கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் உள்ள நோயாளிகளிடம், குடலிலிருந்து உருவாகும் டிரிப்டோபான் வளர்சிதை மாற்றப் பொருளான இண்டோல்-3-புரோப்பியோனிக் அமிலத்தின் (IPA) இரத்தச் சீரம் அளவுகள் குறைவாக இருப்பதாக நாங்கள் முன்னர் தெரிவித்திருந்தோம். இந்த ஆய்வில், பருமனான கல்லீரல்களில் உள்ள டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலோமை, இரத்தச் சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புபடுத்தி ஆராய்ந்தோம். அத்துடன், ஆய்வகச் சூழலில் (in vitro) கல்லீரல் ஸ்டெல்லேட் செல்களின் (HSCs) புறத்தோற்றச் செயலிழப்பைத் தூண்டுவதில் IPA-வின் பங்கையும் ஆராய்ந்தோம்.
இந்த ஆய்வில், குவோபியோ பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சை மையத்தில் (KOBS) பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சைக்கு உட்படுத்தப்பட்ட, வகை 2 நீரிழிவு நோய் (T2DM) இல்லாத 116 பருமனான நோயாளிகள் (வயது 46.8 ± 9.3 ஆண்டுகள்; BMI: 42.7 ± 5.0 கி.கி/மீ²) சேர்க்கப்பட்டனர். இரத்தத்தில் சுழலும் IPA அளவுகள் திரவ நிறப்பிரிகை-நிறை நிறமாலைமானி (LC-MS) மூலம் அளவிடப்பட்டன, கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்வு மொத்த RNA வரிசைப்படுத்தல் மூலம் செய்யப்பட்டது, மற்றும் DNA மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு இன்ஃபினியம் ஹியூமன்மெத்திலேஷன்450 பீட் சிப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. இன் விட்ரோ சோதனைகளுக்கு மனித கல்லீரல் ஸ்டெல்லேட் செல்கள் (LX-2) பயன்படுத்தப்பட்டன.
சீரம் IPA அளவுகள், கல்லீரலில் உள்ள அப்போப்டோடிக், மைட்டோஃபேஜிக் மற்றும் நீண்ட ஆயுள் பாதைகளில் ஈடுபட்டுள்ள மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டுடன் தொடர்புடையதாக இருந்தன. கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் சுயவிவரங்களில், AKT செரின்/த்ரியோனைன் கைனேஸ் 1 (AKT1) மரபணுவே மிகவும் அதிகமாகவும் ஆதிக்கம் செலுத்தும் ஊடாடும் மரபணுவாகவும் இருந்தது. IPA சிகிச்சையானது, LX-2 செல்களின் ஃபைப்ரோசிஸ், அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் உயிர்வாழ்வை ஒழுங்குபடுத்துவதாக அறியப்பட்ட மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை நெறிப்படுத்துவதன் மூலம், அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டியது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தைக் குறைத்தது, மற்றும் செல் உருவவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை மாற்றியது.
ஒட்டுமொத்தமாக, இந்தத் தரவுகள், IPA ஆனது சிகிச்சை ரீதியான விளைவுகளைக் கொண்டிருக்கக்கூடும் என்பதையும், அது அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டி, HSC ஃபீனோடைப்பை ஒரு செயலற்ற நிலைக்கு மாற்ற முடியும் என்பதையும் ஆதரிக்கின்றன. இதன் மூலம், HSC செயல்படுத்தல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்தில் குறுக்கிட்டு, கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸைத் தடுப்பதற்கான சாத்தியக்கூறை இது விரிவுபடுத்துகிறது.
உடல் பருமன் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற நோய்க்குறியின் பரவல், வளர்சிதை மாற்றத்துடன் தொடர்புடைய கொழுப்பு கல்லீரல் நோயின் (MASLD) அதிகரித்து வரும் நிகழ்வுகளுடன் தொடர்புடையதாக உள்ளது; இந்த நோய் பொது மக்களில் 25% முதல் 30% வரை பாதிக்கிறது [1]. MASLD நோய்க்காரணியின் முக்கிய விளைவு கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் ஆகும், இது நார் போன்ற புற-செல்லுலார் அணி (ECM) தொடர்ச்சியாகக் குவிவதால் வகைப்படுத்தப்படும் ஒரு மாறும் செயல்முறையாகும் [2]. கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கத்தில் ஈடுபடும் முக்கிய செல்கள் கல்லீரல் ஸ்டெல்லேட் செல்கள் (HSCs) ஆகும், அவை நான்கு அறியப்பட்ட புறத்தோற்றங்களைக் காட்டுகின்றன: அமைதியான, செயல்படுத்தப்பட்ட, செயலிழந்த மற்றும் முதுமையடைந்த [3, 4]. HSC-கள் செயல்படுத்தப்பட்டு, அமைதியான வடிவத்திலிருந்து அதிக ஆற்றல் தேவைகளைக் கொண்ட பெருக்கமடையும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் போன்ற செல்களாக மாறலாம், இதில் α-மென்மையான தசை ஆக்டின் (α-SMA) மற்றும் வகை I கொலாஜன் (Col-I) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு அதிகரிக்கிறது [5, 6]. கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் மீளும்போது, ​​செயல்படுத்தப்பட்ட HSC-கள் அப்போப்டோசிஸ் அல்லது செயலிழப்பு மூலம் அகற்றப்படுகின்றன. இந்த செயல்முறைகளில் ஃபைப்ரோஜெனிக் மரபணுக்களின் டவுன்ரெகுலேஷன் மற்றும் புரோசர்வைவல் மரபணுக்களின் (NF-κB மற்றும் PI3K/Akt சிக்னலிங் பாதைகள் போன்றவை) மாடுலேஷன் [7, 8], அத்துடன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டைனமிக்ஸ் மற்றும் செயல்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் [9] ஆகியவை அடங்கும்.
குடலில் உற்பத்தி செய்யப்படும் டிரிப்டோபான் வளர்சிதை மாற்றப் பொருளான இண்டோல்-3-புரோபியோனிக் அமிலத்தின் (IPA) சீரம் அளவுகள், MASLD [10–13] உட்பட மனித வளர்சிதை மாற்ற நோய்களில் குறைந்து காணப்படுவதாகக் கண்டறியப்பட்டுள்ளது. IPA, உணவு நார்ச்சத்து உட்கொள்ளலுடன் தொடர்புடையது, அதன் ஆக்ஸிஜனேற்ற மற்றும் அழற்சி எதிர்ப்பு விளைவுகளுக்குப் பெயர் பெற்றது, மேலும் உணவினால் தூண்டப்பட்ட ஆல்கஹால் அல்லாத ஸ்டீட்டோஹெபடைடிஸ் (NASH) தோற்றத்தை உயிருள்ள மற்றும் உயிரற்ற சூழல்களில் தணிக்கிறது [11–14]. குவோபியோ பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சை ஆய்வில் (KOBS), கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் இல்லாத பருமனான நோயாளிகளை விட, கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் உள்ள நோயாளிகளில் சீரம் IPA அளவுகள் குறைவாக இருந்தன என்பதை நிரூபித்த எங்கள் முந்தைய ஆய்விலிருந்து சில சான்றுகள் கிடைக்கின்றன. மேலும், மனித கல்லீரல் ஸ்டெல்லேட் செல் (LX-2) மாதிரியில், செல் ஒட்டுதல், செல் இடம்பெயர்வு மற்றும் ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் செயல்படுத்தல் ஆகியவற்றின் பாரம்பரிய குறிப்பான்களாக இருக்கும் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை IPA சிகிச்சை குறைக்கக்கூடும் என்றும், இது ஒரு சாத்தியமான கல்லீரல் பாதுகாப்பு வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் என்றும் நாங்கள் காட்டினோம் [15]. இருப்பினும், HSC அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிர் ஆற்றலைச் செயல்படுத்துவதன் மூலம் IPA எவ்வாறு கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கத்தின் பின்னடைவைத் தூண்டுகிறது என்பது இன்னும் தெளிவாகத் தெரியவில்லை.
உடல் பருமன் கொண்ட ஆனால் வகை 2 நீரிழிவு நோய் இல்லாத (KOBS) நபர்களின் கல்லீரலில், அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோஃபாஜி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் பாதைகளில் செறிந்துள்ள மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டுடன் சீரம் IPA தொடர்புடையது என்பதை இங்கு நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். மேலும், IPA ஆனது செயலிழப்புப் பாதை வழியாக, செயல்படுத்தப்பட்ட குருதியாக்க மூல செல்களை (HSCs) அகற்றி சிதைக்கத் தூண்ட முடியும் என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். இந்த முடிவுகள் IPA-வின் ஒரு புதிய பங்கினை வெளிப்படுத்துகின்றன, இது கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கத்தின் பின்னடைவை ஊக்குவிப்பதற்கான ஒரு சாத்தியமான சிகிச்சை இலக்காக அமைகிறது.
KOBS குழுமத்தில் நடத்தப்பட்ட முந்தைய ஆய்வில், கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் இல்லாத நோயாளிகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கம் உள்ள நோயாளிகளுக்கு இரத்தத்தில் IPA அளவு குறைவாக இருந்தது [15]. வகை 2 நீரிழிவு நோயின் சாத்தியமான குழப்ப விளைவைத் தவிர்ப்பதற்காக, நடந்து கொண்டிருக்கும் KOBS ஆய்விலிருந்து வகை 2 நீரிழிவு நோய் இல்லாத 116 பருமனான நோயாளிகளை (சராசரி வயது ± திட்ட விலகல்: 46.8 ± 9.3 ஆண்டுகள்; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (அட்டவணை 1) ஆய்வு மக்களாகச் சேர்த்துக் கொண்டோம் [16]. அனைத்துப் பங்கேற்பாளர்களும் எழுத்துப்பூர்வமான தகவலறிந்த ஒப்புதலை வழங்கினர், மேலும் இந்த ஆய்வு நெறிமுறையானது ஹெல்சிங்கி பிரகடனத்திற்கு (54/2005, 104/2008 மற்றும் 27/2010) இணங்க வடக்கு சாவோ கவுண்டி மருத்துவமனையின் நெறிமுறைக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்டது.
பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சையின் போது கல்லீரல் பயாப்ஸி மாதிரிகள் பெறப்பட்டு, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட அளவுகோல்களின்படி [17, 18] அனுபவம் வாய்ந்த நோயியல் நிபுணர்களால் ஹிஸ்டாலஜிக்கலாக மதிப்பிடப்பட்டன. மதிப்பீட்டு அளவுகோல்கள் துணை அட்டவணை S1 இல் சுருக்கப்பட்டுள்ளன மற்றும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன [19].
மெட்டபாலோமிக்ஸ் பகுப்பாய்விற்காக (n = 116) உண்ணாவிரத சீரம் மாதிரிகள் இலக்கற்ற திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மாதிரிகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி19 ஒரு UHPLC-qTOF-MS அமைப்பைப் (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. ஐசோபுரோபைல் ஆல்கஹால் (IPA) அடையாளம் காணுதல் தக்கவைப்பு நேரம் மற்றும் MS/MS நிறமாலையை தூய தரநிலைகளுடன் ஒப்பிடுவதன் அடிப்படையில் அமைந்தது. IPA சமிக்ஞை தீவிரம் (உச்சப் பகுதி) அனைத்து அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்வுகளிலும் கருத்தில் கொள்ளப்பட்டது [20].
இல்லுமினா ஹைசீக் 2500-ஐப் பயன்படுத்தி முழு கல்லீரல் ஆர்.என்.ஏ வரிசைப்படுத்தல் செய்யப்பட்டது மற்றும் தரவுகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி [19, 21, 22] முன் செயலாக்கம் செய்யப்பட்டன. மைட்டோமைனர் 4.0 தரவுத்தளத்திலிருந்து [23] தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட 1957 மரபணுக்களைப் பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு/உயிரியல் உருவாக்கத்தைப் பாதிக்கும் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் இலக்கு வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம். கல்லீரல் டி.என்.ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு, முன்பு விவரிக்கப்பட்ட அதே வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி [24, 25] இன்ஃபினியம் ஹியூமன்மெத்திலேஷன்450 பீட் சிப் (இல்லுமினா, சான் டியாகோ, சி.ஏ, யு.எஸ்.ஏ) மூலம் செய்யப்பட்டது.
மனித கல்லீரல் ஸ்டெல்லேட் செல்கள் (LX-2) பேராசிரியர் ஸ்டெஃபானோ ரோமியோ அவர்களால் அன்புடன் வழங்கப்பட்டு, DMEM/F12 ஊடகத்தில் (பயோவெஸ்ட், L0093-500, 1% பென்/ஸ்ட்ரெப்; லோன்சா, DE17-602E, 2% FBS; கிப்கோ, 10270-106) வளர்க்கப்பட்டு பராமரிக்கப்பட்டன. IPA-வின் செயல்படும் அளவைத் தேர்ந்தெடுக்க, LX-2 செல்கள் DMEM/F12 ஊடகத்தில் 24 மணி நேரத்திற்கு IPA-வின் வெவ்வேறு செறிவுகளுடன் (10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM; சிக்மா, 220027) சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. மேலும், HSC-க்களைச் செயலிழக்கச் செய்யும் IPA-வின் திறனை ஆராய, LX-2 செல்கள் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணி நேரத்திற்கு 5 ng/ml TGF-β1 (R&D சிஸ்டம்ஸ், 240-B-002/CF) மற்றும் 1 mM IPA உடன் சேர்த்து சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. தொடர்புடைய கட்டுப்பாட்டுக் காரணிகளுக்காக, TGF-β1 சிகிச்சைக்கு 0.1% BSA கொண்ட 4 nM HCL-ம், IPA சிகிச்சைக்கு 0.05% DMSO-ம் பயன்படுத்தப்பட்டன; மேலும், ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சைக்காக இவை இரண்டும் ஒன்றாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ஐப் பயன்படுத்தி அப்போப்டோசிஸ் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, LX-2 (1 × 10⁵ செல்கள்/கிண்ணம்) 12-கிண்ணத் தட்டுகளில் இரவு முழுவதும் வளர்க்கப்பட்டு, பின்னர் IPA அல்லது IPA மற்றும் TGF-β1 ஆகியவற்றின் பல அளவுகளுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது. அடுத்த நாள், மிதக்கும் மற்றும் ஒட்டிக்கொண்டிருக்கும் செல்கள் சேகரிக்கப்பட்டு, டிரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, PBS உடன் கழுவப்பட்டு, Annexin V பிணைப்பு இடையகத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, FITC-Annexin V மற்றும் 7-AAD உடன் 15 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டது.
உயிருள்ள செல்களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியா, மைட்டோட்ராக்கர்™ ரெட் CMXRos (MTR) (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், கார்ல்ஸ்பேட், CA) பயன்படுத்தி ஆக்சிஜனேற்ற செயல்பாட்டிற்காக சாயமிடப்பட்டது. MTR சோதனைகளுக்காக, LX-2 செல்கள் IPA மற்றும் TGF-β1 உடன் சம அடர்த்தியில் அடைகாக்கப்பட்டன. 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, உயிருள்ள செல்கள் டிரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, PBS உடன் கழுவப்பட்டு, பின்னர் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி [26], 37 °C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 100 μM MTR உடன் அடைகாக்கப்பட்டன. உயிருள்ள செல் உருவவியல் பகுப்பாய்விற்காக, செல் அளவு மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலானது முறையே முன்னோக்கி சிதறல் (FSC) மற்றும் பக்கவாட்டு சிதறல் (SSC) அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
அனைத்துத் தரவுகளும் (30,000 நிகழ்வுகள்) NovoCyte Quanteon (Agilent) மென்பொருளைப் பயன்படுத்திப் பெறப்பட்டு, NovoExpress® 1.4.1 அல்லது FlowJo V.10 மென்பொருளைப் பயன்படுத்திப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, சீஹார்ஸ் XF செல் மைட்டோ ஸ்ட்ரெஸ் பொருத்தப்பட்ட சீஹார்ஸ் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலார் ஃப்ளக்ஸ் அனலைசரைப் (அஜிலென்ட் டெக்னாலஜிஸ், சாண்டா கிளாரா, CA) பயன்படுத்தி ஆக்ஸிஜன் நுகர்வு விகிதம் (OCR) மற்றும் புறச்செல் அமிலமயமாக்கல் விகிதம் (ECAR) ஆகியவை நிகழ்நேரத்தில் அளவிடப்பட்டன. சுருக்கமாக, 2 × 104 LX-2 செல்கள்/கிணறு XF96 செல் வளர்ப்புத் தட்டுகளில் விதைக்கப்பட்டன. இரவு முழுவதும் அடைகாத்த பிறகு, செல்கள் ஐசோபுரோபனால் (IPA) மற்றும் TGF-β1 (துணை முறைகள் 1) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. சீஹார்ஸ் XF செல் ஆற்றல் ஃபீனோடைப் சோதனை அறிக்கை ஜெனரேட்டரை உள்ளடக்கிய சீஹார்ஸ் XF வேவ் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. இதிலிருந்து, ஒரு உயிர் ஆற்றல் சுகாதாரக் குறியீடு (BHI) கணக்கிடப்பட்டது [27].
