சுரப்புப் பாதையில் புரதங்களை வகைப்படுத்துதல் என்பது, செல்களின் உட்பிரிவுகளையும் சமநிலையையும் பேணுவதற்கு இன்றியமையாதது. செல் ஓட்டினால் ஏற்படும் வகைப்படுத்துதலுக்கு மேலதிகமாக, சுரப்புப் போக்குவரத்துச் செயல்பாட்டில் கைனசின்களை வகைப்படுத்துவதில் கொழுப்புகளின் பங்கு என்பது, இதுவரை விடையளிக்கப்படாத ஒரு நீண்டகால அடிப்படைக் கேள்வியாகும். இங்கு, மிக நீண்ட செரமைடு கொழுப்புப் பகுதிகளைக் கொண்ட, புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட கிளைகோசில்பாஸ்பாடிடைல்இனோசிட்டால்-நிலைப்படுத்தப்பட்ட புரதங்கள், சவ்விடைப் புரதங்கள் பயன்படுத்தும் இடத்திலிருந்து வேறுபட்ட, சிறப்பு வாய்ந்த எண்டோபிளாச வலை வெளியேறும் தளங்களில் கொத்தாகக் குவிக்கப்பட்டு வகைப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதை உயிருள்ள உயிரினத்தில் நிரூபிக்க, நாங்கள் முப்பரிமாண, ஒரே நேரத்தில் பலவண்ண, உயர்-தெளிவுத்திறன், நிகழ்நேரப் படமெடுத்தலை மேற்கொள்கிறோம். மேலும், இந்த வகைப்படுத்துதல் தேர்வுக்கு, எண்டோபிளாச வலை சவ்வில் உள்ள செரமைடின் சங்கிலி நீளம் மிக முக்கியமானது என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம். சுரப்புப் பாதையில் உள்ள கொழுப்புச் சங்கிலி நீளத்தின் அடிப்படையில், புரதச் சுமைகளைத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஏற்றுமதித் தளங்களாக வகைப்படுத்துவதற்கான முதல் நேரடி உயிருள்ள உயிரினச் சான்றை எங்கள் ஆய்வு வழங்குகிறது.
யூக்கரியோடிக் செல்களில், எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தில் (ER) தொகுக்கப்பட்ட புரதங்கள், அவற்றின் பொருத்தமான செல்லுலார் இலக்கை அடைவதற்காக சுரப்புப் பாதை வழியாக கொண்டு செல்லப்படும் போது வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன (1). உறை-மத்தியஸ்த வரிசைப்படுத்தலுக்கு கூடுதலாக, சில லிப்பிடுகள் குறிப்பிட்ட புரதங்களை குறிப்பிட்ட சவ்வு களங்களில் தொகுப்பதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியேறும் புள்ளிகளாகவும் செயல்பட முடியும் என்று நீண்ட காலமாக ஊகிக்கப்பட்டது (2-5). இருப்பினும், இந்த சாத்தியமான லிப்பிட் அடிப்படையிலான வழிமுறையை நிரூபிக்க நேரடி இன் விவோ சான்றுகள் இன்னும் இல்லை. இந்த அடிப்படை சிக்கலைத் தீர்க்கும் பொருட்டு, கிளைகோசில்பாஸ்பாடிடைல்இனோசிட்டால் (GPI) நங்கூரமிடப்பட்ட புரதங்கள் (GPI-APகள்) ER-இலிருந்து எவ்வாறு வேறுபட்ட முறையில் வெளியேற்றப்படுகின்றன என்பதை ஈஸ்டில் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். GPI-APகள் என்பவை லிப்பிட்-இணைக்கப்பட்ட செல் மேற்பரப்பு புரதங்களின் ஒரு வகையாகும் (6, 7). GPI-AP என்பது கிளைகோலிப்பிட் பகுதி (GPI நங்கூரம்) மூலம் பிளாஸ்மா சவ்வின் வெளிப்புற அடுக்குகளுடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு சுரக்கும் புரதமாகும். அவை ER லுமினில் GPI நங்கூரங்களை பழமைவாத பிந்தைய மொழிபெயர்ப்பு மாற்றங்களாக ஏற்றுக்கொள்கின்றன (8). இணைந்த பிறகு, GPI-AP, ER-இலிருந்து பிளாஸ்மா சவ்வுக்கு கோல்ஜி கருவி (5, 9) வழியாகச் செல்கிறது. GPI நங்கூரங்களின் இருப்பு, சுரப்புப் பாதையில் (5, 9, 10) சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதங்களிலிருந்து (மற்ற பிளாஸ்மா சவ்வுப் புரதங்கள் உட்பட) GPI-AP-ஐத் தனியாகக் கொண்டு செல்லக் காரணமாகிறது. ஈஸ்ட் செல்களில், GPI-AP-கள் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தில் மற்ற சுரப்புப் புரதங்களிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டு, பின்னர் கோட் புரத வளாகம் II (COPII) (6, 7) மூலம் சுற்றப்பட்ட தனித்துவமான வெசிகல்களில் பொதி செய்யப்படுகின்றன. ER ஏற்றுமதிச் செயல்பாட்டில் இந்த வகைப்படுத்தல் செயல்முறையின் காரணிகள் தெளிவாக இல்லை, ஆனால் இந்த வழிமுறைக்கு லிப்பிடுகள், குறிப்பாக GPI நங்கூரத்தின் லிப்பிட் பகுதியின் கட்டமைப்பு மறுவடிவமைப்பு (5, 8) தேவைப்படலாம் என்று ஊகிக்கப்படுகிறது. ஈஸ்டில், GPI இணைந்த உடனேயே GPI லிப்பிட் மறுவடிவமைப்பு தொடங்குகிறது, மேலும் பல சந்தர்ப்பங்களில், இது செரமைடை 26-கார்பன் நீண்ட சங்கிலி நிறைவுற்ற கொழுப்பு அமிலத்துடன் (C26:0) (11, 12) பிணைக்கச் செய்கிறது. C26 செரமைடு என்பது இதுவரை ஈஸ்ட் செல்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் முக்கிய செரமைடு ஆகும். இது ER-இல் தொகுக்கப்படுகிறது, மேலும் இதன் பெரும்பகுதி COPII வெசிகல்கள் (13) வழியாக கோல்கி கருவிக்கு ஏற்றுமதி செய்யப்படுகிறது. GPI-AP-இன் ER ஏற்றுமதிக்கு குறிப்பாக தொடர்ச்சியான செரமைடு தொகுப்பு தேவைப்படுகிறது (14, 15), மேலும், கோல்கி கருவியில் செரமைடு, இனோசிட்டால் பாஸ்பேட் செரமைடாக (IPC) மாறுவது GPI ஆங்கர் தொகுப்பைச் சார்ந்துள்ளது (16). செயற்கை சவ்வுகளைக் கொண்டு செய்யப்பட்ட உயிர் இயற்பியல் ஆய்வுகள், மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடுகள் ஒன்றிணைந்து தனித்துவமான இயற்பியல் பண்புகளுடன் கூடிய ஒழுங்கமைக்கப்பட்ட களங்களை உருவாக்க முடியும் என்பதைக் காட்டியுள்ளன (17, 18). இந்தத் தரவுகள், C26 செரமைடு மற்றும் C26 செரமைடுடன் கூடிய GPI-AP ஆகியவை, ஒப்பீட்டளவில் ஒழுங்கற்ற ER சவ்வு லிப்பிட் சூழலில், ஒழுங்கான பகுதிகளாக அல்லது பிராந்தியங்களாக ஒன்றிணைய அவற்றின் இயற்பியல் பண்புகளைப் பயன்படுத்துகின்றன என்ற கருதுகோளுக்கு வழிவகுக்கிறது. இது முக்கியமாக குறுகிய மற்றும் நிறைவுறாத கிளிசரோலிப்பிட்களால் (C16:1 மற்றும் C18:1) ஆனது (19, 20). இந்தப் பகுதிகள் குறிப்பிட்ட ER வெளியேறும் தளங்களில் (ERES) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் கவனம் செலுத்தும், அங்கு செரமைடு மற்றும் செரமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP ஆகியவை ஒரே பிரத்யேக COPII வெசிகளில் (5) கோல்கிக்கு இணைந்து கொண்டு செல்லப்படலாம்.
இந்த ஆய்வில், சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் கான்ஃபோகல் ரியல்-டைம் இமேஜிங் மைக்ரோஸ்கோபி (SCLIM) ஐப் பயன்படுத்தி இந்த லிப்பிட் அடிப்படையிலான பொறிமுறையை நாங்கள் நேரடியாக சோதித்துள்ளோம், இது ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிடப்பட்ட புரதங்களை ஒரே நேரத்தில் கவனிக்கக்கூடிய ஒரு அதிநவீன நுண்ணோக்கி நுட்பமாகும். உயிரணுக்களில் மூன்று-வண்ண மற்றும் முப்பரிமாண (3D) படங்கள் மிகவும் அதிக தெளிவுத்திறன் மற்றும் வேகத்தைக் கொண்டுள்ளன (21, 22).
S. cerevisiae-வில் ER-ஐ விட்டு வெளியேறிய பிறகு, C26 செரமைடு குழுவைக் கொண்ட சாதாரண GPI-AP, சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதங்களிலிருந்து எவ்வாறு பிரித்தெடுக்கப்பட்டது என்பதை மேலும் வரையறுக்க, நாங்கள் முதலில் SCLIM தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தினோம். ER-இன் வகைப்பாட்டைச் சரிபார்க்க, உயிருள்ள நிலையில் (in vivo) ERES-க்குள் நுழையும் புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட சரக்குகளை நேரடியாகக் காட்சிப்படுத்தக்கூடிய ஒரு மரபணு அமைப்பை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம் (7, 23). சரக்குகளாக, பச்சை ஒளிரும் புரதத்தால் (GFP) குறியிடப்பட்ட C26 செரமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP Gas1 மற்றும் அண்மை அகச்சிவப்பு ஒளிரும் புரதத்தால் (iRFP) குறியிடப்பட்ட சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதமான Mid2 ஆகியவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்தோம்; இவை இரண்டுமே பிளாஸ்மா சவ்வை இலக்காகக் கொண்டவை (24–26). sec31-1 வெப்பநிலை-உணர்திறன் பிறழ்வில், இந்த இரண்டு சரக்குகளும் ஒரு கேலக்டோஸ்-தூண்டக்கூடிய ஊக்குவிப்பான் மற்றும் ஒரு நிலையான ERES குறிப்பானின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன. தீவிர வெப்பநிலையில் (37°C), sec31-1 பிறழ்வானது COPII மேலுறைக் கூறு Sec31-இன் செயல்பாட்டைப் பாதித்து, COPII முளைத்தல் மற்றும் ER வெளியேற்றத்தைத் தடுப்பதால், புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட சரக்கு ER-இல் குவிகிறது (23). குறைந்த வெப்பநிலைக்கு (24°C) குளிர்விக்கப்பட்ட பிறகு, sec31-1 மரபணு மாற்ற செல்கள் சுரப்புப் பகுதியிலிருந்து மீண்டன, மேலும் குவிந்த புதிய செயற்கைப் பொருள் ER-இலிருந்து வெளியேற்றப்படத் தொடங்கியது. CLIM காட்சிப்படுத்தல், 37°C வெப்பநிலையில் அடைகாத்து, பின்னர் 24°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு வெளியிடப்பட்ட பிறகும், புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP ஆகியவற்றில் பெரும்பாலானவை sec31-1 மரபணு மாற்ற செல்களின் ER-இல் தொடர்ந்து குவிந்திருந்ததைக் காட்டியது (படம் 1). Mid2-iRFP முழு ER சவ்வு முழுவதும் பரவியிருப்பதாலும், Gas1-GFP தொடர்ச்சியற்ற ER சவ்வுப் பகுதியில் செறிந்து குவிந்திருப்பதாலும், அவற்றின் பரவல் முற்றிலும் வேறுபட்டது (படம் 1, A முதல் C வரை மற்றும் காணொளி S1). மேலும், படம் 1D-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, Gas1-GFP கொத்தில் Mid2-iRFP இல்லை. இந்த முடிவுகள், GPI-AP மற்றும் சவ்விடைப் புரதங்கள் ஆரம்பத்திலேயே வெவ்வேறு ER சவ்வுப் பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டன என்பதைக் குறிக்கின்றன. mCherry-யின் COPII கோட் புரதமான Sec13 உடன் லேபிளிடப்பட்ட ஒரு குறிப்பிட்ட ERES-க்கு அருகில் Gas1-GFP கிளஸ்டர் உள்ளது (படம் 1, E மற்றும் F, மற்றும் மூவி S1) (23).
