Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS-க்கான ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை அணைக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காண்பிப்போம்.
முதுகெலும்பிகளைப் போலல்லாமல், பூச்சிகளில் ஆண் சார்ந்த பாலியல் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்கள் இல்லை என்று பரவலாகக் கருதப்படுகிறது. அனோபிலிஸ் காம்பியாவில், எக்டைசோன் ஸ்டீராய்டான 20-ஹைட்ராக்ஸிஎக்டைசோன் (20E), பெண் கொசுக்களால் தொகுக்கப்படும்போது முட்டை வளர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்தவும்², ஆண் கொசுக்களால் பாலியல் ரீதியாக மாற்றப்படும்போது இனப்பெருக்கத் தடைக்காலத்தைத் தூண்டவும்³ பரிணாம வளர்ச்சி அடைந்ததாகத் தெரிகிறது. முட்டை வளர்ச்சியும் இனப்பெருக்கமும் அத்தியாவசியமான இனப்பெருக்கப் பண்புகள் என்பதால், பெண் அனோபிலிஸ் கொசுக்கள் இந்த ஹார்மோன் சமிக்ஞைகளை எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்வது, புதிய மலேரியா கட்டுப்பாட்டுத் திட்டங்களை வடிவமைக்க உதவும். இங்கே, இந்த இனப்பெருக்கச் செயல்பாடுகள், எக்டைஸ்டீராய்டை செயல்படுத்தும்/செயலிழக்கச் செய்யும் நொதிகளின் ஒரு சிக்கலான வலையமைப்பு மூலம், தனித்துவமான பாலியல் ஸ்டீராய்டுகளால் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகின்றன என்பதை நாங்கள் வெளிப்படுத்துகிறோம். பாலியல் பரிமாற்றம் மற்றும் டிபாஸ்போரிலேஷன் மூலம் செயல்படுத்தப்பட்ட பின்னர் பெண் கொசுக்களின் பாலியல் ஏற்புத்தன்மையை முடக்குவதன் மூலம் பெற்றோர் தன்மையைப் பாதுகாக்கும், ஆண் கொசுக்களுக்கு மட்டுமேயான ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட எக்டைசோனான 3-டிஹைட்ரோ-20E (3D20E)-ஐ நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். குறிப்பிடத்தக்க வகையில், 3D20E பரிமாற்றம், இனப்பெருக்கத்தின் போது முட்டை வளர்ச்சியைப் பராமரிக்கும் இனப்பெருக்க மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டையும் தூண்டியது. பிளாஸ்மோடியம் தொற்று, பாதிக்கப்பட்ட பெண் பூச்சிகளின் ஆரோக்கியத்தை உறுதி செய்கிறது. பெண் பூச்சிகளிலிருந்து பெறப்படும் 20E, பாலியல் தூண்டலை ஏற்படுத்தாது, ஆனால் 20E-ஐத் தடுக்கும் கைனேஸ்கள் தடுக்கப்பட்ட பிறகு, இனச்சேர்க்கை செய்யும் பூச்சிகள் முட்டையிட அனுமதிக்கிறது. ஆண் பூச்சிகளுக்கு மட்டுமேயான இந்த ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனைக் கண்டறிவதும், பெண் பூச்சிகளின் பாலியல் ஏற்புத்தன்மை, கருவுறுதல் மற்றும் பிளாஸ்மோடியத்துடனான தொடர்பு ஆகியவற்றை ஒழுங்குபடுத்துவதில் அதன் பங்கும், மலேரியாவைப் பரப்பும் கொசுக்களின் இனப்பெருக்க வெற்றியை குறைப்பதற்கான சாத்தியத்தைக் காட்டுகிறது.
மனித மலேரியா ஒட்டுண்ணிகளின் ஒரே கடத்தியான அனோஃபிலிஸ் கொசுக்களில் பரவலான பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்புத்தன்மை ஏற்பட்டுள்ளதால், மலேரியா பாதிப்புகளும் இறப்புகளும் மீண்டும் அதிகரித்து வருகின்றன. இந்தக் கொசுக்களின் இனப்பெருக்க உயிரியல், புதிய மலேரியா கட்டுப்பாட்டுத் தலையீடுகளுக்கு மிகவும் கவர்ச்சிகரமான ஒரு இலக்காக உள்ளது, ஏனெனில் பெண் கொசுக்கள் ஒரு முறை மட்டுமே இனச்சேர்க்கை செய்கின்றன; இந்த ஒற்றை இனச்சேர்க்கை நிகழ்வை மலட்டுத்தன்மை உடையதாக மாற்றுவது, களத்தில் கொசுக்களின் எண்ணிக்கையைக் குறைப்பதற்கான பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டிருக்கும்.
ஆண்களிடமிருந்து அதிக செறிவுள்ள ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களைப் பெற்ற பிறகு பெண்கள் பாலியல் ரீதியாக இயலாமை அடைகின்றனர். மேலும் இனச்சேர்க்கையில் ஏற்படும் சிரமத்திற்கான தூண்டுதல் 20-ஹைட்ராக்ஸிஎக்டைசோன் (20E) ஆகும் என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன; இது லார்வா பருவத்தில் தோலுரித்தல் சுழற்சியை ஒழுங்குபடுத்துவதாக நன்கு அறியப்பட்ட ஒரு ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் ஆகும். 20E-ஐ உற்பத்தி செய்து கடத்தும் ஆண்களின் திறன், குறிப்பாக ஆப்பிரிக்காவில் பரவியுள்ள மற்றும் அனோபிலிஸ் காம்பியாய் உட்பட மலேரியாவின் மிகவும் ஆபத்தான கடத்திகளை உள்ளடக்கிய செல்லியா7 என்ற துணைப்பேரினத்தின் ஒரு பகுதியான அனோபிலிஸ் இனங்களில் உருவாகியுள்ளது. இது குறிப்பாகக் குறிப்பிடத்தக்கது, ஏனெனில் இந்த இனங்களில் பெண் பூச்சிகளும் ஒவ்வொரு இரத்த உணவிற்குப் பிறகும் 20E-ஐ உற்பத்தி செய்கின்றன, மேலும் 20E அண்ட உருவாக்கச் சுழற்சியை இயக்குகிறது (பார்க்க குறிப்பு 8). இருப்பினும், இரண்டு வெவ்வேறு எக்டைசோன் மூலங்களிலிருந்து (ஆண் பரிமாற்றம் மற்றும் இரத்த உணவினால் தூண்டப்படுதல்) வரும் சமிக்ஞைகளை, பெண்கள் தங்கள் சொந்த இனச்சேர்க்கை திறனைப் பாதிக்காமல் எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கிறார்கள் என்பது பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை. உண்மையில், பெண் பூச்சிகளால் உற்பத்தி செய்யப்படும் 20E பாலியல் சகிப்பின்மையைத் தூண்டினால், இது மலட்டுத்தன்மைக்கு வழிவகுக்கும். கன்னிப் பிராணிகளை உண்ணும் உயிரினங்களில், இந்த கொசுக்களின் மிகவும் பொதுவான நடத்தை இதுவாகும்5.
ஒரு சாத்தியமான விளக்கம் என்னவென்றால், A. gambiae ஆண் உயிரிகள், மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஆண்-குறிப்பிட்ட எக்டைசோனை மாற்றுகின்றன, இது பெண் இனப்பெருக்கப் பாதையில் ஒரு சமிக்ஞைத் தொடரைச் செயல்படுத்துகிறது, இதன் விளைவாக இனச்சேர்க்கையில் நிலையற்ற தன்மை ஏற்படுகிறது. இருப்பினும், முதுகெலும்பிகளில் ஈஸ்ட்ரோஜன் மற்றும் ஆண்ட்ரோஜன் போன்ற பல ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்கள் இருந்தாலும் (குறிப்பு 9-இல் மதிப்பாய்வு செய்யப்பட்டது), எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, பூச்சிகளில் ஆண்ட்ரோஜெனிக்-சார்புடைய ஸ்டீராய்டுகள் அடையாளம் காணப்படவில்லை.
