இதேபோல், S. sclerotiorum-ஆல் பாதிக்கப்பட்ட அவரைச் செடிகளுக்கு 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைன் கொண்டு சிகிச்சை அளித்தபோது, ​​நோய் முன்னேற்ற வளைவின் கீழுள்ள பரப்பளவு (AUDPC), சிகிச்சை அளிக்கப்படாத கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் இருந்த 1274.33 ± 33.13 என்பதிலிருந்து 281.03 ± 7.95 ஆகக் குறைந்தது. இது, நேர்மறைக் கட்டுப்பாடான 50 மி.கி/லி ரிசோலெக்ஸ்-டி பூஞ்சைக்கொல்லியின் (183.61 ± 7.71; படம் 3B) அளவை விடச் சற்றுக் குறைவாக இருந்தது. இரண்டாவது சோதனையிலும் இதே போக்கு காணப்பட்டது.
படம் 3. பசுமைக்குடில் சூழலில், ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் (Sclerotinia sclerotiorum) பூஞ்சையால் ஏற்படும் அவரைச் செடியின் வெள்ளை அழுகல் நோயின் வளர்ச்சியில், வெளிப்புறமாக எல்-ஆர்னிதைன் (L-ornithine) பயன்படுத்துவதால் ஏற்படும் விளைவு. (A) 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைன் கொண்டு சிகிச்சை அளித்த பிறகு, அவரைச் செடியின் வெள்ளைப் பூஞ்சை நோயின் முன்னேற்ற வளைவு. (B) எல்-ஆர்னிதைன் கொண்டு சிகிச்சை அளித்த பிறகு, அவரைச் செடியின் வெள்ளைப் பூஞ்சை நோயின் முன்னேற்ற வளைவின் கீழுள்ள பரப்பளவு (AUDPC). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± திட்ட விலக்கத்தைக் குறிக்கின்றன. வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையே புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05).
வெளிப்புறமாக 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைன் பயன்படுத்தியபோது, ​​42 நாட்களுக்குப் பிறகு தாவரத்தின் உயரம் (படம் 4A), ஒரு தாவரத்திற்கான கிளைகளின் எண்ணிக்கை (படம் 4B) மற்றும் ஒரு தாவரத்திற்கான இலைகளின் எண்ணிக்கை (படம் 4C) படிப்படியாக அதிகரித்தன. ஆய்வு செய்யப்பட்ட அனைத்து ஊட்டச்சத்து அளவுருக்களிலும் வணிகப் பூஞ்சைக்கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (50 மி.கி/லி) மிகப்பெரிய விளைவைக் கொண்டிருந்தாலும், வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்தப்பட்ட 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைன், சிகிச்சை அளிக்கப்படாத கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது இரண்டாவது மிகப்பெரிய விளைவைக் கொண்டிருந்தது (படம் 4A–C). மறுபுறம், எல்-ஆர்னிதைன் சிகிச்சையானது ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளான குளோரோபில் a (படம் 4D) மற்றும் குளோரோபில் b (படம் 4E) ஆகியவற்றின் உள்ளடக்கத்தில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவை ஏற்படுத்தவில்லை, ஆனால் எதிர்மறை கட்டுப்பாடு (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடு (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; படம் 4F) ஆகியவற்றுடன் ஒப்பிடும்போது மொத்த கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கத்தை (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) சற்றே அதிகரித்தது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் எல்-ஆர்னிதைன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட பயறு வகைகளுக்கு தாவர நச்சுத்தன்மையற்றது என்பதையும், அவற்றின் வளர்ச்சியைத் தூண்டக்கூடும் என்பதையும் காட்டுகின்றன.