sec31-1 செல்கள் கேலக்டோஸ்-தூண்டப்பட்ட சுரப்புகளை வெளிப்படுத்துகின்றன, ஒரு நீண்ட அசைல் சங்கிலி (C26) செரமைடு GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதமான Mid2-iRFP (TMP, நீலம்). மேலும் இந்த ஆக்கபூர்வமான ERES லேபிளிங் Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டு, 24°C வெப்பநிலைக்கு மாற்றப்பட்டு, 5 நிமிடங்கள் கழித்து SCLIM மூலம் படமெடுக்கப்பட்டது. (A முதல் C வரை) ஒரு தளத்தின் (A) பிரதிநிதித்துவ ஒன்றிணைக்கப்பட்ட அல்லது ஒற்றை 2D படம், 10 z-பிரிவுகளின் (B) 2D ப்ரொஜெக்ஷன் படம் அல்லது கார்கோ மற்றும் ERES மார்க்கர்களின் (C) 3D செல் அரைக்கோளப் படத்தைக் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை 1μm (A மற்றும் B). அளவீட்டு அலகு 0.551μm (C). Gas1-GFP தனித்த ER பகுதிகள் அல்லது கொத்துகளில் கண்டறியப்பட்டது, அதேசமயம் Mid2-iRFP கண்டறியப்பட்டு ER சவ்வு முழுவதும் பரவியிருந்தது (C). (D) இந்த வரைபடம், வெள்ளை அம்புக்குறி கோட்டின் (இடதுபுறம்) வழியே Gas1-GFP தொகுப்பில் உள்ள Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP ஆகியவற்றின் சார்பு ஒளிர்தல் செறிவைக் காட்டுகிறது. AU, தன்னிச்சையான அலகு. (E மற்றும் F) ஆகியவை Gas1-GFP மற்றும் ERES குறியை இணைக்கும் முப்பரிமாணப் படத்தைக் குறிக்கின்றன. Gas1-GFP தொகுப்புகள் குறிப்பிட்ட ERES-க்கு அருகில் கண்டறியப்பட்டன. அளவீட்டு அலகு 0.551μm ஆகும். (F) வெள்ளை திட அம்புக்குறி, ERES உடன் தொடர்புடைய Gas1-GFP தொகுப்பைக் குறிக்கிறது. நடு மற்றும் வலது பலகங்கள், ஒன்றிணைக்கப்பட்ட பெரிதாக்கப்பட்ட முப்பரிமாணப் படத்தையும், தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட Gas1-GFP தொகுப்பின் சுழற்றப்பட்ட காட்சியையும் காட்டுகின்றன.
Gas1-GFP தொகுப்பிற்கும் ஒரு குறிப்பிட்ட ERES-க்கும் இடையிலான நெருங்கிய இடஞ்சார்ந்த உறவானது, Gas1-GFP தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES-க்குள் நுழைய முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. இது, Mid2-iRFP ER-ஐ விட்டு வெளியேறப் பயன்படுத்தும் தேர்ந்தெடுப்பு முறையிலிருந்து வேறுபட்டது. இந்த சாத்தியக்கூற்றை ஆராய்வதற்காக, ஒன்று அல்லது இரண்டு சரக்குகளுக்கு மட்டுமேயான ERES விகிதத்தை நாங்கள் அளவிட்டோம் (படம் 2, A முதல் C வரை). பெரும்பாலான ERES-கள் (70%) ஒரே ஒரு வகை சரக்கை மட்டுமே கொண்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். படம் 2C-யின் கீழ்ப்பகுதிப் படம், Gas1-GFP-ஐ மட்டும் (படம் 1) அல்லது Mid2-iRFP-ஐ மட்டும் (படம் 2) கொண்ட ERES-களின் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளைக் காட்டுகிறது. இதற்கு மாறாக, ஏறக்குறைய 20% ERES-கள் ஒரே பகுதியில் ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் இரண்டு சரக்குகளைக் கொண்டுள்ளன. சில ERES-கள் (10%) இரண்டு வகை சரக்குகளைக் கொண்டிருந்தாலும், அவை தெளிவாக வேறுபட்ட பகுதிகளில் தனிமைப்படுத்தப்பட்டிருந்தன என்பது கண்டறியப்பட்டது. எனவே, இந்த புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வு, ER-இலிருந்து வெளியேற்றப்பட்ட பிறகு, GPI-AP Gas1-GFP மற்றும் சவ்விடை சரக்கான Mid2-iRFP ஆகியவை வெவ்வேறு ERES-களாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 2D). இந்த வரிசைப்படுத்தும் திறன் முந்தைய உயிர்வேதியியல் பகுப்பாய்வு (6) மற்றும் உருவவியல் நிர்ணயம் (7) ஆகியவற்றுடன் மிகவும் ஒத்துப்போகிறது. ERES-க்குள் நுழையும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சரக்கின் நடத்தையையும் நாம் கவனிக்கலாம் (படம் 2E மற்றும் காணொளி S2). Gas1-GFP (பலகம் 3) அல்லது Mid2-iRFP (பலகம் 4) ஆகியவற்றின் ஒரு சிறிய பகுதி மட்டுமே ஒரு பக்கத்திலிருந்து ERES-க்குள் நுழைந்து ஒரு தனித்த பகுதியில் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதை படம் 2E காட்டுகிறது. Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP சில நேரங்களில் ஒரே ERES-இல் காணப்படுகின்றன, ஆனால் அவை வெவ்வேறு பக்கங்களிலிருந்து நுழைந்து, வெவ்வேறு COPII வெசிகல்களைக் குறிக்கக்கூடிய தனித்தனி பகுதிகளில் செறிவூட்டப்படுகின்றன என்பதை படம் 2E-இன் பலகம் 5 காட்டுகிறது. C26 செரமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP Gas1-இன் கவனிக்கப்பட்ட பிரிப்பு மற்றும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES ஆக வகைப்படுத்தல் குறிப்பிட்டது என்பதையும் நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், ஏனெனில் மற்றொரு டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரப்பு சரக்கான, GFP-குறியிடப்பட்ட பிளாஸ்மா சவ்வு புரதம் Axl2 (27), Mid2-iRFP-க்கு ஒத்த நடத்தையைக் காட்டுகிறது. (படம் S1 மற்றும் காணொளி S3). புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட Axl2-GFP, Mid2-iRFP-ஐப் போலவே ER சவ்வு முழுவதும் பரவுகிறது (படம் S1, A மற்றும் B), மேலும் பெரும்பாலான ERES-களில் Mid2-iRFP உடன் இணைந்து காணப்படுகிறது (படம் S1, B முதல் D வரை). படம் 1. S1C-இன் பகுதிகள் 1 மற்றும் 2, இரண்டு சவ்விடை சரக்குகள் ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் ERES-இன் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளைக் காட்டுகின்றன. இந்த நேர்வுகளில், இரண்டு பொருட்களும் ஒன்றாகவே ERES-க்குள் நுழைகின்றன (படம் S1E, பகுதி 3 மற்றும் காணொளி S3).
கேலக்டோஸ் தூண்டக்கூடிய சுரப்புகளான Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (TMP, நீலம்) மற்றும் நிலையான ERES குறியீடான Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) ஆகியவற்றை வெளிப்படுத்தும் sec31-1 செல்கள் 37 °C வெப்பநிலையில் வைக்கப்பட்டன. 30 நிமிடங்கள் அடைகாத்த பிறகு, சுரப்புத் தடையை நீக்குவதற்காக 24 °C வெப்பநிலைக்கு மாற்றப்பட்டு, 20 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு SCLIM மூலம் படமெடுக்கப்பட்டது. (A முதல் C வரை) ERES-ஆல் குறிக்கப்பட்ட உட்பொருட்கள் மற்றும் 10 z-பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ 2D தோற்றப் படங்கள் (A; அளவுகோல், 1μm) அல்லது 3D செல் அரைக்கோளப் படங்கள் (B மற்றும் C; அளவு அலகு, 0.456μm). (B)-இல் உள்ள கீழ்ப்பகுதி மற்றும் (C)-இல் உள்ள பகுதி ஆகியவை ERES-இல் (மெஜந்தா) உள்ள உட்பொருட்களை [Gas1-GFP (சாம்பல்) மற்றும் Mid2-iRFP (வெளிர் நீலம்)] மட்டும் காண்பிப்பதற்காகச் செயலாக்கப்பட்ட படங்களைக் காட்டுகின்றன. (C) திறந்த அம்பு: ERES ஒரே ஒரு சரக்கை (1 முதல் 4 வரை) மட்டுமே கொண்டுள்ளது. சாம்பல் அம்பு: ERES பிரிக்கப்பட்ட சரக்கைக் (5) கொண்டுள்ளது. வெள்ளை திட அம்பு: ERES ஒரே இடத்தில் அமைந்துள்ள சரக்கைக் கொண்டுள்ளது. கீழே: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒற்றை ERES Gas1-GFP (1) அல்லது Mid2-iRFP (2) ஐ மட்டுமே கொண்டுள்ளது. அளவுப் பட்டை, 100 nm. (D) (C)-இல் விவரிக்கப்பட்ட ஒளிநுண்படத்தின் அளவு நிர்ணயம். ஒரே ஒரு சரக்கை (Gas1-GFP அல்லது Mid2-iRFP), பிரிக்கப்பட்ட சரக்கு மற்றும் ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் சரக்கு ஆகியவற்றைக் கொண்ட ERES-இன் சராசரி சதவீதம். மூன்று தனித்தனி சோதனைகளில், 54 செல்களில் n=432. பிழைப் பட்டை = SD. இருமுனை இணைக்கப்படாத t சோதனை. *** P = 0.0002. (E) (C)-ஆல் குறிக்கப்பட்ட தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சரக்கைக் கொண்ட தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES-இன் 3D படம். Gas1-GFP (பச்சை) (3) அல்லது Mid2-iRFP (நீலம்) (4) ஒரு பக்கத்திலிருந்து ERES (மெஜந்தா)-விற்குள் நுழைந்து, ERES-இன் உள்ளே ஒரு சிறிய பகுதிக்குள் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. சில நேரங்களில், இரு வகை சரக்குகளும் ஒரே ERES (5) இல் ஒரே பக்கத்திலிருந்து நுழைந்து, ERES க்குள் ஒரு தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பகுதிக்குள் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன. அளவுகோல் பட்டை, 100 nm.