பாலியல் முதிர்ச்சியடைந்த ஏ. காம்பியேயின் ஆண் துணைச் சுரப்பியில் (MAG) உள்ள ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களின் தொகுப்பைக் கண்டறிந்து, சாத்தியமான மாற்றியமைக்கும் ஸ்டீராய்டுகளைத் தேட நாங்கள் முற்பட்டோம். முன்பு பயன்படுத்தப்பட்ட, குறைந்த துல்லியமான முறைக்குப் பதிலாக, உயர் செயல்திறன் திரவ நிறப்பிரிகை மற்றும் டேன்டம் நிறை நிறமாலையியல் (HPLC-MS/MS) முறையைப் பயன்படுத்தி, இந்தத் திசுவில் எக்டைசோன் (E) மற்றும் 20E ஆகியவற்றைக் கண்டறிந்தோம், இது முந்தைய முடிவை உறுதிப்படுத்தியது. இருப்பினும், இந்த மாதிரியில் ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட பாஸ்பேட்டேற்றப்பட்ட ஸ்டீராய்டுகளே அதிகமாக இருந்தன, இது 3-டிஹைட்ரோ-20E-22-பாஸ்பேட் (3D20E22P)¹² என்ற சூத்திரத்துடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் 1). மற்ற வடிவங்களில் 3-டிஹைட்ரோ-20E (3D20E) மற்றும் 20E-22-பாஸ்பேட் (20E22P) ஆகியவை அடங்கும். 3D20E22P-இன் HPLC-MS/MS சமிக்ஞை அடர்த்தி, அதன் பாஸ்பேட்டேற்றப்படாத வடிவமான 3D20E-ஐ விட இரண்டு மடங்கு அதிகமாகவும், E மற்றும் 20E-ஐ விட மூன்று மடங்கு அதிகமாகவும் இருந்தது. 20E (படம் 1). உடலின் மற்ற பாகங்களிலும் மற்றும் கீழ் இனப்பெருக்கப் பாதையிலும் (LRT; விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1a) காணப்பட்டாலும், புதிதாக மூடிய (<1 நாள் வயதுடைய) ஆண் மற்றும் பெண் உயிரிகளில் எக்டிஸ்டீராய்டுகளை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். மேலும், 3D20E மற்றும் 3D20E22P ஆகியவை MAG-இல் மட்டுமே இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்; E, 20E மற்றும் 20E22P ஆகியவை இரு பாலினங்களிலும் இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1b). இந்தத் தரவுகள், A. gambiae முதிர்வயது ஆண் உயிரிகள், பெண் உயிரிகளால் தொகுக்கப்படாத மாற்றியமைக்கும் ஹார்மோன்களைத் தங்களின் MAG-களில் அதிக அளவில் உற்பத்தி செய்கின்றன என்பதைக் காட்டுகின்றன.
4-நாள் வயதுடைய கன்னித்தன்மையுள்ள ஆண் ஈக்கள் மற்றும் கன்னித்தன்மையுள்ள மற்றும் இணை சேர்ந்த பெண் ஈக்களிடமிருந்து (0.5, 3, மற்றும் 12 hpm) MAG மற்றும் பெண் LRT (ஏட்ரியா, விந்துப்பைகள், மற்றும் பாரோவேரியம் உட்பட) பிரிக்கப்பட்டன. இந்த திசுக்களில் உள்ள எக்டைசோன் HPLC-MS/MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (சராசரி ± sem; இணைக்கப்படாத t-சோதனை, இருபக்க, தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதம் (FDR) சரிசெய்யப்பட்டது; NS, குறிப்பிடத்தக்கதல்ல; *P < 0.05, **P < 0.01). 3D20E: 3 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.035; 12 மணிநேரம் vs. 3 மணிநேரம், P = 0.0015; 12 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.030. 3D20E22P: 3 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.25; 12 மணிநேரம் vs. 3 மணிநேரம் vs. 3 மணிநேரம். மணிநேரம், P = 0.0032; 12 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.015). தரவுகள் மூன்று உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து பெறப்பட்டவை. ஆர்வமுள்ள ஒவ்வொரு எக்டைசோனின் உச்சப் பகுதியும் கணக்கிடப்பட்டு, கொசுக்களின் எண்ணிக்கையால் இயல்பாக்கப்பட்டது. எக்டைசோன் பின்வருமாறு வண்ணத்தால் குறிப்பிடப்படுகிறது: E, பச்சை; 20E, ஆரஞ்சு; 20E22P, ஊதா; 3D20E, நீலம்; 3D20E22P, இளஞ்சிவப்பு. உள்ளிணைப்பு, குறைந்த எக்டைசோன் அளவுகளைக் காட்டுவதற்காக y-அச்சில் அளவை அதிகரிக்கிறது.
இனப்பெருக்கத்தின் போது 3D20E22P மற்றும் 3D20E ஆகியவை கடத்தப்படுகின்றனவா என்பதை ஆராய்வதற்காக, இனப்பெருக்கத்திற்குப் பிறகு பல்வேறு நேரங்களில் பெண் உயிரிகளின் கீழ் சுவாசக் குழாய்களை (LRTs) நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். கன்னி உயிரிகளில் எக்டைசோன் காணப்படவில்லை என்றாலும், இனப்பெருக்கத்திற்குப் பிறகு உடனடியாக (இனப்பெருக்கத்திற்குப் பின் 0.5 மணி நேரம், hpm) கீழ் சுவாசக் குழாயில் கணிசமான அளவு 3D20E22P இருப்பதைக் கண்டோம்; இது காலப்போக்கில் குறைந்து வந்தது, அதே நேரத்தில் 3D20E அளவுகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தன (படம் 1). வேதியியல் முறையில் தயாரிக்கப்பட்ட 3D20E-ஐ ஒரு தரநிலையாகப் பயன்படுத்தி, இனப்பெருக்கத்தின் போது கீழ் சுவாசக் குழாய்களில் இந்த ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனின் அளவுகள் 20E-ஐ விடக் குறைந்தது 100 மடங்கு அதிகமாக இருந்தன என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 1). எனவே, இனப்பெருக்கத்தின் போது பெண் உயிரிகளின் கீழ் சுவாசக் குழாய்க்குக் கடத்தப்படும் முக்கிய ஆண் எக்டைசோன் 3D20E22P ஆகும், மேலும் அதன் பாஸ்பேட் நீக்கப்பட்ட வடிவமான 3D20E, இனப்பெருக்கத்திற்குப் பிறகு விரைவில் அதிக அளவில் காணப்படுகிறது. இது, இனப்பெருக்கத்திற்குப் பிந்தைய பெண் உயிரிகளின் உயிரியலில் இந்த எக்டைசோன் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிப்பதைக் காட்டுகிறது.
தனிப்பயனாக்கப்பட்ட பயோஇன்ஃபர்மேட்டிக்ஸ் பைப்லைனைப் பயன்படுத்தி, ஒரு புதிய ஆர்.என்.ஏ வரிசைப்படுத்தல் (RNA-seq) தரவுத்தொகுப்பை (படம் 2a) உருவாக்கிய பிறகு, நாங்கள் எக்டைசோன் கைனேஸ் (EcK), எக்டைசோன் ஆக்சிடேஸ் (EO), மற்றும் எக்டைசோனைக் குறியிடும் 20E-மாற்றியமைக்கப்பட்ட பாஸ்படேஸ் மரபணு ஆகியவற்றைத் தேடினோம். EPP இனப்பெருக்கத் திசுக்களில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. நாங்கள் ஒரு சாத்தியமான EPP மரபணுவையும் இரண்டு EcK மரபணுக்களையும் (EcK1 மற்றும் EcK2) அடையாளம் கண்டோம், ஆனால் ஒரு நல்ல சாத்தியமான EO மரபணுவைக் கண்டுபிடிக்க முடியவில்லை. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், காம்பியன் MAG-களில் தனிப்பட்ட EPP மரபணுக்கள் உயர் மட்டங்களில் (98.9-வது பெர்சென்டைல்) வெளிப்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் பெண் LRT-களில் (படம் 2b) வெளிப்படுத்தப்படவில்லை. இந்தப் பெண் திசுவில் 3D20E22P-இன் டிபாஸ்போரிலேஷன் நிகழ்ந்ததால், இது எங்கள் எதிர்பார்ப்புகளுக்கு முரணாக இருந்தது. எனவே, இனச்சேர்க்கையின் போது ஆண் EPP மாற்றப்படலாம் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். உண்மையில், இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு பெண் புரதத்தை மறைக்க, நாங்கள் இன் விவோ நிலையான ஐசோடோப் லேபிளிங்கைப் பயன்படுத்தினோம்; இது பெண் ஏட்ரியத்தில் MS மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட ஒரு நொதியாகும் (படம் 2c). மற்றும் துணை அட்டவணை 1). குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி MAG மற்றும் இணை சேர்ந்த (ஆனால் கன்னித்தன்மையற்ற) பெண் LRT-களில் EPP இருப்பதும் உறுதி செய்யப்பட்டது (படம் 2d).