மொத்த ஆர்.என்.ஏ, சி.டி.என்.ஏ-வாக படியெடுக்கப்பட்டது. குறிப்பிட்ட முறைகளுக்கு, குறிப்பு [15]-ஐப் பார்க்கவும். மனித 60S ரிபோசோமால் அமில புரதம் P0 (RPLP0) மற்றும் சைக்ளோபிலின் A1 (PPIA) mRNA அளவுகள் நிலையான மரபணு கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. குவாண்ட்ஸ்டுடியோ 6 புரோ ரியல்-டைம் பி.சி.ஆர் சிஸ்டம் (தெர்மோ ஃபிஷர், லேண்ட்ஸ்மீர், நெதர்லாந்து) டாக்மேன்™ ஃபாஸ்ட் அட்வான்ஸ்டு மாஸ்டர் மிக்ஸ் கிட் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்) அல்லது சென்சிஃபாஸ்ட் SYBR லோ-ராக்ஸ் கிட் (பயோலைன், BIO 94050) உடன் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் ஒப்பீட்டு Ct மதிப்பு சுழற்சி அளவுருக்கள் (ΔΔCt) மற்றும் ∆∆Ct முறையைப் பயன்படுத்தி சார்பு மரபணு வெளிப்பாட்டு மடங்கு கணக்கிடப்பட்டது. பிரைமர்களின் விவரங்கள் துணை அட்டவணைகள் S2 மற்றும் S3-இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி [28], DNeasy இரத்தம் மற்றும் திசு கிட் (Qiagen) ஐப் பயன்படுத்தி அணுக்கரு டிஎன்ஏ (ncDNA) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ (mtDNA) பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. துணை முறைகள் 2 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, ஒவ்வொரு இலக்கு mtDNA பகுதியின் விகிதத்தை மூன்று அணுக்கரு டிஎன்ஏ பகுதிகளின் வடிவியல் சராசரிக்கு (mtDNA/ncDNA) கணக்கிடுவதன் மூலம் mtDNA இன் ஒப்பீட்டு அளவு கணக்கிடப்பட்டது. mtDNA மற்றும் ncDNA க்கான பிரைமர்களின் விவரங்கள் துணை அட்டவணை S4 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
செல்களுக்கு இடையேயான மற்றும் செல்களுக்குள்ளான மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளைக் காட்சிப்படுத்த, உயிருள்ள செல்கள் மைட்டோட்ராக்கர்™ ரெட் CMXRos (MTR) (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், கார்ல்ஸ்பாட், CA) கொண்டு சாயமிடப்பட்டன. LX-2 செல்கள் (1 × 104 செல்கள்/கிண்ணம்) கண்ணாடி ஸ்லைடுகளில், அதற்கேற்ற கண்ணாடி அடிப்பகுதியைக் கொண்ட வளர்ப்புத் தட்டுகளில் (இபிடி ஜிஎம்பிஹெச், மார்டின்ஸ்ரீட், ஜெர்மனி) வளர்க்கப்பட்டன. 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, உயிருள்ள LX-2 செல்கள் 37 °C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு 100 μM MTR உடன் அடைகாக்கப்பட்டன, மேலும் செல் உட்கருக்கள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி [29] DAPI (1 μg/ml, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) கொண்டு சாயமிடப்பட்டன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகள், Zeiss LSM 800 கான்ஃபோகல் மாட்யூல் பொருத்தப்பட்ட Zeiss Axio Observer இன்வெர்டட் மைக்ரோஸ்கோப்பைப் (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) பயன்படுத்தி, 37 °C வெப்பநிலையில், 5% CO2 கொண்ட ஈரப்பதமான சூழலில், 63×NA 1.3 அப்ஜெக்டிவ் மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. ஒவ்வொரு மாதிரி வகைக்கும் பத்து Z-சீரிஸ் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு Z-சீரிஸிலும் 30 பிரிவுகள் உள்ளன, ஒவ்வொன்றும் 9.86 μm தடிமன் கொண்டது. ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும், ZEN 2009 மென்பொருளைப் (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) பயன்படுத்தி பத்து வெவ்வேறு பார்வைப் புலங்களின் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன, மேலும் துணை முறைகள் 3-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள அளவுருக்களின்படி, ImageJ மென்பொருளைப் (v1.54d) [30, 31] பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
செல்கள் 0.1 M பாஸ்பேட் பஃபரில் உள்ள 2% குளுடரால்டிஹைடு கொண்டு நிலைப்படுத்தப்பட்டன, அதனைத் தொடர்ந்து 1% ஆஸ்மியம் டெட்ராக்சைடு கரைசல் (சிக்மா ஆல்ட்ரிச், MO, USA) கொண்டு நிலைப்படுத்தப்பட்டு, அசிட்டோன் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) கொண்டு படிப்படியாக நீர் நீக்கம் செய்யப்பட்டு, இறுதியாக எப்பாக்சி ரெசினில் பதிக்கப்பட்டன. மிக மெல்லிய பிரிவுகள் தயாரிக்கப்பட்டு, 1% யுரேனைல் அசிட்டேட் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) மற்றும் 1% லெட் சிட்ரேட் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) கொண்டு சாயமேற்றப்பட்டன. 80 kV முடுக்கும் மின்னழுத்தத்தில், JEM 2100F EXII டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோப்பைப் (JEOL Ltd, டோக்கியோ, ஜப்பான்) பயன்படுத்தி மீநுண் கட்டமைப்புப் படங்கள் பெறப்பட்டன.
24 மணி நேரம் IPA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட LX-2 செல்களின் உருவவியல், Zeiss தலைகீழ் ஒளி நுண்ணோக்கியைப் (Zeiss Axio Vert.A1 மற்றும் AxioCam MRm, Jena, Germany) பயன்படுத்தி 50x உருப்பெருக்கத்தில் கட்ட வேறுபாட்டு நுண்ணோக்கியியல் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
மருத்துவத் தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலகல் அல்லது இடைநிலை (இடைக்கால் வீச்சு: IQR) என வெளிப்படுத்தப்பட்டன. மூன்று ஆய்வுக் குழுக்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகளை ஒப்பிடுவதற்கு, ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (தொடர் மாறிகள்) அல்லது χ² சோதனை (வகைப்படுத்தப்பட்ட மாறிகள்) பயன்படுத்தப்பட்டன. பல சோதனைகளுக்கான திருத்தத்திற்கு, தவறான நேர்மறை விகிதம் (FDR) பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் FDR < 0.05 கொண்ட மரபணுக்கள் புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்கவையாகக் கருதப்பட்டன. CpG டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனை IPA சமிக்ஞை செறிவுடன் தொடர்புபடுத்த ஸ்பியர்மேன் தொடர்புப் பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் பெயரளவு p மதிப்புகள் (p < 0.05) அறிவிக்கப்பட்டன.
புழக்கத்தில் உள்ள சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய 3093 கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களில் இருந்து, 268 டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (பெயரளவு p < 0.01), 119 மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (பெயரளவு p < 0.05), மற்றும் 4350 CpG-களுக்கு, வலை அடிப்படையிலான மரபணுத் தொகுப்பு பகுப்பாய்வுக் கருவியான (WebGestalt) மூலம் பாதை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் மரபணுக்களைக் கண்டறிய, இலவசமாகக் கிடைக்கும் Venny DB (பதிப்பு 2.1.0) கருவியும், புரதங்களுக்கு இடையேயான இடைவினைகளைக் காட்சிப்படுத்த StringDB (பதிப்பு 11.5) கருவியும் பயன்படுத்தப்பட்டன.
LX-2 பரிசோதனைக்காக, டி'அகோஸ்டினோ-பியர்சன் சோதனையைப் பயன்படுத்தி மாதிரிகள் இயல்புநிலைக்காகச் சோதிக்கப்பட்டன. தரவுகள் குறைந்தபட்சம் மூன்று உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து பெறப்பட்டு, போன்ஃபெரோனி பிந்தைய சோதனையுடன் ஒருவழி ANOVA-விற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. 0.05-க்கும் குறைவான p-மதிப்பு புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டது. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம் (mean ± SD) என வழங்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் பரிசோதனைகளின் எண்ணிக்கை ஒவ்வொரு படத்திலும் குறிப்பிடப்பட்டுள்ளது. அனைத்துப் பகுப்பாய்வுகளும் வரைபடங்களும் விண்டோஸுக்கான கிராஃப்பேட் பிரிசம் 8 புள்ளிவிவர மென்பொருளைப் (GraphPad Software Inc., பதிப்பு 8.4.3, சான் டியாகோ, அமெரிக்கா) பயன்படுத்திச் செய்யப்பட்டன.
முதலில், சீரம் IPA அளவுகளுக்கும் கல்லீரல், முழு உடல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கும் இடையிலான தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். மொத்த டிரான்ஸ்கிரிப்ட் விவரக்குறிப்பில், சீரம் IPA அளவுகளுடன் மிகவும் வலுவாகத் தொடர்புடைய மரபணு MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; மைட்டோஜென்-ஆக்டிவேட்டட் புரோட்டீன் கைனேஸ்-ஆக்டிவேட்டட் புரோட்டீன் கைனேஸ் 3) ஆகும்; மைட்டோகாண்ட்ரியா தொடர்பான டிரான்ஸ்கிரிப்ட் விவரக்குறிப்பில், மிகவும் வலுவாகத் தொடர்புடைய மரபணு AKT1 (FDR = 0.7621; AKT செரைன்/த்ரியோனைன் கைனேஸ் 1) ஆகும் (கூடுதல் கோப்பு 1 மற்றும் கூடுதல் கோப்பு 2).
பின்னர் நாங்கள் உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளையும் (n = 268; p < 0.01) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளையும் (n = 119; p < 0.05) பகுப்பாய்வு செய்து, இறுதியில் அப்போப்டோசிஸை மிகவும் குறிப்பிடத்தக்க நியமனப் பாதையாக (p = 0.0089) அடையாளம் கண்டோம். சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கு, நாங்கள் அப்போப்டோசிஸ் (FDR = 0.00001), மைட்டோஃபாஜி (FDR = 0.00029) மற்றும் TNF சிக்னலிங் பாதைகள் (FDR = 0.000006) ஆகியவற்றில் கவனம் செலுத்தினோம் (படம் 1A, அட்டவணை 2, மற்றும் துணைப் படங்கள் 1A-B).
சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய மனித கல்லீரலில் உள்ள உலகளாவிய, மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றின் ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்தும் பகுப்பாய்வு. A என்பது 268 உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள், 119 மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் செய்யப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளைக் குறிக்கிறது. இவை சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய 3092 CpG தளங்களில் பொருத்தப்பட்டுள்ளன (உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் செய்யப்பட்டவற்றுக்கு p மதிப்புகள் < 0.01, மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கு p மதிப்புகள் < 0.05). முக்கியமாக ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்தும் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் நடுவில் காட்டப்பட்டுள்ளன (AKT1 மற்றும் YKT6). B சீரம் IPA அளவுகளுடன் குறிப்பிடத்தக்க வகையில் தொடர்புடைய 56 ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்தும் மரபணுக்களிலிருந்து (கருப்புக் கோட்டுப் பகுதி), StringDB என்ற ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தி, மற்ற மரபணுக்களுடன் மிக உயர்ந்த தொடர்பு மதிப்பெண்ணைக் (0.900) கொண்ட 13 மரபணுக்களின் தொடர்பு வரைபடம் உருவாக்கப்பட்டது. பச்சை: மரபணு வகைப்பாட்டின் (GO) செல்லுலார் கூறு: மைட்டோகாண்ட்ரியா (GO:0005739) உடன் பொருத்தப்பட்ட மரபணுக்கள். தரவுகளின் அடிப்படையில் (உரைச் சுரண்டல், சோதனைகள், தரவுத்தளங்கள் மற்றும் இணை வெளிப்பாடு ஆகியவற்றின் அடிப்படையில்), மற்ற புரதங்களுடனான இடைவினைகளில் AKT1 புரதமே மிக உயர்ந்த மதிப்பெண்ணை (0.900) பெற்றுள்ளது. வலையமைப்புக் கணுக்கள் புரதங்களையும், விளிம்புகள் புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைப்புகளையும் குறிக்கின்றன.