அடுத்து, ER சவ்வில் உள்ள நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடு (C26), Gas1-ஐ குறிப்பிட்ட ERES-க்குள் குழுவாக்கி வரிசைப்படுத்துகிறது என்ற கருதுகோளை நாங்கள் சோதித்தோம். இதற்காக, நாங்கள் GhLag1 என்ற மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈஸ்ட் வகையைப் பயன்படுத்தினோம். இதில், இரண்டு உள்ளக செரமைடு சின்தேஸ்களான Lag1 மற்றும் Lac1 ஆகியவை GhLag1 (பருத்தியின் Lag1 ஹோமோலாக்) மூலம் மாற்றப்பட்டன. இதன் விளைவாக, இயல்பு வகையை விட குட்டையான செல் சவ்வு செரமைடு கொண்ட ஒரு ஈஸ்ட் வகை உருவானது (படம் 3A) (28). நிறை நிறமாலை (MS) பகுப்பாய்வில், இயல்பு வகை வகைகளில், மொத்த செரமைடில் 95% மிக நீண்ட (C26) சங்கிலி செரமைடு என்றும், GhLag1-ல், 85% செரமைடு மிக நீண்ட (C18 மற்றும் C16) சங்கிலி செரமைடு என்றும் தெரியவந்தது. GhLag1-ல், வெறும் 2% செரமைடு மட்டுமே மிக நீண்ட (C26) சங்கிலி செரமைடு ஆகும். இதுவரை GhLag1 சவ்வில் C18 மற்றும் C16 செரமைடுகளே முக்கிய செரமைடுகளாகக் கண்டறியப்பட்டாலும், MS பகுப்பாய்வு, GhLag1 திரிபில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட Gas1-GFP-யின் GPI ஆங்கரில் C26 செரமைடு இருப்பதையும், அதன் தரம் காட்டுவகை லிப்பிடுகளுக்கு ஒப்பானது என்பதையும் உறுதிப்படுத்தியது (படம் 3A) (26). எனவே, படம் 26-ல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, செரமைடு மறுவடிவமைப்பு நொதியான Cwh43, C26 செரமைடுக்கு அதிகத் தேர்ந்தெடுப்புத் தன்மை கொண்டது; இது GhLag1 திரிபில் உள்ள குறைந்த அளவு C26 செரமைடிலிருந்து GPI ஆங்கரை முன்னுரிமையுடன் இணைத்துக் கொள்கிறது. S2 (29). இருப்பினும், GhLag1-இன் செல் சவ்வு அடிப்படையில் C18-C16 செரமைடை மட்டுமே கொண்டுள்ளது, அதேசமயம் Gas1-GFP-யில் இன்னும் C26 செரமைடு உள்ளது. இந்த உண்மை, ER-இல் உள்ள சவ்வு செரமைடின் அசைல் சங்கிலி நீளம் மற்றும் வகைப்படுத்துதலின் கருதுகோள் பங்கு ஆகிய சிக்கல்களைத் தீர்ப்பதற்கு இந்தத் திரிபை ஒரு சிறந்த கருவியாக ஆக்குகிறது. பின்னர், ER சவ்வு செரமைடில் நீண்ட (C18-C16) சங்கிலி மட்டுமே இருக்கும் sec31-1 இன் வெப்பநிலை-உணர்திறன் கொண்ட பிறழ்வு அல்லீலைக் கொண்ட GhLag1 இல், C26 Gas1-GFP கொத்துக்களாகக் குவியும் திறனை நாங்கள் முதலில் வழக்கமான ஒளிரும் நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்தோம் (படம் 3). sec31-1 இல், Gas1-GFP இன் பெரும்பகுதி கொத்துக்களாகக் குவிந்திருப்பதையும், அதே சமயம் நீண்ட (C18-C16) செரமைடு ER சவ்வைக் கொண்ட sec31-1 GhLag1 இல் Gas1-GFP முக்கியமாகக் கொத்துக்களாக இல்லாமல், முழு ER சவ்விலும் பரவியிருப்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். துல்லியமாகச் சொல்வதானால், C26 செரமைடு அடிப்படையிலான கொத்து உருவாக்கம் குறிப்பிட்ட ERES உடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது என்பதால் (படம் 1), இந்த செயல்முறையானது ER ஏற்றுமதி புரத பொறிமுறையின் செயல்பாட்டையும் உள்ளடக்கியதா என்பதை நாங்கள் அடுத்து ஆராய்ந்தோம். GPI-AP, ER ஏற்றுமதிக்காக ஒரு சிறப்பு COPII அமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது, இது GPI நங்கூரத்தின் கிளைக்கான் பகுதியின் Ted1 இன் கட்டமைப்பு மறுவடிவமைப்பால் தீவிரமாக ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது (30, 31). மறுசேர்க்கை GPI-கிளைக்கான் பின்னர் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் கார்கோ ரிசெப்டர் p24 காம்ப்ளக்ஸால் அங்கீகரிக்கப்படுகிறது, இது முக்கிய COPII கார்கோ பிணைப்பு துணை அலகு Sec24 இன் ஒரு குறிப்பிட்ட ஐசோஃபார்மான Lst1 ஐ தேர்ந்தெடுத்து ஆட்சேர்ப்பு செய்கிறது, இதனால் GPI-AP நிறைந்த COPII வெசிகல்கள் உருவாகின்றன (31-33). எனவே, இந்த ஒற்றை புரதங்களின் (p24 காம்ப்ளக்ஸ் கூறு Emp24, GPI-கிளைக்கான் மறுவடிவமைப்பு நொதி Ted1 மற்றும் குறிப்பிட்ட COPII துணை அலகு Lst1) நீக்கத்தை sec31-1 மரபணு மாற்றப்பட்ட திரிபுடன் இணைத்து ஒரு இரட்டை மரபணு மாற்றியை நாங்கள் உருவாக்கினோம், மேலும் Gas1-கிளஸ்டர் GFP ஐ உருவாக்க முடியுமா என்று ஆய்வு செய்தோம் (படம் 3). sec31-1emp24Δ மற்றும் sec31-1ted1Δ ஆகியவற்றில், Gas1-GFP ஆனது, முன்பு sec31-1 GhLag1-இல் காணப்பட்டதைப் போலவே, முக்கியமாகக் கொத்தாக அமையாமல் ER சவ்வு முழுவதும் பரவியிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்; அதேசமயம் sec31-1lst1Δ-இல், Gas1-GFP ஆனது sec31-1-ஐப் போலவே இருந்தது. இந்த முடிவுகள், ER சவ்வில் C26 செரமைடு இருப்பதுடன், Gas1-GFP கொத்தாக அமைவதற்கு p24 கூட்டுடன் பிணைவதும் அவசியமாகிறது என்பதையும், இதற்கு குறிப்பிட்ட Lst1 சேர்க்கை தேவையில்லை என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன. பின்னர், ER சவ்வில் உள்ள செரமைடின் சங்கிலி நீளம், Gas1-GFP ஆனது p24 உடன் பிணைவதை ஒழுங்குபடுத்த முடியுமா என்ற சாத்தியக்கூற்றை ஆராய்ந்தோம். இருப்பினும், சவ்வில் C18-C16 செரமைடு இருப்பது, p24 கூட்டினால் மறுகட்டமைக்கப்பட்ட GPI-கிளைக்கான்களையோ (படங்கள் S3 மற்றும் S4, A மற்றும் B) அல்லது GPI-AP உடன் பிணைவதையும் மற்றும் GPI-AP-ஐ வெளியேற்றும் திறனையோ பாதிக்கவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம். COPII துணைவகை Lst1-ஐ ஆட்சேர்ப்பு செய்கிறது (படம் S4C). எனவே, C26 செரமைடு-சார்ந்த கொத்து உருவாக்கம், வெவ்வேறு ER ஏற்றுமதி புரத வழிமுறைகளுடனான புரத இடைவினைகளைக் கோருவதில்லை, ஆனால் லிப்பிட் நீளத்தால் இயக்கப்படும் ஒரு மாற்று வரிசைப்படுத்தும் வழிமுறையை ஆதரிக்கிறது. பின்னர், Gas1-GFP-ஐ ஒரு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES ஆக திறம்பட வகைப்படுத்துவதற்கு, ER சவ்வில் உள்ள செரமைடு அசைல் சங்கிலியின் நீளம் முக்கியமா என்பதை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். குறுகிய சங்கிலி செரமைடு கொண்ட GhLag1 திரிபில் உள்ள Gas1, ER-ஐ விட்டு வெளியேறி பிளாஸ்மா சவ்வுக்குள் நுழைவதால் (படம் S5), இந்த வரிசைப்படுத்துதல் செரமைடு அசைல் சங்கிலியின் நீளத்தால் இயக்கப்படுகிறது என்றால், GhLag1 திரிபில் உள்ள Gas1 திசை திருப்பப்பட்டு, அதே சவ்வுடன் ERES பொருட்கள் கலக்கப்படலாம் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.
(அ) ​​GhLag1-இன் செல் சவ்வு முக்கியமாக குட்டையான C18-C16 செரமைடுகளைக் கொண்டுள்ளது, அதேசமயம் Gas1-GFP-இன் GPI ஆங்கர், இயல்புவகை செல்களைப் போலவே அதே C26 IPC-ஐக் கொண்டுள்ளது. மேலே: நிறை நிறமாலையியல் (MS) மூலம் இயல்புவகை (Wt) மற்றும் GhLag1p திரிபுகளின் செல் சவ்வில் உள்ள செரமைடின் அசைல் சங்கிலி நீளப் பகுப்பாய்வு. இந்தத் தரவு மொத்த செரமைடின் சதவீதத்தைக் குறிக்கிறது. மூன்று தனிப்பட்ட சோதனைகளின் சராசரி. பிழைப் பட்டை = திட்ட விலக்கம் (SD). இருமுனை இணைக்கப்படாத t சோதனை. **** P ＜0.0001. கீழ்ப்பகுதி: இயல்புவகை மற்றும் GhLag1p திரிபுகளில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ஆங்கரில் உள்ள IPC-இன் அசைல் சங்கிலி நீளத்தின் MS பகுப்பாய்வு. இந்தத் தரவு மொத்த IPC சிக்னலின் சதவீதத்தைக் குறிக்கிறது. ஐந்து தனிப்பட்ட சோதனைகளின் சராசரி. பிழைப் பட்டை = திட்ட விலக்கம் (SD). இருமுனை இணைக்கப்படாத t சோதனை. ns, முக்கியமற்றது. P = 0.9134. (B) கேலக்டோஸ்-தூண்டப்பட்ட Gas1-GFP-ஐ வெளிப்படுத்தும் sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ மற்றும் sec31-1lst1Δ செல்களின் ஒளிர்தல் நுண்ணோக்கிப் படங்கள் 37°C-ல் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, 24°C-க்குப் பிறகு வழக்கமான ஒளிர்தல் நுண்ணோக்கிப் பரிசோதனைக்காகக் கடத்தப்பட்டன. வெள்ளை அம்பு: ER Gas1-GFP கொத்து. திறந்த அம்பு: கொத்தாக இல்லாத Gas1-GFP முழு ER சவ்வு முழுவதும் பரவியுள்ளது, இது ER-இன் சிறப்பியல்புடைய உட்கரு வளையக் கறை படிதலைக் காட்டுகிறது. அளவுப் பட்டை, 5μm. (C) (B)-இல் விவரிக்கப்பட்ட ஒளிநுண்ணோக்கிப் படத்தின் அளவு நிர்ணயம். புள்ளி போன்ற Gas1-GFP அமைப்பைக் கொண்ட செல்களின் சராசரி சதவீதம். மூன்று தனித்தனி சோதனைகளில், n≥300 செல்கள். பிழைப் பட்டை = திட்ட விலகல். இருமுனை இணைக்கப்படாத t சோதனை. **** P ＜0.0001.