அ, ஒவ்வொரு பாலினத்தின் இனப்பெருக்கத் திசுக்களிலும் EcK-கள், EO-கள் மற்றும் EPP-களைக் குறியீடு செய்யும் மரபணுக்களைத் தேடுவதற்காக பிரத்யேகமாக உருவாக்கப்பட்ட ஒரு உயிரித் தகவல் பைப்லைன். அம்புக்குறிகளுக்கு அடுத்துள்ள எண்கள், ஒவ்வொரு படியிலும் உள்ள ஆண் மற்றும் பெண் சாத்தியக்கூறுகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கின்றன. இந்தப் பகுப்பாய்வு, ஆண்களில் வெளிப்படும் ஒரு EPP மரபணுவையும் (EPP) ஒரு EcK மரபணுவையும் (EcK1), மற்றும் இரு பாலினங்களிலும் வெளிப்படும் ஆனால் ஒரு சாத்தியக்கூறு EO மரபணுவை அளிக்காத ஒரு EcK மரபணுவையும் (EcK2) அடையாளம் கண்டது. ஆ, கன்னி (V) மற்றும் இனச்சேர்க்கை (M) நிலையில் உள்ள அனோபிலிஸ் காம்பியாய் மற்றும் அனோபிலிஸ் அல்பிகன்ஸ் திசுக்களில் சாத்தியக்கூறு மரபணு வெளிப்பாட்டை ஒப்பிடும் வெப்ப வரைபடம். Spca, கருவுறுதல்; MAGs, ஆண்களில் உள்ள துணைச் சுரப்பிகள்; இரு பாலினத்தவருக்கும் மார்பகங்கள், இறக்கைகள், கால்கள், கொழுப்பு உடல்கள் மற்றும் உள் உறுப்புகள் உட்பட உடலின் மற்ற பாகங்களிலும், பெண் பூச்சிகளின் சூலகங்களிலும் இது காணப்படுகிறது. காம்பியாவின் MAG மற்றும் ஏட்ரியா இரண்டிலும் EcK2 அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, அதேசமயம் EPP ஆனது MAG-இல் மட்டுமே காணப்படுகிறது.c, 3, 12 மற்றும் 24 hpm-இல் பெண் ஏட்ரியாவிற்குள் ஆண் விந்துக் குழுவின் இடமாற்றத்தின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு, மிகவும் அதிகமாகக் காணப்படும் 67 புரதங்களைக் காட்டுகிறது. அனைத்து புரதங்களையும் குறியிட (மற்றும் மறைக்க) 15N கொண்ட உணவில் பெண் பூச்சிகள் வளர்க்கப்பட்டன. குறியிடப்படாத ஆண் பூச்சிகள் குறியிடப்பட்ட பெண் பூச்சிகளுடன் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்டன, மேலும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விற்காக பெண் பூச்சிகளின் LRT-கள் 3, 12 மற்றும் 24 hpm-இல் பிரிக்கப்பட்டன (விந்துப் புரதங்களின் முழுமையான பட்டியலுக்கு துணை அட்டவணை 1-ஐப் பார்க்கவும்). உட்படம், கன்னி ஆண் பூச்சிகளின் MAG-இல் EPP, Eck1 மற்றும் EcK2 ஆகியவை இந்த திசுக்களின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு மூலம் கண்டறியப்பட்டன.d, இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பூச்சிகளின் MAG மற்றும் LRT-இல் வெஸ்டர்ன் பிளாட் மூலம் EPP கண்டறியப்பட்டது. பெண்களில் காணப்பட்டது, ஆனால் கன்னிப் பெண்கள், ஆண்கள் அல்லது பெண் உடலின் மற்ற பகுதிகளில் காணப்படவில்லை. சவ்வுகள் ஒரே நேரத்தில் ஆன்டி-ஆக்டின் (லோடிங் கண்ட்ரோல்) மற்றும் ஆன்டி-இபிபி ஆன்டிபாடிகளைக் கொண்டு ஆய்வு செய்யப்பட்டன. அனைத்து ஆண்களும் கன்னித்தன்மை உடையவர்கள். ஜெல் மூலத் தரவுகளுக்கு துணைப் படம் 1-ஐப் பார்க்கவும். வெஸ்டர்ன் பிளாட்கள் இரண்டு முறை செய்யப்பட்டன, முடிவுகள் ஒரே மாதிரியாக இருந்தன.
MAG-இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட 3D20E22P உடன் அடைகாத்த பிறகு, EPP-இன் எக்டிஸ்டீராய்டு பாஸ்போபாஸ்பேடேஸ் செயல்பாடு HPLC-MS/MS மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2a). மேலும், RNA-வழி குறுக்கீடு (RNAi) மூலம் EPP-ஐ செயலிழக்கச் செய்தபோது, ​​இந்த ஆண் கொசுக்களின் இனப்பெருக்க திசுக்களில் பாஸ்பேடேஸ் செயல்பாட்டில் ஒரு வலுவான குறைவைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3a), மேலும் பகுதி மரபணு செயலிழப்பு இருந்தபோதிலும் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2b,c), EPP-செயலிழக்கப்பட்ட ஆண் கொசுக்களுடன் இணைந்த பெண் கொசுக்கள், பாஸ்பேட் நீக்கப்பட்ட 3D20E-இன் குறிப்பிடத்தக்க குறைந்த விகிதத்தைக் காட்டின (படம் 3b). இதற்கு மாறாக, அதே கொசுக்களில் 20E22P/20E விகிதத்தில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை நாங்கள் கண்டறியவில்லை, இது அந்த நொதி 3D20E22P-க்கு பிரத்யேகமானது என்பதை உணர்த்தக்கூடும் (படம் 3b).
அ, இரட்டைச் சரம் கொண்ட EPP RNA (dsEPP) அல்லது இரட்டைச் சரம் கொண்ட GFP RNA (dsGFP) கட்டுப்பாடுகளைப் பயன்படுத்தி EPP-ஐ செயலிழக்கச் செய்வதால் MAG-இல் பாஸ்படேஸ் செயல்பாடு குறைந்தது. ஒவ்வொரு பிரதியிலும் இருபது MAG தொகுப்புகள் பயன்படுத்தப்பட்டன (P = 0.0046, இணைக்கப்பட்ட t-சோதனை, இருபக்க), அவை தனித்தனி புள்ளிகளால் குறிக்கப்படுகின்றன. ஆ, EPP-செயலிழக்கப்பட்ட ஆண் உயிரிகளுடன் இணைந்த பெண் உயிரிகளில், 3 hpm-இல் பாஸ்பேட் நீக்கப்பட்ட 3D20E-இன் விகிதம் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைவாக இருந்தது (P = 0.0043, இணையற்ற t-சோதனை, இருபக்க), அதேசமயம் 20E அளவுகள் பாதிக்கப்படவில்லை (P = 0.063, இணையற்ற). t-சோதனை, இருபக்க). தரவுகள், தலா 13, 16 மற்றும் 19 பெண் உயிரிகளைக் கொண்ட மூன்று தொகுப்புகளிலிருந்து பெறப்பட்ட சராசரி ± sem ஆக வழங்கப்பட்டுள்ளன.c, EPP செயல்பாடு முடக்கப்பட்ட ஆண் உயிரிகளுடன் இணைந்த பெண் உயிரிகள், மீண்டும் இணை சேரும் விகிதத்தில் குறிப்பிடத்தக்க அளவு அதிகமாக இருந்தன (P = 0.0002, ஃபிஷரின் துல்லியச் சோதனை, இருபக்க). பெண் உயிரிகளின் இணை சேரும் நிலையை உறுதி செய்வதற்காக, அவை முதலில் இணை சேரக் கட்டாயப்படுத்தப்பட்டன; 2 நாட்களுக்குப் பிறகு, மரபணு மாற்றத்தைக் கண்டறியும் அளவுசார் PCR முறையைப் பயன்படுத்தி மறு-இனச்சேர்க்கை விகிதங்களை மதிப்பிடுவதற்காக, மரபணு மாற்றப்பட்ட விந்தணுக்களைக் கொண்ட மற்ற ஆண் கொசுக்களுடன் அவை தொடர்பு கொள்ளப்பட்டன. இரத்தம் குடித்த பெண் கொசுக்கள், EPP செயல்பாடு முடக்கப்பட்ட ஆண் கொசுக்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்தபோது, ​​அவற்றின் கருவுறுதல் திறன் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைந்தது (P < 0.0001; மான்-விட்னி சோதனை, இருபக்கம்) மற்றும் முட்டைகளின் எண்ணிக்கை சற்றே குறைந்தது (P = 0.088, மான்-விட்னி சோதனை, இருபக்கம்). அதே சமயம், முட்டையிடும் விகிதம் பாதிக்கப்படவில்லை (P = 0.94, ஃபிஷரின் துல்லிய சோதனை, இருபக்கம்). அனைத்துப் பேனல்களிலும், n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுதந்திரமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது. NS, குறிப்பிடத்தக்கதல்ல. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
அடுத்து, பெண் உயிரிகளில் இனப்பெருக்க எதிர்ப்பைத் தூண்டுவதற்கு எக்டைசோன் டிபாஸ்போரிலேஷன் முக்கியமா என்பதை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். குறிப்பிடத்தக்க வகையில், EPP-குறைக்கப்பட்ட ஆண் உயிரிகளுடன் இணைந்த பெண் உயிரிகள், கூடுதல் (மரபணு மாற்றப்பட்ட) ஆண் உயிரிகளுடன் வெளிப்படுத்தப்பட்டபோது, ​​கட்டுப்பாட்டு பெண் உயிரிகளை விட (10.4%) மிக அதிக அதிர்வெண்ணில் (44.9%) மீண்டும் இணைந்தன (படம் 3c). கருவுறுதலில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவையும் (படம் 3d, இடது) மற்றும் இந்தப் பெண் உயிரிகளால் இடப்பட்ட முட்டைகளின் எண்ணிக்கையில் ஒரு சிறிய குறைவையும் (படம் 3d, நடுவில்) நாங்கள் கண்டறிந்தோம், அதே நேரத்தில் பெண் உயிரிகளால் இடப்பட்ட முட்டைகளின் சதவீதம் (இனப்பெருக்கத்தால் பெண் உயிரிகளில் தூண்டப்படும் மற்றொரு எதிர்வினை) பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 3d, வலது). 3D20E22P-க்கான EPP-யின் காணப்பட்ட பிரத்தியேகத்தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு, இந்த முடிவுகள், இனப்பெருக்கத்தின் போது மாற்றப்படும் EPP-யால் 3D20E செயல்படுத்தப்படுவது, மேலும் இனப்பெருக்கத்திற்கான பெண் உயிரிகளின் ஏற்புத்தன்மையை அணைப்பதில் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்று பரிந்துரைக்கின்றன; இந்த நடத்தை முன்னர் 20E-யின் பாலியல் பரிமாற்றத்திற்குக் காரணமாகக் கூறப்பட்டது. எனவே, இந்த ஆண்-குறிப்பிட்ட ஹார்மோனும் வலுவாக பெண்களின் கருவுறுதலைப் பாதிக்கிறது.