குடல் நுண்ணுயிரி வளர்சிதை மாற்றங்கள் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் மூலம் எபிஜெனடிக் அமைப்பை ஒழுங்குபடுத்த முடியும் என்பதால் [32], சீரம் IPA அளவுகள் கல்லீரல் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனுடன் தொடர்புடையதா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய இரண்டு முக்கிய மெத்திலேஷன் தளங்கள் புரோலின்-செரின்-செறிவூட்டப்பட்ட பகுதி 3 (C19orf55) மற்றும் வெப்ப அதிர்ச்சி புரத குடும்பம் B (சிறிய) உறுப்பினர் 6 (HSPB6) ஆகியவற்றிற்கு அருகில் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (கூடுதல் கோப்பு 3). 4350 CpG (p < 0.01) டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடையதாக இருந்தது மற்றும் நீண்ட ஆயுள் ஒழுங்குமுறை பாதைகளில் செறிவூட்டப்பட்டது (p = 0.006) (படம் 1A, அட்டவணை 2, மற்றும் துணைப் படம் 1C).
மனித கல்லீரலில் சீரம் IPA அளவுகள், உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்புகளுக்கு அடிப்படையான உயிரியல் வழிமுறைகளைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, முந்தைய பாதை பகுப்பாய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட மரபணுக்களின் ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும் பகுப்பாய்வை நாங்கள் மேற்கொண்டோம் (படம் 1A). ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும் 56 மரபணுக்களின் (படம் 1A-வில் உள்ள கருப்புக் கோட்டிற்குள்) பாதை செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வின் முடிவுகள், வென் வரைபடத்தில் (துணைப் படம் 2 மற்றும் படம் 1A) காட்டப்பட்டுள்ளபடி, அப்போப்டோசிஸ் பாதை (p = 0.00029) மூன்று பகுப்பாய்வுகளுக்கும் பொதுவான இரண்டு மரபணுக்களை முன்னிலைப்படுத்தியதைக் காட்டியது: AKT1 மற்றும் YKT6 (YKT6 v-SNARE ஹோமோலாக்). சுவாரஸ்யமாக, AKT1 (cg19831386) மற்றும் YKT6 (cg24161647) ஆகியவை சீரம் IPA அளவுகளுடன் நேர்மறையாகத் தொடர்புடையவை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (கூடுதல் கோப்பு 3). மரபணுப் பொருட்களுக்கு இடையேயான சாத்தியமான புரத இடைவினைகளை அடையாளம் காண, ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும் 56 மரபணுக்களில் மிக உயர்ந்த பொதுவான பகுதி மதிப்பெண்ணைக் (0.900) கொண்ட 13 மரபணுக்களை உள்ளீடாகத் தேர்ந்தெடுத்து, ஒரு இடைவினை வரைபடத்தை உருவாக்கினோம். நம்பக நிலை (விளிம்புநிலை நம்பக நிலை) படி, மிக உயர்ந்த மதிப்பெண்ணை (0.900) பெற்ற AKT1 மரபணு முதலிடத்தில் இருந்தது (படம் 1B).
வழிமுறைப் பகுப்பாய்வின் அடிப்படையில், அப்போப்டோசிஸ் முக்கிய வழிமுறையாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், எனவே IPA சிகிச்சையானது இன் விட்ரோவில் HSC-களின் அப்போப்டோசிஸைப் பாதிக்குமா என்பதை ஆராய்ந்தோம். IPA-வின் வெவ்வேறு அளவுகள் (10 μM, 100 μM, மற்றும் 1 mM) LX-2 செல்களுக்கு நச்சுத்தன்மையற்றவை என்பதை நாங்கள் முன்பு நிரூபித்தோம் [15]. இந்த ஆய்வில், 10 μM மற்றும் 100 μM அளவுகளில் IPA சிகிச்சையானது, உயிருள்ள மற்றும் நெக்ரோடிக் செல்களின் எண்ணிக்கையை அதிகரித்தது என்பது தெரியவந்தது. இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​1 mM IPA செறிவில் செல் உயிர்வாழும் தன்மை குறைந்தது, அதே நேரத்தில் செல் நெக்ரோசிஸ் விகிதம் மாறாமல் இருந்தது (படம் 2A, B). அடுத்து, LX-2 செல்களில் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டுவதற்கான உகந்த செறிவைக் கண்டறிய, நாங்கள் 10 μM, 100 μM, மற்றும் 1 mM IPA-வை 24 மணி நேரத்திற்குச் சோதித்தோம் (படம் 2A-E மற்றும் துணைப் படம் 3A-B). சுவாரஸ்யமாக, IPA 10 μM மற்றும் 100 μM ஆகியவை அப்போப்டோசிஸ் விகிதத்தை (%) குறைத்தன; இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​IPA 1 mM தாமதமான அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் அப்போப்டோசிஸ் விகிதத்தை (%) அதிகரித்தது, எனவே இது மேலதிக பரிசோதனைகளுக்காகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது (படங்கள் 2A–D).
IPA, LX-2 செல்களின் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டுகிறது. ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் அப்போப்டோடிக் வீதம் மற்றும் செல் உருவவியலை அளவிட, அனெக்சின் V மற்றும் 7-AAD இரட்டை நிறமூட்டும் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. BA செல்கள், 24 மணி நேரத்திற்கு 10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM IPA உடனோ அல்லது 24 மணி நேரத்திற்கு சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் F–H TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடனோ அடைகாக்கப்பட்டன. A: உயிருள்ள செல்கள் (அனெக்சின் V -/ 7AAD-); B: நெக்ரோடிக் செல்கள் (அனெக்சின் V -/ 7AAD+); C, F: ஆரம்ப நிலை (அனெக்சின் V +/ 7AAD-); D, G: இறுதி நிலை (அனெக்சின் V+/7AAD+); E, H: அப்போப்டோடிக் வீதத்தில் (%) மொத்த ஆரம்ப மற்றும் இறுதி நிலை அப்போப்டோடிக் செல்களின் சதவீதம். தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம் (SD) என வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன, n = 3 தனிப்பட்ட சோதனைகள். போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனையுடன் கூடிய ஒருவழி ANOVA-வைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; ****p < 0.0001
நாம் முன்பு காட்டியது போல், 5 ng/ml TGF-β1 கிளாசிக்கல் மார்க்கர் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை அதிகரிப்பதன் மூலம் HSC செயல்படுத்தலைத் தூண்ட முடியும் [15]. LX-2 செல்கள் 5 ng/ml TGF-β1 மற்றும் 1 mM IPA உடன் இணைந்து சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன (படம் 2E–H). TGF-β1 சிகிச்சையானது அப்போப்டோசிஸ் விகிதத்தை மாற்றவில்லை, இருப்பினும், TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடும்போது IPA இணை சிகிச்சையானது தாமதமான அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் அப்போப்டோசிஸ் விகிதத்தை (%) அதிகரித்தது (படம் 2E–H). இந்த முடிவுகள், 1 mM IPA ஆனது TGF-β1 தூண்டுதலைச் சாராமல் LX-2 செல்களில் அப்போப்டோசிஸை ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தின் மீது IPA ஏற்படுத்தும் விளைவை நாங்கள் மேலும் ஆராய்ந்தோம். கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​1 mM IPA ஆனது ஆக்சிஜன் நுகர்வு விகித (OCR) அளவுருக்களான மைட்டோகாண்ட்ரியல் அல்லாத சுவாசம், அடிப்படை மற்றும் உச்சபட்ச சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு மற்றும் ATP உற்பத்தி ஆகியவற்றைக் குறைத்தது (படம் 3A, B) என்றும், அதே சமயம் உயிர்வலு ஆரோக்கியக் குறியீட்டில் (BHI) எந்த மாற்றமும் இல்லை என்றும் முடிவுகள் காட்டின.