இந்தப் பிரச்சனையை நேரடியாகத் தீர்க்க, sec31-1 வெப்பநிலை-உணர்திறன் கொண்ட சடுதிமாற்ற அல்லீலுடன் கூடிய GhLag1-இல் Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP ஆகியவற்றின் SCLIM காட்சிப்படுத்தலை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 4 மற்றும் காணொளி S4). ER 37°C-இல் தக்கவைக்கப்பட்டு, பின்னர் 24°C-இல் வெளியிடப்பட்ட பிறகு, வழக்கமான நுண்ணோக்கிகளால் காணப்பட்டதைப் போல, புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட Gas1-GFP-இல் பெரும்பாலானவை ER சவ்வு முழுவதும் கொத்தாக அமைந்து பரவவில்லை (படம் 4, A மற்றும் B). மேலும், ERES-இன் ஒரு பெரிய சதவீதம் (67%) இரண்டு வகையான சரக்குகளை ஒரே இடத்தில் கொண்டுள்ளது (படம் 4D). படம் 4C-இன் பேனல்கள் 1 மற்றும் 2, ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் Gas1-GFP மற்றும் Mid2-GFP கொண்ட ERES-இன் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளைக் காட்டுகின்றன. மேலும், இரண்டு சரக்குகளும் ஒரே ERES-க்குள் சேர்க்கப்பட்டன (படம் 4E, பேனல் 3 மற்றும் காணொளி S4). எனவே, ER சவ்வில் உள்ள செரமைடு அசைல் சங்கிலியின் நீளம், ER புரதத் திரட்சி மற்றும் வகைப்பாட்டிற்கு ஒரு முக்கியமான நிர்ணயிக்கும் காரணியாகும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
கேலக்டோஸ்-தூண்டப்பட்ட சுரப்புகளான Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (TMP, நீலம்) ஆகியவற்றையும், மற்றும் நிலையான ERES-குறியிடப்பட்ட Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) ஆகியவற்றையும் வெளிப்படுத்தும் Sec31-1 GhLag1 செல்கள் 37°C-ல் அடைகாக்கப்படுகின்றன. 30 நிமிடங்களுக்குத் தொடரவும், சுரப்புகளை வெளியிட 24°C-க்கு வெப்பநிலையைக் குறைக்கவும், மற்றும் 20 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு SCLIM மூலம் படமெடுக்கவும். (A முதல் C வரை) சரக்கு மற்றும் ERES-ஆல் குறிக்கப்பட்ட 10 z-பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ 2D திட்டப் படங்கள் (A; அளவுகோல் பட்டை, 1μm) அல்லது 3D செல் அரைக்கோளப் படங்கள் (B மற்றும் C; அளவு அலகு, 0.45μm). (B)-ல் உள்ள கீழ்ப்பகுதி மற்றும் (C)-ல் உள்ள பகுதி ஆகியவை ERES-ல் (மெஜந்தா) உள்ள சரக்குகளை [Gas1-GFP (சாம்பல்) மற்றும் Mid2-iRFP (வெளிர் நீலம்)] மட்டும் காண்பிக்கும் வகையில் செயலாக்கப்பட்ட படங்களைக் காட்டுகின்றன. (C) வெள்ளை நிரப்பப்பட்ட அம்பு: ERES, சரக்குகள் ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்துகின்றன. திறந்த அம்பு: ERES ஒரே ஒரு பொருளை மட்டுமே கொண்டுள்ளது. கீழ்ப்பகுதி: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES, (C)-இல் குறிக்கப்பட்ட ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் பொருட்களை (1 மற்றும் 2) கொண்டுள்ளது. அளவுப் பட்டை, 100 nm. (D) (C)-இல் விவரிக்கப்பட்ட ஒளிநுண்படத்தின் அளவு நிர்ணயம். sec31-1 மற்றும் sec31-1 GhLag1 அலகுகளில், ஒரே ஒரு சரக்கு (Gas1-GFP அல்லது Mid2-iRFP) மட்டுமே சேர்க்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் தனித்த சரக்கு மற்றும் ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் சரக்குக்கான ERES-இன் சராசரி சதவீதம். மூன்று தனித்தனி சோதனைகளில், 54 செல்களில் n = 432 (sec31-1) மற்றும் 47 செல்களில் n = 430 (sec31-1 GhLag1). பிழைப் பட்டை = SD. இருமுனை இணைக்கப்படாத t சோதனை. *** P = 0.0002 (sec31-1) மற்றும் ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)-இல் குறிக்கப்பட்ட ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் சரக்குடன் (3) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES-இன் 3D படம். Gas1-GFP (பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (நீலம்) ஆகியவை ERES-ஐ (ஊதா) ஒரே பக்கத்திலிருந்து அணுகி, அதே ERES கட்டுப்படுத்தப்பட்ட பகுதியில் நிலைத்திருக்கின்றன. அளவுப் பட்டை, 100 நானோமீட்டர்.
இந்த ஆய்வு, கொழுப்பு அடிப்படையிலான புரதச் சுமைகள் சுரப்புப் பாதையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஏற்றுமதித் தளங்களாக வகைப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதற்கு நேரடி உயிருள்ள சான்றுகளை வழங்குகிறது, மேலும் வகைப்படுத்தல் தேர்வுக்கு அசைல் சங்கிலி நீளத்தின் முக்கியத்துவத்தையும் வெளிப்படுத்துகிறது. SCLIM எனப்படும் சக்திவாய்ந்த மற்றும் அதிநவீன நுண்ணோக்கி நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, புதிதாகத் தொகுக்கப்பட்ட Gas1-GFP-ஐ (மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி (C26) செரமைடு கொழுப்புப் பகுதியைக் கொண்ட ஒரு முக்கிய பிளாஸ்மா சவ்வு GPI-AP) ஈஸ்டில் நாங்கள் நிரூபித்தோம். தனித்தனி ER-களில் தொகுக்கப்பட்ட பகுதிகள் குறிப்பிட்ட ERES-களுடன் தொடர்புடையவை, அதே நேரத்தில் சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதங்கள் ER சவ்வு முழுவதும் விநியோகிக்கப்படுகின்றன (படம் 1). கூடுதலாக, இந்த இரண்டு வகையான பொருட்களும் வெவ்வேறு ERES-களில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் நுழைகின்றன (படம் 2). சவ்வில் உள்ள செல்லுலார் செரமைடின் அசைல் சங்கிலி நீளம் C26-லிருந்து C18-C16 ஆகக் குறைக்கப்படுகிறது, Gas1-GFP தொகுப்பு தனித்தனி ER பகுதிக்குள் சிதைக்கப்படுகிறது, மேலும் Gas1-GFP அதே ERES வழியாக சவ்விடைப் புரதத்துடன் ER-ஐ விட்டு வெளியேற வழிமாற்றப்படுகிறது (படம் 3 மற்றும் படம் 4).
GPI-AP, ER-இலிருந்து வெளியேறுவதற்கு ஒரு சிறப்புப் புரத வழிமுறையைப் பயன்படுத்தினாலும், C26 செரமைடு-சார்ந்த பிரிவானது, ERES சிறப்புத்தன்மைக்கு வழிவகுக்கக்கூடிய வேறுபட்ட புரத இடைவினைகளைச் சார்ந்திருக்கவில்லை என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படங்கள் S4 மற்றும் S5). மாறாக, கொழுப்பு-சார்ந்த புரதக் கொத்து உருவாக்கம் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து மற்ற சுமைகளை விலக்குதல் ஆகியவற்றால் இயக்கப்படும் ஒரு மாற்று வகைப்படுத்தல் வழிமுறையை எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் ஆதரிக்கின்றன. ஒரு குறிப்பிட்ட ERES உடன் தொடர்புடைய Gas1-GFP பகுதி அல்லது கொத்தில், சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதமான Mid2-iRFP இல்லை என்பதை எங்கள் அவதானிப்புகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன. இது, C26 செரமைடு-சார்ந்த GPI-AP கொத்தானது, தொடர்புடைய ERES-க்குள் அவற்றின் நுழைவை எளிதாக்கும் என்பதையும், அதே நேரத்தில், சவ்விடைச் சுரப்புகள் இந்தக் குறிப்பிட்ட ERES-க்குள் நுழைவதைத் தடுக்கும் என்பதையும் குறிக்கிறது (படங்கள் 1 மற்றும் 2). இதற்கு மாறாக, ER சவ்வில் C18-C16 செரமைடுகள் இருப்பது, GPI-AP பகுதிகளையோ அல்லது கொத்துகளையோ உருவாக்கக் காரணமாக அமையவில்லை. எனவே, அவை சவ்விடைச் சுரப்புப் புரதங்களை அதே ERES-க்குள் விலக்குவதோ அல்லது மாற்றுவதோ இல்லை (படங்கள் 3 மற்றும் 4). எனவே, குறிப்பிட்ட ERES உடன் இணைக்கப்பட்ட புரதங்களின் கொத்துகளை எளிதாக்குவதன் மூலம், C26 செரமைடு பிரித்தலையும் வகைப்படுத்தலையும் இயக்குகிறது என்று நாங்கள் முன்மொழிகிறோம்.