அடுத்து, பாலியல் முதிர்ச்சியடைந்த கன்னிப் பெண்களில், வேதியியல் முறையில் தயாரிக்கப்பட்ட 3D20E (படம் 4a–c) மற்றும் வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கும் 20E ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்ட ஊசிச் சோதனைகளில், 20E மற்றும் 3D20E ஆகியவற்றின் செயல்பாடுகளை நாங்கள் ஒப்பிட்டோம். இரண்டு செறிவுகளிலும், இனச்சேர்க்கைக்கான பெண் உணர்திறனை அணைப்பதில் 20E-ஐ விட 3D20E குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிக செயல்திறன் மிக்கதாக இருந்தது என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 4d). குறிப்பாக, இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு 18 pg என்ற மிக உயர்ந்த செறிவில் ஊசி செலுத்திய 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, LRT-இல் உள்ள 3D20E-இன் உடலியல் அளவில் பாதி (ஊசிக்குப் பின் 1,066 pg vs. இனச்சேர்க்கைக்குப் பின் 2,022 pg), 20E-இன் உடலியல் அளவை (ஊசிக்குப் பின் 361 pg) விட 20 மடங்கு அதிகமான, இனச்சேர்க்கைக்கு உட்படாத பெண் விலங்குகளின் விகிதத்தைத் தூண்டியது; விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 1). இந்த முடிவு, 20E-இன் பாலியல் பரிமாற்றம் இனப்பெருக்கத் தடைக்காலங்களை ஏற்படுத்தாது என்ற கருத்துடன் ஒத்துப்போகிறது, மேலும் பெற்றோர்-குழந்தை உறவை உறுதி செய்வதில் 3D20E ஒரு முக்கிய காரணியாக இருப்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகிறது. கன்னிப் பெண் உயிரிகளில் முட்டையிடும் சோதனைகளிலும் 20E-ஐ விட 3D20E குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிக செயல்பாடுடன் இருந்தது (படம் 4e). இது, பகுதி EPP செயலிழப்புக்குப் பிறகு நாம் கண்ட இயல்பான முட்டையிடும் விகிதமானது, இனப்பெருக்கத்தால் தூண்டப்பட்ட பெண் காரணிகளால் இன்னும் உற்பத்தி செய்யப்படும் எஞ்சிய 3D20E செயல்பாட்டின் காரணமாகவே இருந்தது என்பதை உணர்த்துகிறது.
(a,b) 20E-இலிருந்து (a) மிக அதிக மாற்ற விகிதம்/செயல்திறனுடன் வேதியியல் ரீதியாகத் தொகுக்கப்பட்ட 3D20E (தரவு மூன்று தனிப்பட்ட தொகுப்பு வினைகளிலிருந்து பெறப்பட்ட சராசரி ± sem ஆக வழங்கப்பட்டுள்ளது) (b).c, நிறை நிறமாலை (கீழ் பாதி) இணை சேர்ந்த பெண் LRT-இல் காணப்படும் எக்டைசோனுடன் (மேல் பாதி) துல்லியமாகப் பொருந்துகிறது.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ஃபிஷரின் துல்லிய சோதனை, இருபக்க) மற்றும் 10% எத்தனால் (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ஃபிஷரின் துல்லிய சோதனை, இருபக்க) ஆகியவற்றுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​அதிக அளவுகளில் (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54) மட்டுமே 20E கட்டுப்பாட்டைக் காட்டிலும் குறிப்பிடத்தக்க அளவு அதிகமாக இருந்தது. ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க).e, 10% எத்தனால் கட்டுப்பாடுகளை விட 3D20E ஊசி கன்னிப் பெண் கொசுக்களில் கணிசமாக அதிக முட்டையிடும் விகிதங்களைத் தூண்டியது (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க), அதேசமயம் 20E கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது அதிக அளவுகளில் மட்டுமே (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க). 3D20E அதிக அளவுகளில் 20E ஐ விட கணிசமாக அதிக முட்டையிடும் விகிதங்களைத் தூண்டியது (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க). அனைத்து பேனல்களிலும், n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுதந்திரமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது. NS, குறிப்பிடத்தக்கதல்ல. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. தரவுகள் மூன்று மறுசெய்கைகளிலிருந்து பெறப்பட்டவை.
முந்தைய ஆய்வுகளில், ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களின் பாலியல் பரிமாற்றம், மிகவும் கொடிய மனித மலேரியா ஒட்டுண்ணியான பி. ஃபால்சிபாரம் தொற்று 13-ஆல் ஏற்படும் உடல்நல பாதிப்புகளிலிருந்து ஏ. காம்பியே பெண் கொசுக்களைப் பாதுகாக்கும் ஒரு பெண் இனப்பெருக்க மரபணுவான MISO (இனச்சேர்க்கையால் தூண்டப்பட்ட அண்ட உற்பத்தி தூண்டி 11)-இன் வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். மலேரியா பரவலாக உள்ள பகுதிகளில் அனோஃபிலிஸ் கொசுக்களின் இனப்பெருக்கத் தகுதிக்கு MISO-வின் முக்கியத்துவத்தைக் கருத்தில் கொண்டு, 3D20E அல்லது 20E ஆகிய ஹார்மோன்களில் எது இந்த மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது என்பதைக் கண்டறிய நாங்கள் முடிவு செய்தோம். 20E ஊசியானது, HR3 மற்றும் HR4 போன்ற சில உட்கரு ஹார்மோன் ஏற்பிகளையும் (HR), மற்றும் கருமுட்டை உருவாக்கும் மரபணுக்களான Vg14, 15, 16 போன்ற வழக்கமான கீழ்நிலை ஸ்டீராய்டு இலக்குகளையும் குறிப்பாக அல்லது அதிக ஆற்றலுடன் தூண்டினாலும், MISO ஆனது 3D20E-ஆல் மிகவும் வலுவாகத் தூண்டப்பட்டது என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 3). இவ்வாறு, இந்த ஆண்ட்ரோஜெனிக் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனின் பாலியல் பரிமாற்றம், ஒட்டுண்ணிகளால் ஏற்படும் பாதிப்புகளிலிருந்து பெண் கொசுக்களைப் பாதுகாக்கும் வழிமுறைகளைத் தூண்டுவதாகத் தெரிகிறது. மேலும், 3D20E ஆனது E ஏற்பி EcR-இன் இரு ஐசோஃபார்ம்களையும் வேறுபட்ட முறையில் பாதிக்கிறது; இது EcR-A-ஐத் தூண்டி, EcR-B-ஐ அடக்குகிறது. அத்துடன், பெண் கருவுறுதலைப் பாதிக்கும் HPX15 உட்பட, இனச்சேர்க்கையைத் தூண்டும் பிற மரபணுக்களையும் இது மிகவும் வலுவாகத் தூண்டுகிறது. EPP-செயலிழக்கப்பட்ட ஆண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்த பெண்களில் காணப்படும் குறிப்பிடத்தக்க மலட்டுத்தன்மையை இது விளக்கக்கூடும் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படம் 3). இந்தத் தரவுகள், பாலின-குறிப்பிட்ட செயல்பாட்டிற்கு அடிப்படையாக அமையக்கூடிய, இரண்டு எக்டைசோன் ஹார்மோன்களால் முன்னுரிமையுடன் செயல்படுத்தப்படும் கீழ்நிலைப் பாதைகளின் இருப்பைச் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
அடுத்து, எங்கள் பயோஇன்ஃபர்மேட்டிக்ஸ் பைப்லைனில் அடையாளம் காணப்பட்ட இரண்டு EcK மரபணுக்களின் செயல்பாட்டை நாங்கள் சோதித்தோம். EcK1 அல்லது EcK2-ஐ செயலிழக்கச் செய்தபோது ஆண்களில் குறிப்பிடத்தக்க இறப்பு ஏற்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 4a), இது எக்டைசோன் பாஸ்போரைலேஷன், அதன் விளைவாக செயலிழப்பு, உயிர்வாழ்வதற்கு முக்கியமானது என்பதைக் காட்டுகிறது. EcK1-ஐ விட EcK2 அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டதாலும், புரோட்டியோமிக்ஸ் மூலம் MAG-களில் கண்டறியப்பட்டதாலும் (படம் 2b,c மற்றும் துணை அட்டவணை 2), அதை 20E உடன் சேர்த்து இன்குபேட் செய்வதன் மூலம் அதன் எக்டிஸ்டீராய்டு கைனேஸ் செயல்பாட்டை நாங்கள் சரிபார்த்தோம், இதன் விளைவாக பாஸ்போரைலேஷன் 20E22P ஏற்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2b). 3D20E-ஐ ஒரு சப்ஸ்ட்ரேட்டாகப் பயன்படுத்தியபோது, ​​பாஸ்போரைலேட் செய்யப்பட்ட தயாரிப்பான 3D20E22P-ஐ எங்களால் கண்டறிய முடியவில்லை (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 4c), இது 3D20E-ஐ விட 20E-யே EcK2-இன் விருப்பமான இலக்காக இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டுகிறது.