LX-2 செல்களில் IPA மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தைக் குறைக்கிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச வளைவு (OCR) மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச அளவுருக்களாக (மைட்டோகாண்ட்ரியல் அல்லாத சுவாசம், அடிப்படை சுவாசம், அதிகபட்ச சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு, ATP உருவாக்கம், SRC மற்றும் BHI) வழங்கப்படுகிறது. செல்கள் A மற்றும் B முறையே 10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM IPA உடன் 24 மணி நேரம் அடைக்காக்கப்பட்டன. செல்கள் C மற்றும் D முறையே TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணி நேரம் அடைக்காக்கப்பட்டன. அனைத்து அளவீடுகளும் CyQuant கிட்டைப் பயன்படுத்தி DNA உள்ளடக்கத்திற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. BHI: உயிர் ஆற்றல் ஆரோக்கியக் குறியீடு; SRC: சுவாச இருப்புத் திறன்; OCR: ஆக்ஸிஜன் நுகர்வு விகிதம். தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம் (SD) ஆக வழங்கப்பட்டுள்ளன, n = 5 தனிப்பட்ட சோதனைகள். புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் ஒருவழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி பிந்தைய சோதனை ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; மற்றும் ***p < 0.001
TGF-β1-ஆல் செயல்படுத்தப்பட்ட LX-2 செல்களின் உயிர்வலு சுயவிவரத்தில் IPA-வின் விளைவைப் பற்றி மேலும் விரிவான புரிதலைப் பெறுவதற்காக, நாங்கள் OCR மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிஜனேற்ற பாஸ்போரைலேஷனை பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 3C,D). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 சிகிச்சையானது அதிகபட்ச சுவாசம், சுவாச இருப்புத் திறன் (SRC) மற்றும் BHI ஆகியவற்றைக் குறைக்கக்கூடும் என்று முடிவுகள் காட்டின (படம் 3C,D). கூடுதலாக, ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சையானது அடிப்படை சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு மற்றும் ATP உற்பத்தியைக் குறைத்தது, ஆனால் SRC மற்றும் BHI ஆகியவை TGF-β1 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டதை விட கணிசமாக அதிகமாக இருந்தன (படம் 3C,D).
சீஹார்ஸ் மென்பொருளால் வழங்கப்படும் “செல்லுலார் எனர்ஜி ஃபீனோடைப் டெஸ்ட்”-ஐயும் நாங்கள் செய்தோம் (துணைப் படம் 4A–D). துணைப் படம் 3B-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, TGF-β1 சிகிச்சைக்குப் பிறகு OCR மற்றும் ECAR ஆகிய இரண்டு வளர்சிதை மாற்ற ஆற்றல்களும் குறைந்தன; இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது கூட்டு மற்றும் IPA சிகிச்சைக் குழுக்களில் எந்த வித்தியாசமும் காணப்படவில்லை. மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது கூட்டு மற்றும் IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு OCR-இன் அடிப்படை மற்றும் அழுத்த நிலைகள் இரண்டும் குறைந்தன (துணைப் படம் 4C). சுவாரஸ்யமாக, கூட்டு சிகிச்சையிலும் இதேபோன்ற ஒரு போக்கு காணப்பட்டது; அங்கு TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடும்போது ECAR-இன் அடிப்படை மற்றும் அழுத்த நிலைகளில் எந்த மாற்றமும் காணப்படவில்லை (துணைப் படம் 4C). HSC-களில், TGF-β1 சிகிச்சைக்குப் பிறகு மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிடேட்டிவ் பாஸ்போரிலேஷனில் ஏற்பட்ட குறைவும், SCR மற்றும் BHI-ஐ மீட்டெடுப்பதில் கூட்டு சிகிச்சையின் திறனும் வளர்சிதை மாற்ற ஆற்றலை (OCR மற்றும் ECAR) மாற்றவில்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், IPA ஆனது HSC-களில் உள்ள உயிர்ம ஆற்றலைக் குறைக்கக்கூடும் என்பதைக் காட்டுகின்றன; மேலும் இது, HSC-யின் புறத்தோற்றத்தை செயலிழப்பை நோக்கி நகர்த்தும் ஒரு குறைந்த ஆற்றல் சுயவிவரத்தை IPA தூண்டக்கூடும் என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகிறது (துணைப் படம் 4D).
மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் வலைப்பின்னல் இணைப்புகளின் முப்பரிமாண அளவீடு மற்றும் MTR சாயமேற்றல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் IPA-வின் விளைவு ஆராயப்பட்டது (படம் 4 மற்றும் துணைப் படம் 5). படம் 4-இன்படி, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 சிகிச்சையானது சராசரி மேற்பரப்புப் பரப்பளவு, கிளைகளின் எண்ணிக்கை, மொத்தக் கிளை நீளம் மற்றும் கிளைச் சந்திப்புகளின் எண்ணிக்கை ஆகியவற்றைக் குறைத்தது (படம் 4A மற்றும் B) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விகிதத்தைக் கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை உருவவியலுக்கு மாற்றியது (படம் 4C). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​IPA சிகிச்சை மட்டுமே சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் கன அளவைக் குறைத்தது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விகிதத்தைக் கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை உருவவியலுக்கு மாற்றியது (படம் 4A). இதற்கு மாறாக, கோளத்தன்மை, சராசரிக் கிளை நீளம் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு மின்னழுத்தத்தைச் சார்ந்த MTR மூலம் மதிப்பிடப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு (படம் 4A மற்றும் E) ஆகியவை மாற்றமின்றி இருந்தன, மேலும் இந்த அளவுருக்கள் குழுக்களுக்கு இடையில் வேறுபடவில்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், TGF-β1 மற்றும் IPA சிகிச்சையானது உயிருள்ள LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் வடிவம் மற்றும் அளவு மற்றும் வலைப்பின்னல் சிக்கல்தன்மை ஆகியவற்றை மாற்றியமைப்பதாகத் தெரிகிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன.
LX-2 செல்களில் IPA, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இயக்கவியலையும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏவின் செறிவையும் மாற்றுகிறது. A. சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணி நேரம் TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் அடைகாக்கப்பட்ட உயிருள்ள LX-2 செல்களின் பிரதிநிதித்துவ கான்ஃபோகல் படங்கள். இவை, மைட்டோட்ராக்கர்™ ரெட் CMXRos கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலைப்பின்னல்களையும், DAPI கொண்டு நீல நிறத்தில் சாயமேற்றப்பட்ட உட்கருக்களையும் காட்டுகின்றன. அனைத்துத் தரவுகளிலும் ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் குறைந்தது 15 படங்கள் இருந்தன. ஒவ்வொரு மாதிரி வகைக்கும் 10 Z-ஸ்டாக் படங்களை நாங்கள் பெற்றோம். ஒவ்வொரு Z-அச்சு வரிசையும் 30 துண்டுகளைக் கொண்டிருந்தது, ஒவ்வொன்றும் 9.86 μm தடிமன் கொண்டது. அளவுகோல் பட்டை: 10 μm. B. படத்திற்கு ஏற்புநிலை வரம்பைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட பிரதிநிதித்துவப் பொருள்கள் (மைட்டோகாண்ட்ரியா மட்டும்). ஒவ்வொரு குழுவிலும் உள்ள அனைத்து செல்களுக்கும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் வலைப்பின்னல் இணைப்புகளின் அளவுசார் பகுப்பாய்வு மற்றும் ஒப்பீடு செய்யப்பட்டது. C. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவ விகிதங்களின் நிகழ்வெண். 0-க்கு அருகிலுள்ள மதிப்புகள் கோள வடிவங்களையும், 1-க்கு அருகிலுள்ள மதிப்புகள் இழை வடிவங்களையும் குறிக்கின்றன. D மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ (mtDNA) உள்ளடக்கம், பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டபடி தீர்மானிக்கப்பட்டது. E மைட்டோட்ராக்கர்™ ரெட் CMXRos பகுப்பாய்வு, பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டபடி ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி (30,000 நிகழ்வுகள்) மூலம் செய்யப்பட்டது. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம், n = 3 சுயாதீன சோதனைகளாக வழங்கப்பட்டுள்ளன. புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் ஒருவழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
பின்னர், மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கையின் ஒரு குறிகாட்டியாக LX-2 செல்களில் உள்ள mtDNA உள்ளடக்கத்தை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவில் mtDNA உள்ளடக்கம் அதிகரித்திருந்தது (படம் 4D). TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சைக் குழுவில் mtDNA உள்ளடக்கம் குறைந்திருந்தது (படம் 4D). இது, IPA ஆனது mtDNA உள்ளடக்கத்தையும், அத்துடன் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் சுவாசத்தையும் குறைக்கக்கூடும் என்று சுட்டிக்காட்டுகிறது (படம் 3C). மேலும், ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சையில் IPA ஆனது mtDNA உள்ளடக்கத்தைக் குறைப்பதாகத் தோன்றினாலும், அது MTR-மத்தியஸ்த மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் செயல்பாட்டைப் பாதிக்கவில்லை (படம் 4A–C).