ஒரு குறிப்பிட்ட ER பகுதியில் இந்த C26 செரமைடு-சார்ந்த கொத்துகளை எவ்வாறு அடைவது? சவ்வு செரமைடு பக்கவாட்டாகப் பிரியும் போக்கு, குறுகிய மற்றும் நிறைவுறாத கிளிசரோலிப்பிடுகளைக் கொண்ட ER சவ்வின் மிகவும் ஒழுங்கற்ற லிப்பிட் சூழலில், GPI-AP மற்றும் C26 செரமைடு ஆகியவை சிறிய மற்றும் உடனடியாக ஒழுங்கமைக்கப்பட்ட லிப்பிட்களை உருவாக்க காரணமாக இருக்கலாம். தரமான கொத்துகள் (17, 18). இந்த சிறிய தற்காலிக கொத்துகள் p24 காம்ப்ளக்ஸுடன் பிணைந்த பிறகு மேலும் ஒன்றிணைந்து பெரிய, அதிக நிலையான கொத்துகளாக மாறக்கூடும் (34). இதற்கு இணங்க, பெரிய, கண்ணுக்குத் தெரியும் கொத்துகளை உருவாக்க C26 Gas1-GFP ஆனது p24 காம்ப்ளக்ஸுடன் தொடர்பு கொள்ள வேண்டும் என்பதை நாங்கள் காட்டினோம் (படம் 3). p24 காம்ப்ளக்ஸ் என்பது ஈஸ்டில் நான்கு வெவ்வேறு p24 டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதங்களால் ஆன ஒரு ஹெட்டிரோசைகஸ் ஒலிகோமர் ஆகும் (35), இது பலவகை பிணைப்பை வழங்குகிறது, இது சிறிய GPI-AP கொத்துகளின் குறுக்கு இணைப்பிற்கு வழிவகுக்கும், இதன் மூலம் பெரிய நிலையான கொத்துகளை உருவாக்குகிறது (34). பாலூட்டி துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களில் (36) அவற்றின் கோல்ஜி போக்குவரத்தின் போது காட்டப்பட்டுள்ளபடி, GPI-APகளின் புரத எக்டோடோமைன்களுக்கு இடையிலான தொடர்பு அவற்றின் திரட்சிக்கு பங்களிக்கக்கூடும். இருப்பினும், ER சவ்வில் C18-C16 செரமைடு இருக்கும்போது, ​​p24 காம்ப்ளக்ஸ் Gas1-GFP உடன் பிணைக்கும்போது, ​​பெரிய தனித்தனி கொத்துகள் உருவாகாது. அடிப்படை பொறிமுறையானது நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடின் குறிப்பிட்ட இயற்பியல் மற்றும் வேதியியல் பண்புகளைச் சார்ந்து இருக்கலாம். செயற்கை சவ்வுகளின் உயிர் இயற்பியல் ஆய்வுகள், நீண்ட (C24) மற்றும் குறுகிய (C18-C16) அசைல் சங்கிலி செரமைடுகள் இரண்டும் கட்டப் பிரிவை ஏற்படுத்தினாலும், நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடுகள் (C24) மட்டுமே அதிக வளைவு மற்றும் படலத்தை வளைத்து படலத்தை மறுவடிவமைக்க ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. பரஸ்பர குறிப்பு மூலம் (17, 37, 38). Emp24-இன் மனித ஹோமோலாக் ஆன TMED2-இன் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸ், சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபியூல்களில் உள்ள C18 செரமைடு அடிப்படையிலான ஸ்பிங்கோமைலினுடன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் தொடர்பு கொள்கிறது என்பது காட்டப்பட்டுள்ளது (39). மூலக்கூறு இயக்கவியல் (MD) உருவகப்படுத்துதல்களைப் பயன்படுத்தி, C18 மற்றும் C26 செரமைடுகள் இரண்டும் Emp24 டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபியூல்களைச் சுற்றி குவிகின்றன என்பதையும், அவை ஒத்த விருப்பங்களைக் கொண்டுள்ளன என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் S6). இது, Emp24-இன் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸ் சவ்வில் லிப்பிட்களின் சமச்சீரற்ற விநியோகத்திற்கு வழிவகுக்கும் என்பதைக் குறிக்கிறது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இது பாலூட்டி செல்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு சமீபத்திய முடிவாகும். இதேபோன்ற MD உருவகப்படுத்துதல்கள் ஈதர் லிப்பிட்களின் இருப்பையும் காட்டுகின்றன (40). எனவே, ER26-இன் இரண்டு லோபியூல்களில் உள்ள C26 செரமைடு உள்ளூரில் செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம். லுமினல் லோபியூல்களில் உள்ள GPI-AP, மல்டிவேலன்ட் p24 உடன் நேரடியாகப் பிணைந்து, சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபியூல்களில் p24-ஐச் சுற்றி C26 செரமைடு குவிவதால், அது விரல்கள் (41) மூலம் உருவாக்கப்படும் புரதத் திரட்சி மற்றும் சவ்வு வளைவை ஊக்குவிக்கும், இதனால் GPI-AP ஆனது ERES-க்கு அருகிலுள்ள தனித்தனி பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்படுகிறது, இது ER சவ்வின் அதிக வளைந்த பகுதிகளுக்கும் சாதகமாக அமைகிறது (42). முந்தைய அறிக்கைகள் முன்மொழியப்பட்ட வழிமுறையை ஆதரித்தன (43, 44). பிளாஸ்மா சவ்வில் உள்ள செரமைடு அடிப்படையிலான கிளைகோஸ்பிங்கோலிபிட்களுடன் (GSL) ஒலிகோலெக்டின்கள், நோய்க்கிருமிகள் அல்லது ஆன்டிபாடிகளின் மல்டிவேலன்ட் பிணைப்பு பெரிய GSL திரட்சியைத் தூண்டுகிறது, கட்டப் பிரிப்பை மேம்படுத்துகிறது மற்றும் சவ்வு சிதைவு மற்றும் உள்ளிழுத்தலை ஏற்படுத்துகிறது (44). இவாபுச்சி முதலியன (43) நீண்ட (C24) ஆனால் குறுகிய (C16) அசைல் சங்கிலிகள் இல்லாத நிலையில், GSL லாக்டோசில்செரமைடுடன் பிணைக்கப்பட்ட பலவலுவுள்ள லிகண்ட் பெரிய கொத்துகள் மற்றும் சவ்வு உள்வளைவின் உருவாக்கத்தைத் தூண்டியது, மேலும் இணைக்கப்பட்ட நியூட்ரோபில்களில் உள்ள இலைகளில் சைட்டோபிளாசம் லின்-மத்தியஸ்த சமிக்ஞை பரிமாற்றம் அசைல் சங்கிலிகளால் ஒன்றோடொன்று பிணைக்கப்பட்டுள்ளது என்று கண்டறியப்பட்டது.
பாலூட்டிகளின் முனைப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களில், நுனி பிளாஸ்மா சவ்வு மட்டத்தில் ஆன்டி-கோல்ஜி நெட்வொர்க்கின் (TGN) செறிவு GPI-AP இன் பிரிப்பு மற்றும் வரிசைப்படுத்தலைக் கட்டுப்படுத்துகிறது (10, 45). இந்தத் திரட்சி GPI-AP ஒலிகோமரைசேஷனால் இயக்கப்படுகிறது (36), ஆனால் இது ஈஸ்டில் நாம் காணும் செரமைடு சங்கிலியின் நீளத்தையும் சார்ந்திருக்கலாம். பாலூட்டிகளின் GPI-AP ஒரு ஈதர் லிப்பிட் அடிப்படையிலான நங்கூரத்தைக் கொண்டிருந்தாலும், அதன் வேதியியல் அமைப்பு மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடிலிருந்து மிகவும் வேறுபட்டிருந்தாலும், சமீபத்திய ஆய்வில் இரண்டு லிப்பிட்களும் பரிணாம ரீதியாக ஒத்த இயற்பியல் மற்றும் வேதியியல் பண்புகளையும் செயல்பாட்டையும் கொண்டிருப்பதாகக் கண்டறியப்பட்டுள்ளது (40). எனவே, பாலூட்டி செல்களில் உள்ள ஈதர் லிப்பிட் பகுதி ஈஸ்டில் உள்ள C26 செரமைடைப் போலவே இருக்கலாம், மேலும் அதன் பங்கு சவ்வில் உள்ள நீண்ட சங்கிலி செரமைடுடன் இணைந்து GPI-AP திரட்சி மற்றும் வரிசைப்படுத்தலை ஊக்குவிப்பதாகும். இந்த சாத்தியக்கூறு இன்னும் நேரடியாக சோதிக்கப்பட வேண்டியிருந்தாலும், நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடை கோல்கி உடலுக்குக் கொண்டு செல்வது சைட்டோபிளாஸ்மிக் பரிமாற்ற புரதங்களால் மேற்கொள்ளப்படுவதில்லை, மாறாக ஈஸ்ட்டைப் போலவே GPI நங்கூரங்களின் தொகுப்பைச் சார்ந்துள்ளது என்பதை முந்தைய கண்டுபிடிப்புகள் ஆதரிக்கின்றன. எனவே, பரிணாம ரீதியாகப் பாதுகாக்கப்பட்ட வழிமுறையானது, மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செரமைடு மற்றும் GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ஆகியவற்றை ஒரே போக்குவரத்து வெசிகளில் தேர்ந்தெடுத்து இணைந்து கொண்டு செல்ல முடியும் என்று தெரிகிறது.
ஈஸ்ட் மற்றும் பாலூட்டி துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல் அமைப்புகளில், GPI-AP திரட்சி மற்றும் பிற பிளாஸ்மா சவ்வு புரதங்களிலிருந்து பிரிதல் அனைத்தும் செல் மேற்பரப்பை அடைவதற்கு முன்பே நிகழ்கின்றன. பாலடினோ மற்றும் பலர் (48) பாலூட்டி துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் TGN இல், GPI-AP கொத்துதல் என்பது GPI-AP களை நுனி பிளாஸ்மா சவ்வுக்குத் தேர்ந்தெடுத்து வகைப்படுத்துவதற்கு அவசியமானது மட்டுமல்லாமல், GPI-AP களின் கொத்து அமைப்பையும் அதன் உயிரியல் செயல்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதைக் கண்டறிந்தனர். செல் மேற்பரப்பு. ஈஸ்டில், இந்த ஆய்வு ER இல் உள்ள C26 செரமைடு-சார்ந்த GPI-AP கொத்து, பிளாஸ்மா சவ்வில் உள்ள GPI-AP இன் கொத்து அமைப்பையும் செயல்பாட்டு நடவடிக்கையையும் ஒழுங்குபடுத்த முடியும் என்பதைக் காட்டியது (24, 49). இந்த மாதிரியுடன் ஒத்துப்போகும் வகையில், GhLag1 செல்கள் GPI தடுப்பான்கள் அல்லது செல் சுவர் ஒருமைப்பாட்டை பாதிக்கும் மருந்துகளுக்கு ஒவ்வாமை கொண்டவை (28), மேலும் ஈஸ்ட் செல்களின் இனச்சேர்க்கையில் திட்டமிடப்பட்ட முனை செரமைடின் செயல்பாட்டு Gas1-GFP கொத்துகளின் (49) தேவை, hLag1 செல்களின் GPI-AP பிழையைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், செல் மேற்பரப்பின் செயல்பாட்டு அமைப்பு, லிப்பிட் நீளத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு வரிசைப்படுத்தும் முறையால் ER-இலிருந்து திட்டமிடப்பட்டுள்ளதா என்பதை மேலும் சோதிப்பது எங்கள் எதிர்கால ஆராய்ச்சியின் பொருளாக இருக்கும்.
இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட சாக்ரோமைசஸ் செரிவிசியே விகாரங்கள் அட்டவணை S1 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. உயிருள்ள செல் படமாக்கலுக்கான SCLIM இன் MMY1583 மற்றும் MMY1635 விகாரங்கள் W303 இன் பின்னணியில் உருவாக்கப்பட்டன. ஒளிரும் புரதக் குறியீட்டுடன் Sec13-mCherry ஐ வெளிப்படுத்தும் இந்த விகாரங்கள், pFA6a பிளாஸ்மிடை ஒரு வார்ப்புருவாகக் கொண்டு பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (PCR) அடிப்படையிலான முறையைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன (23). GAL1 ஊக்குவிப்பானின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் ஒளிரும் புரதத்துடன் குறியிடப்பட்ட Mid2-iRFP ஐ வெளிப்படுத்தும் விகாரம் பின்வருமாறு உருவாக்கப்பட்டது. pKTiRFP-KAN திசையனிலிருந்து (E. O'Shea வழங்கியது, Addgene பிளாஸ்மிட் எண் 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ஆராய்ச்சி வள அடையாளங்காட்டி (RRID): Addgene_64687) iRFP-KanMx வரிசையின் PCR பெருக்கம் செய்யப்பட்டு, உள்ளார்ந்த Mid2 இன் C-முனையில் செருகப்பட்டது. Mid2-iRFP மரபணுத்தொகுதி வரிசை பெருக்கப்பட்டு GAL1 ஊக்குவிப்பானில் படியெடுக்கப்பட்ட பிறகு, அது pRS306 என்ற ஒருங்கிணைப்பு பிளாஸ்மிட்டின் Not I-Sac I தளத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. இதன் விளைவாக உருவான pRGS7 பிளாஸ்மிட், URA3 மரபணு இருப்பிடத்தில் ஒருங்கிணைவதற்காக Pst I கொண்டு நேராக்கப்பட்டது.
Gas1-GFP இணைவு மரபணு, பின்வருமாறு கட்டமைக்கப்பட்ட சென்ட்ரோமியர் (CEN) பிளாஸ்மிட்டில் GAL1 ஊக்குவிப்பானின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. Gas1-GFP வரிசையானது pRS416-GAS1-GFP பிளாஸ்மிட்டிலிருந்து (24) (L. போபோலோவின் அன்பளிப்பு) PCR மூலம் பெருக்கப்பட்டு, CEN பிளாஸ்மிட் pBEVY-GL LEU2 (C. மில்லரின் அன்பளிப்பு; Addgene பிளாஸ்மிட் எண் 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225) இன் Xma I–Xho I தளத்தில் குளோன் செய்யப்பட்டது. இதன் விளைவாக உருவான பிளாஸ்மிட்டிற்கு pRGS6 எனப் பெயரிடப்பட்டது. Axl2-GFP இணைவு மரபணுவும் pBEVY-GL LEU2 வெக்டரின் GAL1 ஊக்குவிப்பானின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் அதன் கட்டமைப்பு பின்வருமாறு. pRS304-p2HSE-Axl2-GFP பிளாஸ்மிட்டிலிருந்து (23) Axl2-GFP வரிசை PCR மூலம் பெருக்கப்பட்டு, pBEVY-GL LEU2 திசையனின் Bam HI-Pst I தளத்தில் படியெடுக்கப்பட்டது. இதன் விளைவாக உருவான பிளாஸ்மிட்டிற்கு pRGS12 எனப் பெயரிடப்பட்டது. இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளின் வரிசை அட்டவணை S2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளது.
அந்த நுண்ணுயிரி விகாரமானது, ஊட்டச்சத்துக்காகத் தேவைப்படும் பொருத்தமான அமினோ அமிலங்களையும் காரங்களையும் சேர்ப்பதற்காக, 0.2% அடினைன் மற்றும் 2% குளுக்கோஸ் [YP-டெக்ஸ்ட்ரோஸ் (YPD)], 2% ராஃபினோஸ் [YP-ராஃபினோஸ்] செறிந்த ஈஸ்ட் சாறு புரதம் p (YP) ஊடகம் (1% ஈஸ்ட் சாறு மற்றும் 2% புரதம் ept. (YPR)] அல்லது 2% கேலக்டோஸ் [YP-கேலக்டோஸ் (YPG)] ஆகியவற்றைக் கொண்டோ, அல்லது ஒரு செயற்கை குறைந்தபட்ச ஊடகத்திலோ (0.15% ஈஸ்ட் நைட்ரஜன் காரம் மற்றும் 0.5% அம்மோனியம் சல்பேட்) செறிவூட்டப்பட்டது. மேலும், இது ஒரு கார்பன் மூலமாக 2% குளுக்கோஸ் (செயற்கை குளுக்கோஸ் குறைந்தபட்ச ஊடகம்) அல்லது 2% கேலக்டோஸ் (செயற்கை கேலக்டோஸ் குறைந்தபட்ச ஊடகம்) கொண்டிருந்தது.
நிகழ்நேரப் படமெடுப்பிற்காக, GAL1 ஊக்குவிப்பானின் கீழ் கட்டமைப்பை வெளிப்படுத்தும் வெப்பநிலை உணர்திறன் கொண்ட sec31-1 சடுதிமாற்ற செல்கள், YPR ஊடகத்தில் 24°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் இடை-லாக் கட்டம் வரை வளர்க்கப்பட்டன. YPG ஊடகத்தில் 24°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் தூண்டப்பட்ட பிறகு, அந்த செல்கள் SG ஊடகத்தில் 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் சுரப்புத் தடையிலிருந்து விடுவிப்பதற்காக 24°C வெப்பநிலைக்கு மாற்றப்பட்டன. கான்கனாவலின் A கொண்டு செல்கள் ஒரு கண்ணாடித் தட்டில் நிலைநிறுத்தப்பட்டு, SCLIM மூலம் படமெடுக்கப்பட்டன. SCLIM என்பது ஒலிம்பஸ் IX-71 தலைகீழ் ஃபுளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மற்றும் UPlanSApo 100×1.4 எண் துளை எண்ணெய் லென்ஸ் (ஒலிம்பஸ்), அதிவேக மற்றும் உயர்-சமிக்ஞை-இரைச்சல் விகிதம் கொண்ட சுழலும் வட்டு கான்ஃபோகல் ஸ்கேனர் (யோகோகாவா எலக்ட்ரிக்), தனிப்பயன் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் மற்றும் தனிப்பயன் குளிரூட்டல் ஆகியவற்றின் ஒரு கலவையாகும். இந்த அமைப்பின் படத் தீவிரப்படுத்தி (ஹமாமாட்சு ஃபோட்டோனிக்ஸ்), ×266.7 இறுதி உருப்பெருக்கத்துடன் கூடிய ஒரு உருப்பெருக்கி லென்ஸ் அமைப்பையும், எலக்ட்ரான்களைப் பெருக்கும் ஒரு சார்ஜ்-கப்பிள்டு டிவைஸ் கேமராவையும் (ஹமாமாட்சு ஃபோட்டோனிக்ஸ்) (21) வழங்க முடியும். படச் சேகரிப்பு தனிப்பயன் மென்பொருள் (யோகோகாவா எலக்ட்ரிக்) மூலம் செய்யப்படுகிறது. 3D படங்களுக்கு, நாங்கள் ஒரு தனிப்பயனாக உருவாக்கப்பட்ட பைசோஎலக்ட்ரிக் ஆக்சுவேட்டரைப் பயன்படுத்தி புறவில்லையை செங்குத்தாக அதிர்வுறச் செய்து, ஒளியியல் பாகங்களை 100 nm இடைவெளியில் ஒரு அடுக்கில் சேகரித்தோம். Z-ஸ்டாக் படம் 3D வோக்சல் தரவாக மாற்றப்படுகிறது, மேலும் சுழலும் வட்டு கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கிக்காகப் பயன்படுத்தப்படும் கோட்பாட்டுப் புள்ளிப் பரவல் சார்பு, வோலோசிட்டி மென்பொருளால் (பெர்கின்எல்மர்) டீகன்வல்யூஷன் செயலாக்கத்திற்காகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. வோலோசிட்டி மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி இணை இருப்பிடப் பகுப்பாய்விற்காகத் தானாகவே வரம்பு நிர்ணயம் செய்வதன் மூலம், சரக்கு உட்பட ERES அளவிடப்பட்டது. மெட்டாமார்ப் மென்பொருளைப் (மாலிகுலர் டிவைசஸ்) பயன்படுத்தி வரி ஸ்கேன் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
புள்ளிவிவர முக்கியத்துவத்தை நிர்ணயிக்க GraphPad Prism மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும். இருமுனை மாணவர் t-சோதனை மற்றும் சாதாரண ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (ANOVA) சோதனைக்கு, குழுக்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகள் P <0.05 (*) அளவில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துவதாகக் கருதப்படுகின்றன.
Gas1-GFP இன் ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி ஆய்விற்காக, லாக் ஃபேஸ் செல்கள் YPD இல் ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டு, மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டன. அவை பாஸ்பேட் பஃபர்டு சலைன் கொண்டு இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, குறைந்தது 15 நிமிடங்களுக்கு பனிக்கட்டியில் வைத்து அடைகாக்கப்பட்டன. பின்னர், முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி (24) நுண்ணோக்கியின் கீழ் ஆய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது. ஒரு புறவில்லை, L5 (GFP) வடிகட்டி, ஹமாமாட்சு கேமரா மற்றும் அப்ளிகேஷன் சூட் X (LAS X) மென்பொருள் ஆகியவற்றைக் கொண்ட லெய்கா DMi8 நுண்ணோக்கி (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) தரவு சேகரிப்பிற்காகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மாதிரிகள் 65°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு SDS மாதிரி இடையகத்தைக் கொண்டு இயல்புநீக்கம் செய்யப்பட்டு, பின்னர் SDS-பாலிஅக்ரிலமைடு ஜெல் மின்பகுப்பு (PAGE) மூலம் பிரிக்கப்பட்டன. இம்யூனோபிளாட்டிங் பகுப்பாய்விற்காக, ஒவ்வொரு வரிசைக்கும் 10 μl மாதிரி ஏற்றப்பட்டது. முதன்மை எதிர்ப்பொருள்: முயல் பாலிக்குளோனல் ஆன்டி-Gas1 1:3000 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்திலும், முயல் பாலிக்குளோனல் ஆன்டி-Emp24 1:500 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்திலும், மற்றும் முயல் பாலிக்குளோனல் ஆன்டி-GFP (H. Riezman வழங்கியது) 1:3000 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்திலும் பயன்படுத்தப்பட்டன. சுண்டெலி மோனோகுளோனல் ஆன்டி-Pgk1 எதிர்ப்பொருள் 1:5000 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டது (J. de la Cruz வழங்கியது). இரண்டாம் நிலை எதிர்ப்பொருள்: ஹார்ஸ்ராடிஷ் பெராக்ஸைடு (HRP) உடன் இணைக்கப்பட்ட வெள்ளாடு ஆன்டி-முயல் இம்யூனோகுளோபுலின் G (IgG) 1:3000 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டது (பியர்ஸ்). HRP-இணைக்கப்பட்ட வெள்ளாட்டு எலி எதிர்ப்பு IgG, 1:3000 என்ற நீர்த்தல் விகிதத்தில் (பியர்ஸ்) பயன்படுத்தப்பட்டது. சூப்பர்சிக்னல் வெஸ்ட் பிக்கோ வினைப்பொருளின் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) வேதி ஒளிர்தல் முறையின் மூலம் நோயெதிர்ப்புத் துலங்கல் மண்டலம் உற்றுநோக்கப்பட்டது.