எங்களின் RNA-seq பகுப்பாய்வின்படி, கன்னிப் பெண் உயிரிகளின் LRT-யிலும் EcK2 அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது, அங்கு அது இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு அணைக்கப்பட்டது (படம் 2b). நாங்கள் இந்தத் தரவுகளை உறுதிசெய்து, இரத்த உணவால் EcK2 வெளிப்பாடு பாதிக்கப்படவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படம் 5a). எங்களின் ஆரம்ப MS சோதனைகளை விரிவுபடுத்தி, 20E22P-யின் உச்சமானது 20E-யின் உச்சத்துடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (இரத்த உணவுக்குப் பிறகு 22-26 மணிநேரம்; விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படம் 5b). கன்னிப் பெண் உயிரிகளில் EcK2-ஐ அமைதிப்படுத்தியபோது, ​​இரத்த உணவுக்குப் பிறகு 26 மணிநேரத்தில் 20E மற்றும் 20E22P-யின் ஒப்பீட்டு விகிதத்தில் 3 மடங்கு அதிகரிப்பு ஏற்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படங்கள் 2c மற்றும் 5c), இது பெண் உயிரிகளிலும் EcK2, 20E-ஐ பாஸ்போரைலேட் செய்கிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், EcK2-குறைக்கப்பட்ட கன்னி உயிரிகள் முழுமையான பாலியல் ஏற்புத்தன்மையைத் தக்கவைத்துக் கொண்டன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படம் 5d,e), இது பெண் உயிரிகளின் 20E உற்பத்தியானது இனப்பெருக்கத் தடைக்காலங்களைத் தூண்டவில்லை. இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது இந்தப் பெண் உயிரிகள் கணிசமாக அதிகரித்த முட்டையிடும் விகிதங்களைக் கொண்டிருந்தன; 30%-க்கும் மேற்பட்ட கன்னி உயிரிகள் முட்டையிட்டன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5f). இரத்தம் குடித்த பிறகு இரட்டைச் சரம் கொண்ட Eck2 RNA (dsEcK2) ஊசிகள் செலுத்தப்பட்டால், முட்டையிடுதல் நிகழவில்லை; அந்த நேரத்தில், இரத்தம் குடித்ததால் ஏற்பட்ட 20E-யின் உச்சம் குறைந்திருந்தது. ஒட்டுமொத்தமாக, இரத்தம் உறிஞ்சிய பிறகு உற்பத்தி செய்யப்படும் 20E, இனப்பெருக்கத்தைத் தூண்டக்கூடும், ஆனால் இனப்பெருக்கத்தால் முட்டையிடும் தடை (EcK2 மற்றும் பிற காரணிகள்) அணைக்கப்படும்போது மட்டுமே இது நிகழும் என்ற ஒரு மாதிரியை இந்த முடிவுகள் ஆதரிக்கின்றன. 20E அல்லது 3D20E ஊசிகள் கன்னி உயிரிகளில் EcK2 வெளிப்பாட்டைத் தடுக்கவில்லை (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5g), இது இந்தக் கைனேஸின் தடுப்பிற்கு மற்ற காரணிகள் காரணமாகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. இருப்பினும், இரத்தம் குடித்த பிறகு 20E அளவுகள் இனப்பெருக்க அசௌகரியத்தைத் தூண்டுவதற்குப் போதுமானதாக இல்லை, ஆனால் பாலியல் ரீதியாக மாற்றப்பட்ட 3D20E-யின் அதிக அளவுகளால் அவை திறம்படத் தூண்டப்பட்டன.
எங்கள் முடிவுகள், ஏ. காம்பியேயின் இனப்பெருக்க வெற்றியை ஒழுங்குபடுத்தும் வழிமுறைகள் குறித்த முக்கியமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன. ஆண் உயிரிகள், 3D20E என்ற ஆண்-குறிப்பிட்ட மாற்றியமைக்கப்பட்ட எக்டைசோனை அதிக அளவில் உற்பத்தி செய்ய பரிணாம வளர்ச்சி அடைந்துள்ளன என்ற ஒரு மாதிரி உருவாகியுள்ளது. இது பெண் உயிரிகளை மேலும் இனச்சேர்க்கைக்கு உணர்வற்றதாக்குவதன் மூலம் பெற்றோர் தன்மையை உறுதி செய்கிறது. அதே நேரத்தில், இந்த மலேரியா கடத்திகள், ஆண்-குறிப்பிட்ட EPP-யின் பாலியல் பரிமாற்றத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, பெண் உயிரிகளில் 3D20E-ஐ செயல்படுத்த ஒரு திறமையான அமைப்பையும் பரிணாம வளர்ச்சி மூலம் பெற்றுள்ளன. எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, பூச்சிகளில் ஒரு தனித்துவமான மற்றும் முக்கியமான செயல்பாட்டைச் செய்யும் ஆண் மற்றும் பெண் ஆதிக்கம் செலுத்தும் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் அமைப்பின் முதல் உதாரணம் இதுவாகும். ஆண்-குறிப்பிட்ட எக்டைசோன் செயல்பாடு கருதுகோளாக முன்வைக்கப்பட்டுள்ளது, ஆனால் அது திட்டவட்டமாக நிரூபிக்கப்படவில்லை. உதாரணமாக, இந்த செயல்பாடுகள் 20E முன்னோடியான E1-ஆல் செய்யப்படலாம் என்பது பெருமளவில் தவறென நிரூபிக்கப்பட்ட ஒரு கருதுகோள்¹⁸. ட்ரோசோஃபிலாவில், சிறிய பாலியல் பெப்டைடுகளின்¹⁹,²⁰ பாலியல் பரிமாற்றத்தால் ஒரு ஆண்-பெண் உறவுமுறை தூண்டப்படுகிறது என்பது நன்கு அறியப்பட்டதாகும். இந்த சிறிய பாலியல் பெப்டைடுகள், குறிப்பிட்ட பாலியல் பெப்டைடு வழியாக பெண் இனப்பெருக்கப் பாதைக்கு நரம்பூட்டம் அளிக்கும் நியூரான்களுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன. ஏற்பிகள்21,22. ஏ. காம்பியே பெண் பூச்சிகளில் 3D20E ஆல் கட்டுப்படுத்தப்படும் கீழ்நிலை சமிக்ஞை தொடர்வரிசைகளைத் தீர்மானிக்கவும், இந்தத் தொடர்வரிசைகள் கொசுக்கள் மற்றும் ட்ரோசோபிலாவுக்கு இடையில் பாதுகாக்கப்பட முடியுமா என்பதைத் தீர்மானிக்கவும் மேலதிகப் பணிகள் தேவைப்படுகின்றன.