LX-2 செல்களில் ஃபைப்ரோஸிஸ், அப்போப்டோசிஸ், உயிர்வாழ்தல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் mRNA அளவுகளுடன் IPA-வின் தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம் (படம் 5A–D). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவானது கொலாஜன் வகை I α2 சங்கிலி (COL1A2), α-மென்மையான தசை ஆக்டின் (αSMA), மேட்ரிக்ஸ் மெட்டாலோபுரோட்டினேஸ் 2 (MMP2), திசு மெட்டாலோபுரோட்டினேஸ் 1 தடுப்பான் (TIMP1), மற்றும் டைனமின் 1-போன்ற மரபணு (DRP1) போன்ற மரபணுக்களின் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டியது, இது அதிகரித்த ஃபைப்ரோஸிஸ் மற்றும் செயல்பாட்டைக் குறிக்கிறது. மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 சிகிச்சையானது நியூக்ளியர் ப்ரெக்னேன் X ஏற்பி (PXR), காஸ்பேஸ் 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-செல் α தடுப்பான், நியூக்ளியர் காரணி κ மரபணு ஒளி பெப்டைடின் மேம்படுத்தி (NFκB1A), மற்றும் நியூக்ளியர் காரணி κB கைனேஸ் துணை அலகு β தடுப்பான் (IKBKB) ஆகியவற்றின் mRNA அளவுகளைக் குறைத்தது (படம் 5A–D). TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடுகையில், TGF-β1 மற்றும் IPA உடனான கூட்டுச் சிகிச்சையானது COL1A2 மற்றும் MMP2 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டைக் குறைத்தது, ஆனால் PXR, TIMP1, B-செல் லிம்போமா-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, மற்றும் IKBKB ஆகியவற்றின் mRNA அளவுகளை அதிகரித்தது. IPA சிகிச்சையானது MMP2, Bcl-2-தொடர்புடைய புரதம் X (BAX), AKT1, பார்வை நரம்பு சிதைவு புரதம் 1 (OPA1), மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு புரதம் 2 (MFN2) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டைக் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைத்தது, அதேசமயம் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடுகையில் CASP8, NFκB1A, NFκB1B, மற்றும் IKBKB ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு அதிகரித்தது. இருப்பினும், காஸ்பேஸ்-3 (CASP3), அப்போப்டோடிக் பெப்டிடேஸ் செயல்படுத்தும் காரணி 1 (APAF1), மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு புரதம் 1 (MFN1), மற்றும் பிளவு புரதம் 1 (FIS1) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் எந்த வித்தியாசமும் காணப்படவில்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் IPA சிகிச்சையானது நார்ப்பெருக்கம், செல் இறப்பு, உயிர்வாழ்தல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன. எங்கள் தரவுகளின்படி, IPA சிகிச்சையானது LX-2 செல்களில் நார்ப்பெருக்கத்தைக் குறைக்கிறது; அதே நேரத்தில், அது புறத்தோற்றத்தை செயலிழப்பு நிலையை நோக்கி மாற்றுவதன் மூலம் உயிர்வாழ்தலைத் தூண்டுகிறது.
LX-2 செல்களில் உள்ள ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட், அப்போப்டோடிக், உயிர்வாழ்தல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை IPA மாற்றியமைக்கிறது. சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணி நேரத்திற்கு TGF-β1 மற்றும் IPA கொண்டு LX-2 செல்கள் தூண்டப்பட்ட பிறகு, உள்ளார்ந்த கட்டுப்பாட்டுடன் (RPLP0 அல்லது PPIA) தொடர்புடைய mRNA வெளிப்பாட்டை வரைபடங்கள் காட்டுகின்றன. A ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களையும், B அப்போப்டோடிக் செல்களையும், C உயிர்வாழும் செல்களையும், மற்றும் D மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மரபணு வெளிப்பாட்டையும் குறிக்கிறது. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம் (SD) ஆக வழங்கப்பட்டுள்ளன, n = 3 தனிப்பட்ட சோதனைகள். ஒருவழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
பின்னர், செல் அளவில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் (FSC-H) மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை (SSC-H) ஆகியவை ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன (படம் 6A,B), மேலும் IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு செல் உருவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) மற்றும் ஃபேஸ் கான்ட்ராஸ்ட் மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன (துணைப் படம் 6A-B). எதிர்பார்த்தபடி, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது TGF-β1 சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட குழுவில் உள்ள செல்கள் அளவில் அதிகரித்தன (படம் 6A,B), இது ரஃப் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் (ER*) மற்றும் ஃபேகோலைசோசோம்களின் (P) வழக்கமான விரிவாக்கத்தைக் காட்டியது, இது ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலைக் குறிக்கிறது (துணைப் படம் 6A). இருப்பினும், TGF-β1 சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 மற்றும் IPA கூட்டு சிகிச்சைக் குழுவில் செல் அளவு, சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை (படம் 6A,B) மற்றும் ER* உள்ளடக்கம் ஆகியவை குறைந்திருந்தன (துணைப் படம் 6A). மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​IPA சிகிச்சையானது செல் அளவு, சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கல்தன்மை (படம் 6A,B), P மற்றும் ER* உள்ளடக்கம் (துணைப் படம் 6A) ஆகியவற்றைக் குறைத்தது. கூடுதலாக, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​IPA சிகிச்சையின் 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு அப்போப்டோடிக் செல்களின் உள்ளடக்கம் அதிகரித்தது (வெள்ளை அம்புகள், துணைப் படம் 6B). ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் 1 mM IPA ஆனது HSC அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டி, TGF-β1 ஆல் தூண்டப்பட்ட செல் உருவவியல் அளவுருக்களில் ஏற்படும் மாற்றங்களை மீளச்செய்து, அதன் மூலம் செல் அளவு மற்றும் சிக்கல்தன்மையை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன; இது HSC செயலிழப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.
IPA, LX-2 செல்களின் செல் அளவையும் சைட்டோபிளாசத்தின் சிக்கலான தன்மையையும் மாற்றுகிறது. ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி பகுப்பாய்வின் மாதிரிப் படங்கள். இந்தப் பகுப்பாய்வில், LX-2 செல்களுக்கென பிரத்யேகமான ஒரு கேட்டிங் உத்தி பயன்படுத்தப்பட்டது: செல் தொகுதியை வரையறுக்க SSC-A/FSC-A, இரட்டை செல்களை அடையாளம் காண FSC-H/FSC-A, மற்றும் செல் அளவு மற்றும் சிக்கலான தன்மை பகுப்பாய்விற்காக SSC-H/FSC-H. செல்கள், சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் 24 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டன. செல் அளவு மற்றும் சைட்டோபிளாசத்தின் சிக்கலான தன்மை பகுப்பாய்விற்காக, LX-2 செல்கள் கீழ் இடது கால்பகுதி (SSC-H-/FSC-H-), மேல் இடது கால்பகுதி (SSC-H+/FSC-H-), கீழ் வலது கால்பகுதி (SSC-H-/FSC-H+), மற்றும் மேல் வலது கால்பகுதி (SSC-H+/FSC-H+) எனப் பிரிக்கப்பட்டன. B. செல் உருவவியல், FSC-H (முன்னோக்கிய சிதறல், செல் அளவு) மற்றும் SSC-H (பக்கவாட்டு சிதறல், சைட்டோபிளாச சிக்கல்தன்மை) (30,000 நிகழ்வுகள்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கம் (SD) ஆகவும், n = 3 தனிப்பட்ட சோதனைகளாகவும் வழங்கப்பட்டுள்ளன. புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் ஒருவழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனை ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 மற்றும் ****p < 0.0001
IPA போன்ற குடல் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் ஆராய்ச்சியின் ஒரு முக்கிய தலைப்பாக மாறியுள்ளன, இது குடல் நுண்ணுயிரிகளில் புதிய இலக்குகள் கண்டறியப்படலாம் என்று கூறுகிறது. எனவே, மனிதர்களில் கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கத்துடன் நாங்கள் தொடர்புபடுத்திய [15] ஒரு வளர்சிதை மாற்றப் பொருளான IPA, விலங்கு மாதிரிகளில் [13, 14] ஒரு சாத்தியமான நார்ப்பெருக்க எதிர்ப்புச் சேர்மமாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது என்பது சுவாரஸ்யமானது. இங்கே, வகை 2 நீரிழிவு (T2D) இல்லாத பருமனான நபர்களில் சீரம் IPA மற்றும் உலகளாவிய கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பை நாங்கள் முதன்முறையாக நிரூபிக்கிறோம், இது அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோஃபாஜி மற்றும் நீண்ட ஆயுளையும், அத்துடன் கல்லீரல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை ஒழுங்குபடுத்தும் AKT1 என்ற சாத்தியமான வேட்பாளர் மரபணுவையும் எடுத்துக்காட்டுகிறது. எங்கள் ஆய்வின் மற்றொரு புதுமை என்னவென்றால், LX-2 செல்களில் அப்போப்டோசிஸ், செல் உருவவியல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிர் ஆற்றலியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் IPA சிகிச்சையின் தொடர்பை நாங்கள் நிரூபித்தோம், இது HSC ஃபீனோடைப்பைச் செயலிழக்கச் செய்வதை நோக்கி மாற்றும் குறைந்த ஆற்றல் நிறமாலையைக் குறிக்கிறது, இது கல்லீரல் நார்ப்பெருக்கத்தை மேம்படுத்துவதற்கான ஒரு சாத்தியமான வேட்பாளராக IPA-வை ஆக்குகிறது.