(31)-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னத்தில் ஒரு இயற்கை இம்யூனோபிரெசிபிடேஷன் பரிசோதனை செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஈஸ்ட் செல்களை TNE பஃபர் [50 mM டிரிஸ்-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ஃபினைல்மெத்தில்சல்பொனைல் ஃபுளோரைடு மற்றும் புரோட்டியேஸ் தடுப்பான் கலவை] கொண்டு 600 nm (OD600) அலைநீளத்தில் 100 ஆப்டிகல் அடர்த்தியில் இரண்டு முறை கழுவவும். அது கண்ணாடி மணிகளால் உடைக்கப்பட்டது, பின்னர் செல் சிதைவுகள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகள் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. பின்னர், மேற்பகுதி திரவம் 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 17,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. வீழ்படிவு TNE-இல் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, டிஜிட்டலிஸ் சபோனின் 1% இறுதிச் செறிவுக்கு சேர்க்கப்பட்டது. அந்தக் கலவை 4°C வெப்பநிலையில் சுழற்சியுடன் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது, பின்னர் கரையாத கூறுகள் 4°C வெப்பநிலையில் 60 நிமிடங்களுக்கு 13,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. Gas1-GFP இம்யூனோபிரெசிபிடேஷனுக்காக, முதலில் மாதிரியை வெற்று அகரோஸ் மணிகளுடன் (ChromoTek) 4°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் முன்-அடைகாக்கவும், பின்னர் GFP-Trap_A (ChromoTek) உடன் 4°C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். இம்யூனோபிரெசிபிடேட் செய்யப்பட்ட மணிகள் 0.2% டிஜாக்சிஜெனின் கொண்ட TNE-ஆல் ஐந்து முறை கழுவப்பட்டு, SDS மாதிரி பஃபரால் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, SDS-PAGE-இல் பிரிக்கப்பட்டு, இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
(31) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னத்தில் குறுக்கு-இணைப்பு நிர்ணயம் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னம் 0.5 mM டைதியோபிஸ்(சக்சினிமிடில் புரோபியோனேட்) (பியர்ஸ், தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ராக்ஃபோர்ட், IL, USA; 20°C, 20 நிமிடம்) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. கிளைசின் (50 mM இறுதி செறிவு, 5 நிமிடங்கள், 20°C) சேர்ப்பதன் மூலம் குறுக்கு-இணைப்பு எதிர்வினை தணிக்கப்பட்டது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி (50), வைல்ட்-டைப் மற்றும் GhLag1 விகாரங்களில் செரமைடின் MS பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, செல்கள் 30°C வெப்பநிலையில் YPD-யில் அதிவேக வளர்ச்சி நிலைக்கு (3 முதல் 4 OD600 அலகுகள்/மிலி) வளர்க்கப்பட்டு, 25×107 செல்கள் அறுவடை செய்யப்பட்டன. அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றம் டிரைகுளோரோஅசிட்டிக் அமிலத்தால் தணிக்கப்படுகிறது. பிரித்தெடுக்கும் கரைப்பான் [எத்தனால், நீர், ஈதர், பைரிடின் மற்றும் 4.2 N அம்மோனியம் ஹைட்ராக்சைடு (15:15:5:1:0.018 v/v)] மற்றும் 1.2 nmol உள் தரநிலை C17 செரமைடு (860517, அவாந்தி போலார் லிப்பிட் தரம்) பயன்படுத்தவும். பிரித்தெடுக்கப்பட்டவற்றின் லேசான கார நீராற்பகுப்பைச் செய்ய மோனோமெதிலமைன் வினைப்பொருள் [மெத்தனால், நீர், n-பியூட்டனால் மற்றும் மெதிலமைன் கரைசல் (4:3:1:5 v/v)] பயன்படுத்தப்பட்டது, பின்னர் உப்பு நீக்கம் செய்ய நீர்-நிறைவுற்ற n-பியூட்டனால் பயன்படுத்தப்பட்டது. இறுதியாக, அந்தச் சாறு ஒரு நேர்மறை முறை கரைப்பானில் [குளோரோஃபார்ம்/மெத்தனால்/நீர் (2:7:1) + 5 mM அம்மோனியம் அசிடேட்] மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, நிறை நிறமாலைமானியில் உட்செலுத்தப்பட்டது. ஸ்பிங்கோலிப்பிட் மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காணவும் அளவிடவும் பல-வினை கண்காணிப்பு (MRM) மேற்கொள்ளப்பட்டது. TSQ வான்டேஜ் மூன்றாம் நிலை குவாட்ரூபோல் நிறை நிறமாலைமானி (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்), லிப்பிட் பகுப்பாய்விற்காக நானோமேட் HD (அட்வியான் பயோசயின்சஸ், இத்தாக்கா, NY) என்ற ஒரு ரோபோ நானோஃப்ளோ அயனி மூலத்துடன் பொருத்தப்பட்டுள்ளது. ஒவ்வொரு செரமைடு வகைக்கும் மோதல் ஆற்றல் உகந்ததாக்கப்பட்டது. MS தரவு நேர்மறை முறையில் பெறப்பட்டது. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதிக்கும், லிப்பிட் சமிக்ஞை என்பது மூன்று தனிப்பட்ட அளவீடுகளின் இடைநிலை ஆகும்.
(31) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, Gas1-GFP ஐ வெளிப்படுத்தும் செல்கள் (800×107) இயற்கையான இம்யூனோபிரெசிபிடேஷனுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. சுத்திகரிக்கப்பட்ட Gas1-GFP, SDS-PAGE மூலம் பிரிக்கப்பட்டு, ஒரு பாலிவினைலிடீன் ஃபுளோரைடு (PVDF) சவ்வுக்கு மாற்றப்பட்டது. அமைடு பிளாக் கொண்டு PVDF க்கு சாயம் பூசுவதன் மூலம் புரதம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டது. Gas1-GFP பட்டை PVDF இலிருந்து வெட்டப்பட்டு, மெத்தனால் கொண்டு 5 முறையும், திரவ குரோமடோகிராபி-MS (LC-MS) தர நீர் கொண்டு ஒரு முறையும் கழுவப்பட்டது. சவ்வுப் பட்டையை 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), இடையகக் கரைசல் மற்றும் 500μl புதிதாகக் கரைக்கப்பட்ட 1 M சோடியம் நைட்ரைட் கலவையுடன் 37°C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாப்பதன் மூலம், Gas1-GFP இலிருந்து லிப்பிட் பகுதி வெளியிடப்பட்டு சிதைக்கப்படுகிறது. குளுக்கோசமைன் மற்றும் இனோசிடால் இடையே இனோசின் பாஸ்பேட் செரமைடு வெளியீடு (51). அதன்பிறகு, சவ்வுப் பட்டை LC-MS தர நீரால் நான்கு முறை கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் உலர்த்தப்பட்டு, பகுப்பாய்வு செய்யப்படும் வரை -80°C இல் நைட்ரஜன் சூழலில் சேமிக்கப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, ஒவ்வொரு சோதனைக்கும் PVDF சவ்வின் ஒரு வெற்று மாதிரி பயன்படுத்தப்பட்டது. Gas1-GFP இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட லிப்பிட் பின்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி (50) MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, GPI-லிப்பிட்டைக் கொண்ட PVDF பட்டைகள் 75μl எதிர்மறை அச்சு கரைப்பானில் [குளோரோஃபார்ம்/மெத்தனால் (1:2) + 5 mM அம்மோனியம் அசிடேட்] மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, ஸ்பிங்கோலிப்பிட் இனங்களின் எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் (ESI)-MRM/MS பகுப்பாய்வுக்கு (TSQ Vantage) உட்படுத்தப்பட்டன. இந்த நிலையில், MS தரவு எதிர்மறை அயனி பயன்முறையில் பெறப்பட்டது.
முன்னர் குறிப்பிட்டபடி, GPI ஆங்கரின் லிப்பிட் பகுதி [3H]-இனோசிட்டால்-லேபிளிடப்பட்ட GPI-AP (16) இலிருந்து பிரிக்கப்பட்டது. லிப்பிட்கள் ஒரு கரைப்பான் அமைப்பைப் (55:45:10 குளோரோஃபார்ம்-மெத்தனால்-0.25% KCl) பயன்படுத்தி மெல்லிய-அடுக்கு குரோமடோகிராஃபி மூலம் பிரிக்கப்பட்டு FLA-7000 (ஃபுஜிஃபில்ம்) பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
Gas1-GFP-ஐ வெளிப்படுத்தும் செல்கள் (600×10⁷) TNE பஃபரால் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, கண்ணாடி மணிகளால் உடைக்கப்பட்டன. பின்னர், செல் சிதைவுகள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகளை அகற்ற மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. அதன் பிறகு, மேற்பகுதி திரவம் 4°C வெப்பநிலையில் 17,000 g வேகத்தில் 1 மணி நேரத்திற்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. வீழ்படிவு TNE-இல் கழுவப்பட்டு, 0.2% டிஜிட்டலிஸ் சபோனின் கொண்ட TNE-இல் உள்ள 1 U PI-PLC (இன்விட்ரோஜென்) உடன் 37°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டது. நொதி சிகிச்சைக்குப் பிறகு, சவ்வு 4°C வெப்பநிலையில் 17,000 g வேகத்தில் 1 மணி நேரத்திற்கு மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் அகற்றப்பட்டது. Gas1-GFP-ஐ இம்யூனோபிரெசிபிடேட் செய்ய, மேற்பகுதி திரவம் 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் GFP-Trap_A (குரோமோடெக்) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. SDS-PAGE மூலம் பிரிக்கப்பட்ட சுத்திகரிக்கப்பட்ட Gas1-GFP, கூமாசி பிரில்லியன்ட் ப்ளூ கொண்டு சாயமிடப்பட்டது. நீர்வழியைச் சுற்றியுள்ள சாம்பல் நிறப் பகுதியிலிருந்து Gas1-GFP கறை படிந்த பட்டை வெட்டி எடுக்கப்பட்டது. பின்னர், அயோடோஅசிட்டமைடுடன் ஆல்கைலேற்றம் மற்றும் டைதியோத்ரெயிட்டாலுடன் ஒடுக்கம் செய்த பிறகு, டிரிப்சின் கொண்டு ஜெல்-உள்ளே செரிமானம் செய்யப்பட்டது. டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் மற்றும் GPI-கிளைக்கான்களைக் கொண்ட பெப்டைடுகளைப் பிரித்தெடுத்து உலர்த்தவும். உலர்த்தப்பட்ட பெப்டைடு 20 μl நீரில் கரைக்கப்பட்டது. அதன் ஒரு பகுதியை (8μl) LC-க்குள் செலுத்தவும். குறிப்பிட்ட சாய்வு நிலைமைகளின் கீழ் பெப்டைடுகளைப் பிரிக்க, ஒரு ஆக்டாடெசில்சிலேன் (ODS) நிரல் (டெவலோசில் 300ODS-HG-5; உள் விட்டம் 150 மிமீ × 1.0 மிமீ; நோமுரா கெமிக்கல், ஐச்சி மாகாணம், ஜப்பான்) பயன்படுத்தப்பட்டது. நகரும் கட்டமானது கரைப்பான் A (0.08% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் கரைப்பான் B (80% அசிட்டோநைட்ரைலில் 0.15% ஃபார்மிக் அமிலம்) ஆகும். ஒரு அக்செலா HPLC அமைப்பைப் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பாஸ்டன், மாசசூசெட்ஸ்) பயன்படுத்தி, 55 நிமிடங்களுக்குள் கரைப்பான் A கொண்டு நிரலிலிருந்து திரவம் வெளியேற்றப்பட்டது. இது 5 நிமிடங்களுக்கு 50 μl min-1 என்ற பாய்வு விகிதத்தில் செய்யப்பட்டது, பின்னர் கரைப்பான் B-யின் செறிவு 40% ஆக அதிகரிக்கப்பட்டது. வெளியேற்றப்பட்ட திரவம் தொடர்ச்சியாக ESI அயனி மூலத்திற்குள் செலுத்தப்பட்டது, மேலும் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் மற்றும் GPI-கிளைக்கான்களைக் கொண்ட பெப்டைடுகள் LTQ ஆர்பிட்ராப் XL (கலப்பின நேரியல் அயனிப் பொறி-ஆர்பிட்ராப் நிறை நிறமாலைமானி; தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. MS அமைப்பில், நுண்குழாய் மூலத்தின் மின்னழுத்தம் 4.5 kV ஆகவும், பரிமாற்ற நுண்குழாயின் வெப்பநிலை 300°C ஆகவும் வைக்கப்பட்டது. நுண்குழாய் மின்னழுத்தம் மற்றும் குழாய் வில்லை மின்னழுத்தம் முறையே 15 V மற்றும் 50 V ஆக அமைக்கப்பட்டன. MS தரவு, 300 m/z நிறை/மின்னூட்ட விகிதம் (m/z) 3000 என்ற நிறை வரம்பில், நேர்மின்னயனி முறையில் (பிரிதிறன் 60,000; நிறைத் துல்லியம் ஒரு மில்லியனுக்கு 10 பாகங்கள்) பெறப்பட்டது. இந்த MS/MS தரவு, LTQ Orbitrap XL-இல் உள்ள அயனிப் பொறி மூலம் பெறப்படுகிறது [தரவு சார்ந்திருக்கும் முதல் 3 இலக்கங்கள், மோதலால் தூண்டப்பட்ட சிதைவு (CID) ஆகும்].