எங்கள் ஆய்வில் கண்டறியப்பட்ட பெண் இனப்பெருக்கத் திறன் மற்றும் நடத்தையில் 3D20E வகிக்கும் முக்கியப் பங்கைக் கருத்தில் கொண்டு, 3D20E தொகுப்பு மற்றும் செயல்படுத்தலுக்கு வழிவகுக்கும் பாதைகள், எதிர்கால கொசு கட்டுப்பாட்டு உத்திகளுக்கு புதிய வாய்ப்புகளை வழங்குகின்றன. உதாரணமாக, மலட்டுப் பூச்சி தொழில்நுட்ப உத்திகளில் போட்டித்தன்மை வாய்ந்த மலட்டு ஆண் கொசுக்களை உருவாக்குதல், அவற்றை இயற்கையில் விடுவிப்பதற்காகப் பயன்படுத்துதல் அல்லது கன்னிப் பூச்சிகளின் விளையாட்டில் 3D20E-ஐப் போலப் பயன்படுத்துதல் போன்ற உத்திகள் இதில் அடங்கும். A. gambiae மற்றும் பிற Cellia இனங்கள் தங்கள் விந்தணுக்களை இனப்பெருக்க அடைப்பான்களாக உறைய வைக்கும் திறனைப் பெற்றபோது, ​​3D20E-இன் ஆண்-சார்ந்த செயல்பாடு உருவாகியிருக்கலாம். ஏனெனில் இது அதிக எண்ணிக்கையிலான ஹார்மோன்கள் மற்றும் ஹார்மோன்-செயல்படுத்தும் நொதிகளைத் திறமையாகக் கடத்த அனுமதிக்கிறது. இதன் விளைவாக, ஒரு ஆண் கொசுக்களுடன் மட்டும் இனப்பெருக்கம் செய்யும் முறையைச் செயல்படுத்தும் 3D20E பரிணாமம், அதிக மலேரியா பாதிப்புள்ள பகுதிகளில் பெண் கொசுக்கள் (MISO-வின் அதிக வெளிப்பாட்டின் மூலம்) தங்கள் இனப்பெருக்கத் தகுதியை மேம்படுத்திக்கொள்ள ஒரு வழிமுறையை வழங்குகிறது. இது மறைமுகமாக பிளாஸ்மோடியம் பரவலுக்கு வழிவகுக்கிறது. பெண் அனோஃபிலிஸ் கொசுக்களில் P. falciparum-இன் உயிர்வாழ்வு மற்றும் வளர்ச்சியில் பெண் 20E ஆழமான விளைவுகளை ஏற்படுத்துவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளதால், ஆண் மற்றும் பெண் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் ஆகிய இரண்டுமே... தற்போது, ​​கொசு-ஒட்டுண்ணி இடைவினைகளில் வழித்தடங்கள் முக்கிய அம்சங்களாக விளங்குகின்றன.
ஏ. காம்பியே ஜி3 இனங்கள் நிலையான பூச்சிச் சூழல்களில் (26-28 °C, 65-80% ஒப்பு ஈரப்பதம், 12:12 மணிநேர ஒளி/இருள் ஒளிக்காலம்) வளர்க்கப்பட்டன. லார்வாக்களுக்கு தூளாக்கப்பட்ட மீன் உணவு (டெட்ராமின் ட்ராபிகல் ஃப்ளேக்ஸ், கோய் பெல்லட்ஸ் மற்றும் டெட்ரா பாண்ட் ஸ்டிக்ஸ் 7:7:2 என்ற விகிதத்தில்) அளிக்கப்பட்டது. முதிர்ந்த கொசுக்களுக்கு வரம்பற்ற அளவில் 10% டெக்ஸ்ட்ரோஸ் கரைசலும், வாரந்தோறும் மனித இரத்தமும் (ஆய்வு இரத்தக் கூறுகள்) உணவாக அளிக்கப்பட்டன. நுண்ணோக்கி மூலம் முனைகளை ஆய்வு செய்த பிறகு, கூட்டுப்புழு நிலையில் ஆண், பெண் கொசுக்களைப் பிரிப்பதன் மூலம் கன்னி கொசுக்கள் பெறப்பட்டன. டிஎஸ்-ரெட் டிரான்ஸ்ஜீனைக் கொண்ட ஆண் கொசுக்கள் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட நெறிமுறைகளின்படி கட்டாய இனச்சேர்க்கை சோதனைகள் செய்யப்பட்டன. இயற்கையான இனச்சேர்க்கைக்காக, 4-நாள் வயதுடைய கன்னிப் பெண் உயிரிகள், பாலியல் முதிர்ச்சியடைந்த கன்னி ஆண் உயிரிகளுடன் 1:3 என்ற விகிதத்தில் இரண்டு இரவுகள் வைக்கப்பட்டன. ஆண் உயிரிகளுக்கு dsEPP செலுத்தப்பட்ட சோதனைகளில், பாஸ்படேஸ் செயல்பாடு அதிகபட்சமாக அடக்கப்பட்டிருந்த (விரிவாக்கப்பட்ட தரவுப் படம் 2b) ஊசி செலுத்தப்பட்டதற்குப் பிந்தைய 3-4 நாட்களில் அவை ஒன்றாகக் கூண்டில் அடைக்கப்பட்டன.
கொசு திசுக்கள், எஞ்சிய சடலங்கள் (உடலின் மற்ற பகுதிகள்) அல்லது முழு உடலும் 100% மெத்தனாலில் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, ஒரு பீடர் (2 மிமீ கண்ணாடி மணிகள், 2,400 ஆர்பிஎம், 90 விநாடி) கொண்டு கூழாக்கப்பட்டது. திசுக்களின் அளவுகள் மற்றும் மெத்தனால் கன அளவுகள் பின்வருமாறு: உடலின் மற்ற பகுதிகள், 1,000 மைக்ரோலிட்டரில் 50 மைக்ரோலிட்டர்; MAG, 80 மைக்ரோலிட்டரில் 50–100 மைக்ரோலிட்டர்; பெண் LRT, 80 மைக்ரோலிட்டரில் 25–50 மைக்ரோலிட்டர். வீழ்படிவானது அதே கன அளவு மெத்தனாலைக் கொண்டு இரண்டாவது மெத்தனால் பிரித்தெடுப்பிற்கு உட்படுத்தப்பட்டது. செல் சிதைவுகள் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. இரண்டு பிரித்தெடுப்புகளிலிருந்தும் பெறப்பட்ட மெத்தனால் ஒன்றாக இணைக்கப்பட்டு, நைட்ரஜன் ஓட்டத்தின் கீழ் உலர்த்தப்பட்டது. பின்னர் அது நீரில் கரைக்கப்பட்ட 80% மெத்தனாலின் பின்வரும் கன அளவுகளில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டது: உடலின் மற்ற பகுதிகள், 50 மைக்ரோலிட்டர்; MAG-கள் மற்றும் பெண் LRT, 30 மைக்ரோலிட்டர்.
மாதிரிகள், ஒரு LC கருவியுடன் (Vanquish, Thermo Fisher) இணைக்கப்பட்ட ஒரு நிறை நிறமாலைமானியில் (ID-X, Thermo Fisher) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. 25 °C வெப்பநிலையில் பராமரிக்கப்பட்ட 3 µm, 100 × 4.6 mm நிரலில் (Inspire C8, Dikma) 5 µl மாதிரி உட்செலுத்தப்பட்டது. LC-க்கான நகரும் கட்டங்கள் A (நீர், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் B (அசிட்டோநைட்ரைல், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம்) ஆகும். LC சாய்வு பின்வருமாறு இருந்தது: 1 நிமிடத்திற்கு 5% B, பின்னர் 11 நிமிடங்களில் 100% B ஆக அதிகரிக்கப்பட்டது. 100% நிலையில் 8 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, நிரலை 4 நிமிடங்களுக்கு 5% B-இல் மீண்டும் சமநிலைப்படுத்தவும். பாய்வு விகிதம் 0.3 ml min-1 ஆக இருந்தது. MS மூலத்தில் அயனியாக்கம், நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறை முறைகளில் சூடேற்றப்பட்ட எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மூலம் நிறைவேற்றப்படுகிறது.