சுழற்சி சீரம் IPA உடன் தொடர்புடைய கல்லீரல் மரபணுக்களில், அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோபாகி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் ஆகியவை மிக முக்கியமான நியமனப் பாதைகளாக செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் தரக் கட்டுப்பாட்டு (MQC) அமைப்பின் சீர்குலைவு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, மைட்டோபாகி மற்றும் அப்போப்டோசிஸ் ஆகியவற்றிற்கு வழிவகுக்கும், இதன் மூலம் MASLD [33, 34] ஏற்படுவதை ஊக்குவிக்கிறது. எனவே, கல்லீரலில் அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோபாகி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் மூலம் செல் இயக்கவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிப்பதில் IPA ஈடுபடக்கூடும் என்று நாம் ஊகிக்கலாம். எங்கள் தரவு, மூன்று சோதனைகளிலும் இரண்டு மரபணுக்கள் பொதுவானவை என்பதைக் காட்டியது: YKT6 மற்றும் AKT1. YKT6 என்பது செல் சவ்வு இணைவு செயல்பாட்டில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு SNARE புரதம் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இது ஆட்டோபாகோசோமில் STX17 மற்றும் SNAP29 உடன் ஒரு தொடக்கக் கலவையை உருவாக்குவதன் மூலம் ஆட்டோபாகி மற்றும் மைட்டோபாகியில் ஒரு பங்கைக் கொண்டுள்ளது, இதன் மூலம் ஆட்டோபாகோசோம்கள் மற்றும் லைசோசோம்களின் இணைப்பை ஊக்குவிக்கிறது [35]. மேலும், YKT6 செயல்பாட்டின் இழப்பு மைட்டோபாகி குறைபாட்டை ஏற்படுத்துகிறது[36], அதே நேரத்தில் YKT6 இன் அதிகரிப்பு ஹெபடோசெல்லுலார் கார்சினோமா (HCC) முன்னேற்றத்துடன் தொடர்புடையது, இது அதிகரித்த செல் உயிர்வாழ்வைக் காட்டுகிறது[37]. மறுபுறம், AKT1 மிக முக்கியமான ஊடாடும் மரபணுவாகும், மேலும் இது PI3K/AKT சமிக்ஞை பாதை, செல் சுழற்சி, செல் இடம்பெயர்வு, பெருக்கம், ஃபோகல் ஒட்டுதல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மற்றும் கொலாஜன் சுரப்பு உள்ளிட்ட கல்லீரல் நோய்களில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது[38–40]. செயல்படுத்தப்பட்ட PI3K/AKT சமிக்ஞை பாதை, எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் (ECM) உற்பத்திக்கு காரணமான செல்களான ஹெமடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களை (HSCs) செயல்படுத்த முடியும், மேலும் அதன் ஒழுங்கின்மை கல்லீரல் ஃபைப்ரோசிஸ் ஏற்படுவதற்கும் முன்னேறுவதற்கும் பங்களிக்கக்கூடும்[40]. கூடுதலாக, AKT என்பது p53-சார்ந்த செல் அப்போப்டோசிஸைத் தடுக்கும் முக்கிய செல் உயிர்வாழ்வு காரணிகளில் ஒன்றாகும், மேலும் AKT செயல்படுத்தல் கல்லீரல் செல் அப்போப்டோசிஸ் தடுப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்[41, 42]. பெறப்பட்ட முடிவுகள், கல்லீரல் செல்கள் அப்போப்டோசிஸ் நிலைக்குள் நுழைவதா அல்லது உயிர்வாழ்வதா என்ற முடிவைப் பாதிப்பதன் மூலம், கல்லீரல் மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய அப்போப்டோசிஸில் IPA பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்று சுட்டிக்காட்டுகின்றன. இந்த விளைவுகள், கல்லீரல் சமநிலைக்கு இன்றியமையாத AKT மற்றும்/அல்லது YKT6 வேட்பு மரபணுக்களால் ஒழுங்குபடுத்தப்படலாம்.
எங்கள் முடிவுகள், TGF-β1 சிகிச்சையைச் சாராமல், 1 mM IPA ஆனது LX-2 செல்களில் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டி, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தைக் குறைத்தது என்பதைக் காட்டின. ஃபைப்ரோசிஸ் தீர்வு மற்றும் ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுக்கான ஒரு முக்கிய பாதையாக அப்போப்டோசிஸ் இருப்பதும், கல்லீரல் ஃபைப்ரோசிஸின் மீளக்கூடிய உடலியல் பதிலில் இது ஒரு முக்கிய நிகழ்வு என்பதும் குறிப்பிடத்தக்கது [4, 43]. மேலும், ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சைக்குப் பிறகு LX-2 செல்களில் BHI மீட்டெடுக்கப்பட்டது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிர் ஆற்றலியலைக் கட்டுப்படுத்துவதில் IPA-வின் சாத்தியமான பங்கு குறித்த புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்கியது. ஓய்வு மற்றும் செயலற்ற நிலைகளில், ஹீமோபாய்டிக் செல்கள் பொதுவாக ATP-ஐ உற்பத்தி செய்ய மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷனைப் பயன்படுத்துகின்றன மற்றும் குறைந்த வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன. மறுபுறம், HSC செயல்படுத்தல், கிளைகோலிடிக் நிலைக்குள் நுழைவதற்கான ஆற்றல் தேவைகளை ஈடுசெய்ய மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசம் மற்றும் உயிர் தொகுப்பை மேம்படுத்துகிறது [44]. IPA வளர்சிதை மாற்ற ஆற்றல் மற்றும் ECAR-ஐ பாதிக்கவில்லை என்பது கிளைகோலிடிக் பாதைக்கு குறைந்த முன்னுரிமை அளிக்கப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. இதேபோல், மற்றொரு ஆய்வில் 1 mM IPA, கார்டியோமயோசைட்டுகள், மனித ஹெபடோசைட் செல் வரிசை (Huh7) மற்றும் மனித தொப்புள் கொடி நரம்பு எண்டோதீலியல் செல்கள் (HUVEC) ஆகியவற்றில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச சங்கிலி செயல்பாட்டை மாற்றியமைக்க முடிந்தது என்று காட்டியது; இருப்பினும், கார்டியோமயோசைட்டுகளில் கிளைகோலிசிஸில் IPA-வின் எந்த விளைவும் காணப்படவில்லை, இது IPA மற்ற செல் வகைகளின் உயிர் ஆற்றலியலைப் பாதிக்கக்கூடும் என்று கூறுகிறது [45]. எனவே, 1 mM IPA ஒரு லேசான வேதியியல் இணைப்பிழப்பானாக செயல்படக்கூடும் என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம், ஏனெனில் இது mtDNA-வின் அளவை மாற்றாமல் ஃபைப்ரோஜெனிக் மரபணு வெளிப்பாடு, செல் உருவவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிர் ஆற்றலியல் ஆகியவற்றைக் கணிசமாகக் குறைக்க முடியும் [46]. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைப்பிழப்பான்கள் வளர்ப்பினால் தூண்டப்பட்ட ஃபைப்ரோசிஸ் மற்றும் HSC செயல்படுத்தலைத் தடுக்கலாம் [47] மற்றும் இணைப்பிழப்பு புரதங்கள் (UCP) அல்லது அடினைன் நியூக்ளியோடைடு டிரான்ஸ்லோகேஸ் (ANT) போன்ற சில புரதங்களால் கட்டுப்படுத்தப்படும் அல்லது தூண்டப்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ATP உற்பத்தியைக் குறைக்கலாம். செல் வகையைப் பொறுத்து, இந்த நிகழ்வு செல்களை அப்போப்டோசிஸிலிருந்து பாதுகாக்கலாம் மற்றும்/அல்லது அப்போப்டோசிஸை ஊக்குவிக்கலாம் [46]. இருப்பினும், குருதியாக்கத் தண்டு உயிரணுக்களின் செயலிழப்பில், மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிணைப்பு நீக்கியாக IPA-வின் பங்கைத் தெளிவுபடுத்துவதற்கு மேலதிக ஆய்வுகள் தேவைப்படுகின்றன.
பின்னர், உயிருள்ள LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் பிரதிபலிக்கின்றனவா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். சுவாரஸ்யமாக, TGF-β1 சிகிச்சையானது மைட்டோகாண்ட்ரியல் விகிதத்தை கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை வடிவத்திற்கு மாற்றுகிறது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் கிளைத்தல் குறைந்து, மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவின் முக்கிய காரணியான DRP1 இன் வெளிப்பாடு அதிகரிக்கிறது [48]. மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் துண்டாதல் ஒட்டுமொத்த வலைப்பின்னல் சிக்கலுடன் தொடர்புடையது, மற்றும் இணைப்பிலிருந்து பிளவுக்கு மாறுவது ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுக்கு முக்கியமானதாகும், அதேசமயம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவைத் தடுப்பது HSC அப்போப்டோசிஸுக்கு வழிவகுக்கிறது [49]. இவ்வாறு, எங்கள் முடிவுகள், TGF-β1 சிகிச்சையானது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வலைப்பின்னல் சிக்கலைக் குறைத்து, கிளைத்தலைக் குறைக்கக்கூடும் என்பதைக் காட்டுகின்றன, இது செயல்படுத்தப்பட்ட ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களுடன் (HSCs) தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவில் மிகவும் பொதுவானது. மேலும், IPA மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விகிதத்தை கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை வடிவத்திற்கு மாற்றக்கூடும், அதன் மூலம் OPA1 மற்றும் MFN2 இன் வெளிப்பாட்டைக் குறைக்கும் என்பதை எங்கள் தரவுகள் காட்டின. OPA1 இன் குறைவான வெளிப்பாடு மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு ஆற்றலைக் குறைத்து செல் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டக்கூடும் என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன [50]. MFN2 மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் அப்போப்டோசிஸை மத்தியஸ்தம் செய்வதாக அறியப்படுகிறது[51]. பெறப்பட்ட முடிவுகள், TGF-β1 மற்றும்/அல்லது IPA மூலம் LX-2 செல்களைத் தூண்டுவது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவம் மற்றும் அளவு, அத்துடன் செயல்படுத்தல் நிலை மற்றும் நெட்வொர்க் சிக்கலான தன்மையை மாற்றியமைப்பதாகத் தெரிகிறது.