படம் 4. பசுமைக்குடில் சூழலில், ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோடியோரம் பூஞ்சையால் பாதிக்கப்பட்ட அவரை இலைகளின் வளர்ச்சிப் பண்புகள் மற்றும் ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகள் மீது புறவழியாக எல்-ஆர்னித்தின் பயன்படுத்துவதால் ஏற்படும் விளைவு. (A) தாவர உயரம் (செ.மீ), (B) ஒரு தாவரத்திற்குரிய கிளைகளின் எண்ணிக்கை, (C) ஒரு தாவரத்திற்குரிய இலைகளின் எண்ணிக்கை, (D) குளோரோபில் a உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt), (E) குளோரோபில் b உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt), (F) மொத்த கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± திட்ட விலக்கம் ஆகும். வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையே புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05).
வினைத்திறன் மிக்க ஆக்சிஜன் இனங்கள் (ROS; ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு [H2O2] ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது) மற்றும் தனி радиகல்கள் (சூப்பராக்சைடு அயனிகள் [O2•−] ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது) ஆகியவற்றின் உள்ளிட ஹிஸ்டோகெமிக்கல் இடங்காணல், வெளிப்புறமாக L-ஆர்னிதைன் (250 மி.கி/லி) பயன்படுத்துவது, சிகிச்சையளிக்கப்படாத பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்கள் (முறையே 173.31 ± 12.06 மற்றும் 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) மற்றும் 50 மி.கி/லி வணிக பூஞ்சைக்கொல்லி ரிசோலெக்ஸ்-டி கொண்டு சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்கள் (170.12 ± 9.50 மற்றும் 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) ஆகியவற்றின் திரட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; படம் 5A) மற்றும் O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; படம் 5B) ஆகியவற்றின் திரட்சியை கணிசமாகக் குறைத்தது என்பதை வெளிப்படுத்தியது. 72 மணி நேரத்தில், H2O2 மற்றும் O2•− ஆகியவை முறையே 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 பழ எடை என்ற அளவில் குவிந்தன. hpt-இன் கீழ் அதிக அளவிலான H2O2 மற்றும் O2•− குவிந்தன (படம் 5A, B). இதேபோல், TCA-அடிப்படையிலான மலோன்டியால்டிஹைட் (MDA) மதிப்பீட்டில், S. sclerotiorum-ஆல் பாதிக்கப்பட்ட அவரைச் செடிகளின் இலைகளில் அதிக அளவிலான MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g பழ எடை) குவிந்திருந்தது தெரியவந்தது (படம் 5C). இருப்பினும், L-ஆர்னிதைனை வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்தியபோது, ​​லிப்பிட் பெராக்சிடேஷன் கணிசமாகக் குறைந்தது. சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களில் MDA உள்ளடக்கம் குறைந்ததே (33.08 ± 4.00 nmol.g பழ எடை) இதற்குச் சான்றாகும்.
படம் 5. பசுமைக்குடில் சூழலில், S. sclerotiorum பூஞ்சைத் தொற்று ஏற்பட்ட 72 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, அவரை இலைகளில் புறவழியாக எல்-ஆர்னிதைன் பயன்படுத்துவதால் ஏற்படும் ஆக்சிஜனேற்ற அழுத்தத்தின் முக்கியக் குறிகாட்டிகள் மற்றும் நொதியற்ற ஆக்சிஜனேற்றத் தடுப்புப் பாதுகாப்பு வழிமுறைகள் மீதான விளைவு. (A) 72 hpt-இல் ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt-இல் சூப்பராக்சைடு அயனி (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 hpt-இல் மலோன்டியால்டிஹைடு (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 hpt-இல் மொத்த கரையக்கூடிய பீனால்கள் (mg GAE g−1 FW), (E) 72 hpt-இல் மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டுகள் (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt-இல் மொத்த தனி அமினோ அமிலங்கள் (mg g−1 FW), மற்றும் (G) 72 hpt-இல் புரோலின் உள்ளடக்கம் (mg g−1 FW). மதிப்புகள் 5 உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± திட்ட விலக்கத்தைக் (சராசரி ± SD) குறிக்கின்றன. வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையே புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05).