நிறை நிறமாலைமானி, முழு MS பயன்முறையில் 60,000 பிரிதிறனில் 350 முதல் 680 வரையிலான m/z வரம்பில் தரவுகளை அளவிடுகிறது. [M + H]+ (அனைத்து இலக்குகள்), [M - H2O + H]+ (அனைத்து இலக்குகள்), மற்றும் [M - H]- (பாஸ்போரிலேட்டட் இலக்குகள்) ஆகியவற்றின் மீது MS/MS தரவுகள் பெறப்பட்டன. தரநிலை கிடைக்காத இலக்குகளின் எக்டைசோன் பண்புகளை உறுதிப்படுத்த MS/MS தரவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. இலக்கு அல்லாத எக்டிஸ்டீராய்டுகளை அடையாளம் காண, >15% சார்பு மிகுதியுடன் கூடிய அனைத்து HPLC சிகரங்களின் MS/MS தரவுகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. ஒரு ஆணில் காணப்படும் அளவுகளுக்கு அவற்றின் சமத்துவத்தைக் கணக்கிட, ஒரு குறிப்பிட்ட மாதிரியின் (மற்ற அனைத்து இலக்குகள்) முழுமையான அளவுகள் அல்லது நீர்த்தல்களைக் கணக்கிட, தூய தரநிலைகளிலிருந்து (20E, 3D20E) உருவாக்கப்பட்ட தரநிலை வளைவுகளைப் பயன்படுத்தி அளவிடவும். 3D20E-க்கு, பின்வரும் கூட்டுச் சேர்மங்களின் கூட்டுத்தொகையைப் பயன்படுத்தி அளவீடு செய்யப்பட்டது: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. தரவுகள் ட்ரேஸ்ஃபைண்டர் (பதிப்பு 4.1) பயன்படுத்திப் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு அளவிடப்பட்டன. MS/MS தரவுகள் எக்ஸ்கேலிபர் (பதிப்பு 4.4) பயன்படுத்திப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. E, 20E மற்றும் 3D20E ஆகியவற்றின் MS நிறமாலைகள் அந்தந்தத் தரநிலைகளுடன் ஒப்பிடப்பட்டன. 3D20E22P, ஜிரார்டின் வினைப்பொருளுடன் வழிமுறைப்படுத்தல் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. 20E22P, m/z விகிதத்தின் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
3D20E22P, MAG-இலிருந்து தூய்மைப்படுத்தப்பட்டது. HPLC-MS/MS பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட அதே LC நிபந்தனைகளின் கீழ், குவாட்ரூபோல் நிறை அடிப்படையிலான உணரியுடன் (QDa, Acquity, Waters) கூடிய அதி-செயல்திறன் திரவ நிறப்பகுப்பாய்வியைப் (Acquity, Waters) பயன்படுத்தி, பகுப்பாய்வு அளவில் தூய்மைப்படுத்தல் மேற்கொள்ளப்பட்டது. முன்னர் தீர்மானிக்கப்பட்ட அதே தக்கவைப்பு நேரத்தில், 3D20E22P-க்குரிய m/z கண்டறியப்பட்டபோது, ​​பின்னச் சேகரிப்பு தொடங்கப்பட்டது. பின்னர், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட சேர்மங்களின் தூய்மையானது, மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி HPLC-MS/MS மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களைப் பின்பற்றி, TRI ரியேஜென்ட்டை (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி 10-12 இனப்பெருக்க திசுக்கள் அல்லது உடலின் மற்ற பாகங்களிலிருந்து (தலையற்ற) மொத்த ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. ஆர்.என்.ஏ, TURBO DNase (தெர்மோ ஃபிஷர்) கொண்டு பதப்படுத்தப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களைப் பின்பற்றி, மோலோனி மரைன் லுகேமியா வைரஸ் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் (M-MLV RT; தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி சி.டி.என்.ஏ தொகுக்கப்பட்டது. ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் குவாண்டிடேட்டிவ் பி.சி.ஆருக்கான (RT-qPCR; விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2) பிரைமர்கள் முன்னர் வெளியிடப்பட்டவை²⁴ அல்லது பிரைமர்-பிளாஸ்ட்²⁶-ஐப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டவை. இதில் 70-150 bp அளவுள்ள மற்றும் எக்ஸான்-எக்ஸான் சந்திப்புகளை உள்ளடக்கிய அல்லது எக்ஸான்களைப் பிரிக்கும் பிரைமர் ஜோடி பிரைமர்களைக் கொண்ட தயாரிப்புகளுக்கு முன்னுரிமை அளிக்கப்பட்டது. RT-qPCR-க்காக, மூன்று முதல் நான்கு உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட சி.டி.என்.ஏ மாதிரிகள் தண்ணீரில் நான்கு மடங்கு நீர்க்கப்பட்டன. 1× பவர்அப் SYBR கிரீன் மாஸ்டர் மிக்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர்), பிரைமர்கள் மற்றும் 5 µl நீர்க்கப்பட்ட கரைசல் ஆகியவற்றைக் கொண்ட 15 µl பிரதி வினைகளில் அளவு நிர்ணயம் செய்யப்பட்டது. cDNA. வினைகள் குவாண்ட்ஸ்டுடியோ 6 ப்ரோ நிகழ்நேர PCR அமைப்பில் (தெர்மோ ஃபிஷர்) நடத்தப்பட்டன, மேலும் தரவுகள் வடிவமைப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு (பதிப்பு 2.4.3) மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி சேகரிக்கப்பட்டு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. இந்த ஆய்வில் நிரூபிக்கப்பட்டபடி, சார்பு அளவுகள் ரைபோசோமல் மரபணுவான RpL19 (AGAP004422) உடன் இயல்பாக்கப்பட்டன, இதன் வெளிப்பாடு இரத்த உணவு 27 அல்லது இனச்சேர்க்கை 3 மூலம் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மாறவில்லை.
ஆர்.என்.ஏ-வின் தரம், அஜிலென்ட் பயோஅனலைசர் 2100 பயோஅனலைசர் (அஜிலென்ட்) பயன்படுத்தி சரிபார்க்கப்பட்டது. இல்லுமினா இணை-முனை நூலகங்கள் தயாரிக்கப்பட்டு, எம்.ஐ.டி மற்றும் ஹார்வர்டின் பிராட் நிறுவனத்தில் இயக்கப்பட்டன. வரிசைப்படுத்தல் வாசிப்புகள், இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் HISAT2 (பதிப்பு 2.0.5) பயன்படுத்தி, ஏ. காம்பியே மரபணுத்தொகுதியுடன் (PEST திரிபு, பதிப்பு 4.12) சீரமைக்கப்பட்டன. மேப்பிங் தர (MAPQ) மதிப்பெண்கள் <30 கொண்ட வாசிப்புகள், சாம்டூல்ஸ் (பதிப்பு 1.3.1) பயன்படுத்தி நீக்கப்பட்டன. மரபணுக்களுடன் மேப் செய்யப்பட்ட வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கை, இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் htseq-count (பதிப்பு 0.9.1) பயன்படுத்தி எண்ணப்பட்டது. இயல்பாக்கப்பட்ட வாசிப்பு எண்ணிக்கைகள் கணக்கிடப்பட்டு, வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு, R (பதிப்பு 4.0.3)-இல் உள்ள DESeq2 தொகுப்பு (பதிப்பு 1.28.1) பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
எக்டைசோன்-மாற்றியமைக்கும் மரபணு வேட்பாளர்கள், முதலில் A. gambiae மரபணுத்தொகுதியை PSI-BLAST வழிமுறையைப் (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) பயன்படுத்தித் தேடுவதன் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்டனர். இதற்காக, இயல்புநிலை மதிப்பு அளவுருக்கள் மற்றும் பின்வரும் வினவல் புரத வரிசைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன: Bombyx mori (அணுகல் எண். NP_001038956.1), Musca domestica (அணுகல் எண். XP_005182020.1, XP_005175332.1 மற்றும் XP_011294434.1) மற்றும் Microplitis demolitor (அணுகல் எண். XP_008552646.1 மற்றும் XP_008552645.1) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்ட EcK, B. mori (அணுகல் எண். NP_001036900) மற்றும் Drosophila melanogaster (அணுகல் எண்.) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்ட EcK. NP_651202), Apis mellifera (அணுகல் எண். XP_394838) மற்றும் Acyrthosiphon pisum (அணுகல் எண். XP_001947166); மற்றும் B. mori (அணுகல் எண். XP_001947166) இலிருந்து EPP (NP_001177919.1 மற்றும் NP_001243996.1) மற்றும் D. melanogaster (அணுகல் எண். NP_572986.1) இன் EO (படி 1). அடுத்து, காம்பியாவில் உள்ள இனப்பெருக்க திசுக்களில் (பெண் LRT அல்லது MAG) அதிக mRNA வெளிப்பாட்டின் (ஒரு மில்லியன் மேப் செய்யப்பட்ட ரீட்களுக்கு >100 துண்டுகள்/கிலோபேஸ் எக்ஸான்கள் (FPKM) அல்லது >85%) அடிப்படையில் பொருத்தங்களை வடிகட்டவும் (படி 2). குறிப்பிட்ட தன்மையை மேம்படுத்துவதற்காக, இனச்சேர்க்கையின் போது எக்டைசோனை ஒருங்கிணைக்கவோ அல்லது மாற்றவோ செய்யாத ஒரு அனோபிலிஸ் இனமான A. albimanus-இன் இனப்பெருக்க திசுக்களிலும் வெளிப்படுத்தப்படும் சாத்தியமான நொதிகளை நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம். A. albimanus இனப்பெருக்க திசுக்களில் குறைந்த வெளிப்பாட்டின் (<100 FPKM அல்லது <85வது சதவிகிதம்) அடிப்படையில் சாத்தியமான மரபணுக்கள் வடிகட்டப்பட்டன (படி 3). ஒரு இறுதி வடிகட்டியாக (படி 4), சாத்தியமான மரபணுக்கள் பின்வருவனவற்றில் குறைந்தபட்சம் ஒன்றை பூர்த்தி செய்ய வேண்டும்: (1) வேறுபட்ட வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களின் பகுப்பாய்வின்படி இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு குறிப்பிடத்தக்க அளவு அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்படுதல் (P < 0.05) மற்றும் (2) இனப்பெருக்கம் அல்லாத திசுக்களில் (< 85 % அல்லது <100 FPKM).