GROMACS (52) மென்பொருள் மற்றும் MARTINI 2 விசைப் புலம் (53-55) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி MD உருவகப்படுத்துதல்கள் செய்யப்பட்டன. பின்னர், டையோலியோயில்பாஸ்பாடிடைல்கோலின் (DOPC) மற்றும் Cer C18 அல்லது DOPC மற்றும் Cer C26 ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு இருபடையை உருவாக்க CHARMM GUI மெம்பிரேன் பில்டர் (56, 57) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஸ்பிங்கோசின் வாலிலிருந்து கூடுதல் மணிகளை அகற்றுவதன் மூலம், Cer C26-இன் இடவியல் மற்றும் ஆயத்தொலைவுகள் DXCE-இலிருந்து பெறப்படுகின்றன. கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ள செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி இரட்டை அடுக்கைச் சமநிலைப்படுத்தி இயக்கவும், பின்னர் Emp24-ஐக் கொண்ட ஒரு அமைப்பை உருவாக்க, அமைப்பின் கடைசி ஆயத்தொலைவுகளைப் பயன்படுத்தவும். ஈஸ்ட் Emp24-இன் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் டொமைன் (எஞ்சியவை 173 முதல் 193 வரை) விஷுவல் MD (VMD) கருவியான மூலக்கூறு அமைப்பு (58)-ஐப் பயன்படுத்தி ஒரு α-ஹெலிக்ஸாக உருவாக்கப்பட்டது. பின்னர், ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் லிப்பிடுகளை அகற்றிய பிறகு, புரதம் பெரிய துகள்களாக ஆக்கப்பட்டு CHARMM GUI-ஐப் பயன்படுத்தி இருபடைக்குள் செருகப்பட்டது. இறுதி அமைப்பில் 1202 DOPC மற்றும் 302 Cer C26 அல்லது 1197 DOPC, 295 Cer C18 மற்றும் Emp24 ஆகியவை அடங்கியுள்ளன. இந்த அமைப்பை 0.150M செறிவுக்கு அயனியாக்கம் செய்யவும். இரண்டு இரு அடுக்குக் கலவைகளுக்காக நான்கு தனித்தனி பிரதிகள் உருவாக்கப்பட்டன.
CHARMM GUI செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி லிப்பிட் பைலேயர் சமநிலைப்படுத்தப்படுகிறது. இதில் 405,000 படிகள் குறைக்கப்பட்டு பின்னர் சமநிலைப்படுத்தப்படுகின்றன. அப்போது, ​​நிலை கட்டுப்பாடுகள் படிப்படியாகக் குறைக்கப்பட்டு நீக்கப்படுகின்றன, மேலும் நேரப் படி 0.005 ps-இலிருந்து 0.02 ps-ஆக அதிகரிக்கப்படுகிறது. சமநிலைப்படுத்தலுக்குப் பிறகு, இது 0.02 ps நேரப் படியுடன் 6 µs-ஐ உருவாக்குகிறது. Emp24-ஐச் செருகிய பிறகு, அதே CHARMM GUI செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி அமைப்பைக் குறைத்து சமநிலைப்படுத்தி, பின்னர் உற்பத்தி நிலையில் 8 விநாடிகளுக்கு இயக்கவும்.
அனைத்து அமைப்புகளுக்கும், சமநிலைப்படுத்தும் செயல்பாட்டின் போது, ​​அழுத்தம் பெரென்ட்சன் பாரோஸ்டாட் (59) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, மற்றும் உற்பத்தி செயல்பாட்டின் போது, ​​அழுத்தம் பாரினெல்லோ-ரஹ்மான் பாரோஸ்டாட் (60) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. எல்லா நிகழ்வுகளிலும், சராசரி அழுத்தம் 1 பார் மற்றும் ஒரு பகுதி-சமச்சீர் அழுத்த இணைப்புத் திட்டம் பயன்படுத்தப்படுகிறது. சமநிலை மற்றும் உற்பத்தி செயல்பாட்டில், புரதம், லிப்பிட் மற்றும் கரைப்பான் துகள்களின் வெப்பநிலையை முறையே இணைக்க வேக மறுசீரமைப்புடன் கூடிய ஒரு தெர்மோஸ்டாட் (61) பயன்படுத்தப்படுகிறது. முழு செயல்பாட்டின் போதும், இலக்கு வெப்பநிலை 310K ஆகும். 0.005 இடையக சகிப்புத்தன்மையுடன் வெர்லெட் திட்டத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு இணை பட்டியலை உருவாக்குவதன் மூலம் பிணைப்பு அல்லாத தொடர்பு கணக்கிடப்படுகிறது. கூலும் உறுப்பு, வினை புலம் மற்றும் 1.1 nm துண்டிப்பு தூரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகிறது. வாண்டர் வால்ஸ் உறுப்பு 1.1 nm துண்டிப்பு தூரத்துடன் கூடிய ஒரு துண்டிப்பு திட்டத்தைப் பயன்படுத்துகிறது, மற்றும் வெர்லெட் துண்டிப்பு திட்டம் சாத்தியமான சறுக்கலுக்கு (62) பயன்படுத்தப்படுகிறது.
VMD-ஐப் பயன்படுத்தி, DOPC பாஸ்பேட் மணிகள் அல்லது செரமைடு AM1 மணிகளுக்கும் புரதத்திற்கும் இடையிலான துண்டிப்பு அலைநீளம் 0.7 nm ஆகும், மேலும் புரதத்துடன் தொடர்பு கொள்ளும் லிப்பிடுகளின் எண்ணிக்கை கணக்கிடப்படுகிறது. பின்வரும் சூத்திரத்தின்படி, (63)-இல் உள்ளவாறு குறைவு-செறிவூட்டல் (DE) காரணியைக் கணக்கிடுங்கள்: DE காரணி = (புரதத்தில் உள்ள மொத்த லிப்பிடுகளின் அளவு 0.7) / (மொத்த லிப்பிடுகளில் உள்ள Cer-இன் அளவு)
அறிவிக்கப்பட்ட மதிப்பு ஒரு சராசரியாகப் பெறப்படுகிறது, மேலும் பிழைப் பட்டைகள் SE-இன் நான்கு சுயாதீன நகல்களாகும். DE காரணியின் புள்ளிவிவர முக்கியத்துவம் t சோதனை மூலம் கணக்கிடப்படுகிறது [(சராசரிDE-காரணி-1)/SE]. ஒரு-முனைப் பரவலிலிருந்து P மதிப்பைக் கணக்கிடுங்கள்.
தடத்தின் கடைசி 250 நானோ வினாடிகளுக்குள், Emp24-ஐக் கொண்ட அமைப்பின் 2D பக்கவாட்டு அடர்த்தி வரைபடத்தைக் கணக்கிட GROMACS கருவி பயன்படுத்தப்பட்டது. செரமைடின் செறிவூட்டல்/குறைப்பு வரைபடத்தைப் பெறுவதற்காக, Cer-இன் அடர்த்தி வரைபடமானது, Cer மற்றும் DOPC-இன் வரைபடங்களின் கூட்டுத்தொகையால் வகுக்கப்பட்டு, பின்னர் உடலில் உள்ள Cer-இன் செறிவால் வகுக்கப்படுகிறது. அதே வண்ண வரைபட அளவுகோல் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
இந்தக் கட்டுரைக்கான கூடுதல் தகவல்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 என்ற இணைப்பைப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-நான்-கமர்ஷியல் உரிமத்தின் கீழ் விநியோகிக்கப்பட்ட ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரை ஆகும். இந்த உரிமம், இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக இல்லாத வரையிலும், அசல் படைப்பு சரியானது என்ற அடிப்படையிலும், எந்தவொரு ஊடகத்திலும் இதன் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது. மேற்கோள்.
குறிப்பு: நீங்கள் இந்தப் பக்கத்திற்குப் பரிந்துரைக்கும் நபர், இந்த மின்னஞ்சலை அவர்கள் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் அறிந்துகொள்வதற்காக மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் கேட்டுக்கொள்கிறோம். நாங்கள் எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் சேகரிக்க மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளர்தானா என்பதைச் சோதிப்பதற்கும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுப்பதற்கும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera, Aguilera-Romero, (செர்ஜியோ லோபஸ்), மிஹோ வாகா (மிஹோ வாகா), மிசாகோ அர்மான் (மிசாகோ அர்மான்), மியாகோ ரிமான் (மியாகோ ரிமான்), ப்ரோ அகிரா, ஸ்டெபனோ ஃபேனி, அகிஹிகோ நகனோ, மானுவல் முனிஸ்
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியீட்டுத் தளங்களில் புரதங்களை வரிசைப்படுத்துவதற்கு செரமைடு சங்கிலியின் நீளம் எவ்வளவு முக்கியம் என்பதை முப்பரிமாண உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிகழ்நேரப் படமெடுத்தல் வெளிப்படுத்துகிறது.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera, Aguilera-Romero, (செர்ஜியோ லோபஸ்), மிஹோ வாகா (மிஹோ வாகா), மிசாகோ அர்மான் (மிசாகோ அர்மான்), மியாகோ ரிமான் (மியாகோ ரிமான்), ப்ரோ அகிரா, ஸ்டெபனோ ஃபேனி, அகிஹிகோ நகனோ, மானுவல் முனிஸ்
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியீட்டுத் தளங்களில் புரதங்களை வரிசைப்படுத்துவதற்கு செரமைடு சங்கிலியின் நீளம் எவ்வளவு முக்கியம் என்பதை முப்பரிமாண உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிகழ்நேரப் படமெடுத்தல் வெளிப்படுத்துகிறது.
©2020 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS ஆனது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.