TGFβ-1 மற்றும் IPA ஆகியவற்றின் ஒருங்கிணைந்த சிகிச்சையானது, அப்போப்டோசிஸைத் தவிர்க்கும் செல்களில் உள்ள ஃபைப்ரோசிஸ், அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் உயிர்வாழ்வு தொடர்பான மரபணுக்களின் mRNA வெளிப்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் mtDNA மற்றும் செல் உருவவியல் அளவுருக்களைக் குறைக்கக்கூடும் என்று எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன. உண்மையில், IPA ஆனது AKT1 மற்றும் COL1A2, MMP2 போன்ற முக்கியமான ஃபைப்ரோசிஸ் மரபணுக்களின் mRNA வெளிப்பாட்டு அளவைக் குறைத்தது, ஆனால் அப்போப்டோசிஸுடன் தொடர்புடைய CASP8-இன் வெளிப்பாட்டு அளவை அதிகரித்தது. IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு, BAX வெளிப்பாடு குறைந்து, TIMP1 குடும்பத் துணை அலகுகள், BCL-2 மற்றும் NF-κB ஆகியவற்றின் mRNA வெளிப்பாடு அதிகரித்தது என்று எங்கள் முடிவுகள் காட்டின. இது, அப்போப்டோசிஸைத் தவிர்க்கும் ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களில் (HSCs) IPA உயிர்வாழ்வு சமிக்ஞைகளைத் தூண்டக்கூடும் என்று பரிந்துரைக்கிறது. இந்த மூலக்கூறுகள், செயல்படுத்தப்பட்ட ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களில் உயிர்வாழ்வுக்கு ஆதரவான சமிக்ஞைகளாகச் செயல்படக்கூடும். இது, அப்போப்டோசிஸ்-எதிர்ப்புப் புரதங்களின் (Bcl-2 போன்றவை) அதிகரித்த வெளிப்பாடு, அப்போப்டோசிஸ்-சார்பு BAX-இன் குறைந்த வெளிப்பாடு மற்றும் TIMP-க்கும் NF-κB-க்கும் இடையிலான ஒரு சிக்கலான இடைவினை ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம் [5, 7]. IPA அதன் விளைவுகளை PXR வழியாகச் செலுத்துகிறது, மேலும் TGF-β1 மற்றும் IPA உடனான கூட்டு சிகிச்சையானது PXR mRNA வெளிப்பாட்டு அளவுகளை அதிகரிப்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது HSC செயல்படுத்தலை அடக்குவதைக் குறிக்கிறது. செயல்படுத்தப்பட்ட PXR சமிக்ஞையானது, உயிருள்ள உயிரினங்களிலும் (in vivo) மற்றும் ஆய்வகத்திலும் (in vitro) HSC செயல்படுத்தலைத் தடுப்பதாக அறியப்படுகிறது [52, 53]. எங்கள் முடிவுகள், IPA ஆனது அப்போப்டோசிஸை ஊக்குவிப்பதன் மூலமும், ஃபைப்ரோசிஸ் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்தைக் குறைப்பதன் மூலமும், மற்றும் உயிர்வாழும் சமிக்ஞைகளை மேம்படுத்துவதன் மூலமும், செயல்படுத்தப்பட்ட HSC-களை அகற்றுவதில் பங்கேற்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. இவை செயல்படுத்தப்பட்ட HSC பண்பை செயலிழந்த ஒன்றாக மாற்றும் பொதுவான செயல்முறைகளாகும். அப்போப்டோசிஸில் IPA-வின் சாத்தியமான வழிமுறை மற்றும் பங்குக்கான மற்றொரு விளக்கம் என்னவென்றால், அது செயலிழந்த மைட்டோகாண்ட்ரியாவை முதன்மையாக மைட்டோஃபாஜி (உள்வழிப் பாதை) மற்றும் புறவழி TNF சமிக்ஞைப் பாதை (அட்டவணை 1) வழியாக அகற்றுகிறது, இது NF-κB உயிர்வாழும் சமிக்ஞைப் பாதையுடன் நேரடியாக இணைக்கப்பட்டுள்ளது (துணைப் படம் 7). சுவாரஸ்யமாக, IPA-தொடர்புடைய செறிவூட்டப்பட்ட மரபணுக்கள் அப்போப்டோடிக் பாதையில் புரோ-அப்போப்டோடிக் மற்றும் புரோ-சர்வைவல் சமிக்ஞைகளைத் தூண்ட முடிகிறது [54], IPA இந்த மரபணுக்களுடன் தொடர்புகொள்வதன் மூலம் அப்போப்டோடிக் பாதை அல்லது உயிர்வாழ்வைத் தூண்டக்கூடும் என்று கூறுகிறது. இருப்பினும், HSC செயல்படுத்தலின் போது IPA எவ்வாறு அப்போப்டோசிஸ் அல்லது உயிர்வாழ்வைத் தூண்டுகிறது மற்றும் அதன் இயந்திர பாதைகள் தெளிவாக இல்லை.
IPA என்பது குடல் நுண்ணுயிரிகள் வழியாக உணவில் உள்ள டிரிப்டோபானிலிருந்து உருவாகும் ஒரு நுண்ணுயிரி வளர்சிதை மாற்றப் பொருளாகும். குடல் சூழலில் இது அழற்சி எதிர்ப்பு, ஆக்ஸிஜனேற்ற எதிர்ப்பு மற்றும் எபிஜெனெடிக் ஒழுங்குமுறை பண்புகளைக் கொண்டுள்ளது என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன.[55] IPA குடல் தடுப்புச் செயல்பாட்டை மாற்றியமைத்து ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தைக் குறைக்க முடியும் என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது அதன் உள்ளூர் உடலியல் விளைவுகளுக்கு பங்களிக்கக்கூடும்.[56] உண்மையில், IPA இரத்த ஓட்டம் வழியாக இலக்கு உறுப்புகளுக்கு கொண்டு செல்லப்படுகிறது, மேலும் IPA டிரிப்டோபான், செரோடோனின் மற்றும் இண்டோல் வழித்தோன்றல்களுடன் ஒத்த முக்கிய வளர்சிதை மாற்ற கட்டமைப்பைப் பகிர்ந்து கொள்வதால், IPA வளர்சிதை மாற்றச் செயல்களைச் செய்து போட்டி வளர்சிதை மாற்ற விதிகளுக்கு வழிவகுக்கிறது.[52] IPA, நொதிகள் அல்லது ஏற்பிகளில் உள்ள பிணைப்பு தளங்களுக்காக டிரிப்டோபானிலிருந்து பெறப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களுடன் போட்டியிடக்கூடும், இது சாதாரண வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளை சீர்குலைக்கும். அதன் சிகிச்சை வரம்பை நன்கு புரிந்துகொள்ள, அதன் மருந்தியல் இயக்கவியல் மற்றும் மருந்தியல் விளைவுகள் குறித்த மேலதிக ஆய்வுகளின் தேவையை இது எடுத்துக்காட்டுகிறது.[57] இது குருதியாக்க ஸ்டெம் செல்களிலும் (HSCs) நிகழுமா என்பதைப் பார்க்க வேண்டும்.
எங்கள் ஆய்வில் சில வரம்புகள் உள்ளன என்பதை நாங்கள் ஒப்புக்கொள்கிறோம். குறிப்பாக IPA தொடர்பான தொடர்புகளை ஆராய்வதற்காக, வகை 2 நீரிழிவு நோய் (T2DM) உள்ள நோயாளிகளை நாங்கள் விலக்கினோம். இது, வகை 2 நீரிழிவு நோய் மற்றும் முற்றிய கல்லீரல் நோய் உள்ள நோயாளிகளுக்கு எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளின் பரந்த பொருந்தக்கூடிய தன்மையைக் கட்டுப்படுத்துகிறது என்பதை நாங்கள் ஒப்புக்கொள்கிறோம். மனித சீரத்தில் IPA-வின் உடலியல் செறிவு 1–10 μM [11, 20] ஆக இருந்தாலும், மிக உயர்ந்த நச்சுத்தன்மையற்ற செறிவு [15] மற்றும் மிக உயர்ந்த அப்போப்டோசிஸ் விகிதத்தின் அடிப்படையில் 1 mM IPA செறிவு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது, இதில் நெக்ரோடிக் செல் எண்ணிக்கையின் சதவீதத்தில் எந்த வித்தியாசமும் இல்லை. இந்த ஆய்வில் IPA-வின் மிகை உடலியல் அளவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், IPA-வின் பயனுள்ள அளவு குறித்து தற்போது ஒருமித்த கருத்து இல்லை [52]. எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடத்தக்கவை என்றாலும், IPA-வின் பரந்த வளர்சிதை மாற்ற விதி ஒரு தீவிரமான ஆராய்ச்சிப் பகுதியாகவே உள்ளது. மேலும், சீரம் IPA அளவுகளுக்கும் கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனுக்கும் இடையிலான தொடர்பு குறித்த எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள், ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்கள் (HSCs) மட்டுமல்லாமல் கல்லீரல் திசுக்களிலிருந்தும் பெறப்பட்டன. டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்விலிருந்து நாங்கள் கண்டறிந்த முந்தைய கண்டுபிடிப்புகளின் அடிப்படையில் மனித LX-2 செல்களைப் பயன்படுத்தத் தேர்ந்தெடுத்தோம், அதில் IPA ஹீமோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுடன் தொடர்புடையது [15], மேலும் கல்லீரல் ஃபைப்ரோசிஸ் முன்னேற்றத்தில் HSC-களே முக்கிய செல்கள் ஆகும். கல்லீரல் பல செல் வகைகளால் ஆனது, எனவே IPA-வின் பங்கு மற்றும் பிற கல்லீரல் செல் வகைகளுடனான அதன் தொடர்புகளைப் படிப்பதற்கு, காஸ்பேஸ் செயல்படுத்தல் மற்றும் டிஎன்ஏ துண்டாக்கத்துடன் இணைந்த ஹெபடோசைட்-HSC-இம்யூன் செல் இணை-வளர்ப்பு அமைப்பு போன்ற பிற செல் மாதிரிகள் மற்றும் புரத நிலை உள்ளிட்ட செயல்பாட்டு வழிமுறைகளும் கருத்தில் கொள்ளப்பட வேண்டும்.