முழு உயிரின ஐசோடோபிக் குறியீட்டை அடைவதற்காக, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறைகளை 28,29,30 நாங்கள் மாற்றியமைத்தோம். சுருக்கமாக, காட்டு வகை சாக்ரோமைசஸ் செரிவிசியே வகை II (YSC2, சிக்மா) ஆனது, (எடை/கனஅளவு) 2% குளுக்கோஸ் (G7528, சிக்மா), 1.7% அமினோ அமிலம் இல்லாத மற்றும் அம்மோனியம் சல்பேட் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஈஸ்ட் நைட்ரஜன் அடித்தளத்தில் (BD டிஃப்கோ, DF0335) சோதிக்கப்பட்டது. வளர்ப்பு ஊடகத்தில் நைட்ரஜனின் ஒரே மூலமாக 5% 15N அம்மோனியம் சல்பேட் (NLM-713, >99%, கேம்பிரிட்ஜ் ஐசோடோப் ஆய்வகங்கள்) பயன்படுத்தப்பட்டது. மையவிலக்கு மூலம் ஈஸ்ட் மீட்கப்பட்டது மற்றும் கொசுப்புழுக்கள் கூட்டுப்புழு பருவத்தை அடையும் வரை தாராளமாக உணவளிக்கப்பட்டன. நான்காம் நிலை இறப்பைத் தடுக்க மீன் மாவு (300 புழுக்களுக்கு 0.5 மி.கி) கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது. இனப்பெருக்கத்தின் போது மாற்றப்பட்ட ஆண் புரோட்டியோமை பகுப்பாய்வு செய்ய, குறியிடப்படாத ஆண்களுடன் இனப்பெருக்க சோதனைகளில் பெண் கொசுக்கள் மட்டுமே பயன்படுத்தப்பட்டன.
4-6 நாள் வயதுடைய, 15N-குறியிடப்பட்ட கன்னிப் பெண் உயிரிகள், அதே வயதுடைய, குறியிடப்படாத கன்னி ஆண் உயிரிகளுடன் கட்டாயமாக இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்டன. எபிஃப்ளூரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியின் கீழ் இனச்சேர்க்கை அடைப்புகளைக் கண்டறிவதன் மூலம் வெற்றிகரமான இனச்சேர்க்கை சரிபார்க்கப்பட்டது. 3, 12, மற்றும் 24 மணி நேரத்தில், இனச்சேர்க்கை செய்த 45-55 பெண் உயிரிகளின் இதய அறைகள் 50 µl அம்மோனியம் பைகார்பனேட் தாங்கல் கரைசலில் (pH 7.8) பிரிக்கப்பட்டு, உலக்கையால் கூழாக்கப்பட்டது. அந்தக் கூழ் மையவிலக்கிக்கு உட்படுத்தப்பட்டு, அதன் மேல்தேங்கிய திரவத்துடன் 50 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட்டில் உள்ள 50 µl 0.1% ராபிஜெஸ்ட் (186001860, வாட்டர்ஸ்) கலக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு மாதிரியிலிருந்தும் பெறப்பட்ட மேல்தேங்கிய திரவமும் வீழ்படிவும் உலர் பனிக்கட்டியில் உடனடியாக உறையவைக்கப்பட்டு, வாஷிங்டன் பல்கலைக்கழகத்தில் உள்ள மேக்காஸ் ஆய்வகத்திற்கு ஒரே இரவில் அனுப்பப்பட்டன. அங்கு LC-MS/MS-க்கான மாதிரி தயாரிப்புப் பணிகள் முடிக்கப்பட்டன. வீழ்படிவை 50 µl 0.1% ராபிஜெஸ்ட்டில் மீண்டும் கரைக்கவும். 50 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட்டில் கரைத்து, நீர்த் தொட்டியில் சோனிகேட் செய்யப்பட்டது. வீழ்படிவு மற்றும் மேல்கரைசலின் புரதச் செறிவு BCA மதிப்பீட்டின் மூலம் அளவிடப்பட்டது. மாதிரிகள் 5 mM டைதியோதிரெயிட்டால் (DTT; சிக்மா) கொண்டு ஒடுக்கப்பட்டு, 15 mM அயோடோஅசிட்டமைடு (சிக்மா) கொண்டு ஆல்கைலேட் செய்யப்பட்டு, டிரிப்சினைசேஷன் (டிரிப்சின்: அடிமூலக்கூறு விகிதம் 1:0:50) உடன் 37 °C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. 200 mM HCl சேர்ப்பதன் மூலம் ராபிஜெஸ்ட் சிதைக்கப்பட்டது. அதனைத் தொடர்ந்து, சிதைவுகளை அகற்ற 37 °C வெப்பநிலையில் 45 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, 4 °C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 14,000 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கம் செய்யப்பட்டது. மாதிரிகள் இரட்டை-முறை திட-கட்ட பிரித்தெடுத்தல் (ஓயாசிஸ் MCX கார்ட்ரிட்ஜ்கள், வாட்டர்ஸ்) மூலம் கழுவப்பட்டு, 0.33 µg µl-1 என்ற இறுதி புரதச் செறிவுக்காக 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டன. குறியிடப்படாத MAG புரோட்டியோம்களும் இதேபோல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. கன்னி ஆண் உயிரிகளிடமிருந்து பெறப்பட்டது. ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் இரண்டு பகுப்பாய்வு பிரதிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. அடுத்து, ஜூபிடர் C12 ரிவர்ஸ்டு-ஃபேஸ் ரெசின் (ஃபெனோமெனெக்ஸ்) நிரப்பப்பட்ட 4-செ.மீ. காசில்1 (PQ) ஃபிரிட் ட்ராப்புடன் கூடிய 25-செ.மீ. ஃபியூஸ்டு சிலிக்கா 75-μm நிரல் மற்றும் 180 நிமிட திரவ நிறப்பிரிகை ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, ஒவ்வொன்றிலிருந்தும் 1 µg பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. மாதிரி செரிமானங்கள் – MS/MS ஆனது Q-Exactive HF மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (தெர்மோ ஃபிஷர்) nanoACQUITY UPLC அமைப்புடன் (வாட்டர்ஸ்) இயக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு இயக்கத்திற்கும் உருவாக்கப்பட்ட தரவு தொடர்பான கையகப்படுத்தல் தரவுகள், Proteowizard (பதிப்பு 3.0.20287) மற்றும் Comet31 (பதிப்பு 3.2) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி mzML வடிவத்திற்கு மாற்றப்பட்டன. இந்த மாற்றங்கள், Anopheles gambiae (VectorBase பதிப்பு 54), Anopheles coluzzi ஆகியவற்றின் புரத வரிசைகளைக் கொண்ட FASTA தரவுத்தளத்திற்கு எதிராக மேற்கொள்ளப்பட்டன. Mali-NIH (VectorBase பதிப்பு 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, மார்ச் 2021), A. gambiae RNA-seq, மற்றும் அறியப்பட்ட மனித மாசுபடுத்திகளின் மூன்று-சட்டக மொழிபெயர்ப்புகள் ஆகியவற்றிலும் ஒரு தேடல் செய்யப்பட்டது. பெப்டைட் வரைபடத்துடன் பொருந்தக்கூடிய FDR-கள் Percolator32 (பதிப்பு 3.05) ஐப் பயன்படுத்தி 0.01 என்ற வரம்புடன் தீர்மானிக்கப்பட்டன, மேலும் பெப்டைடுகள் புரத சிக்கன முறையைப் பயன்படுத்தி புரத அடையாளங்களாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டன. லைம்லைட்33 (பதிப்பு 2.2.0). முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, ஒவ்வொரு ஓட்டத்திலும் ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் கணக்கிடப்பட்ட இயல்பாக்கப்பட்ட நிறமாலை மிகுதிக் காரணியைப் (NSAF) பயன்படுத்தி சார்பு புரத மிகுதி மதிப்பிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் சார்பான NSAF, இரண்டு வெவ்வேறு உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் சராசரியாகக் கணக்கிடப்பட்டது. 15N குறியிடல் பெண் புரோட்டியோமை வெற்றிகரமாக மறைத்தது, இருப்பினும் குறியிடப்பட்ட கன்னிகளிடமிருந்து ஒரு சிறிய அளவு குறியிடப்படாத புரதத்தைக் கண்டறிய முடிந்தது. தொழில்நுட்ப ஓட்டங்களில் மட்டுமே பெண் மூல மாதிரிகளில் ஆண் புரதக் குறைப்பு (1-5 நிறமாலைகள்) கண்டறியப்பட்டதை நாங்கள் பதிவுசெய்தோம்; இந்த ஓட்டங்களில், ஆண்/இனச்சேர்க்கை மாதிரிகளுக்குப் பிறகு மூல மாதிரிகள் ஓட்டப்பட்டன, இது HPLC "தொடர்ச்சி"யின் விளைவாக ஏற்பட்டது. குறியிடப்பட்ட கன்னிகளிடமிருந்து 'மாசுக்களாக' அவ்வப்போது கண்டறியப்பட்ட புரதங்கள் துணை அட்டவணை 1-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.
ஜென்ஸ்கிரிப்ட்டில் உள்ள QTTDRVAPAPDQQQ (ஐசோடைப் PA-க்குள்) மற்றும் MESDGTTPSGDSEQ (ஐசோடைப் PA மற்றும் PB-க்குள்) ஆகிய இரண்டு ஆன்டிஜெனிக் பெப்டைடுகள் இணைக்கப்பட்டு, பின்னர் KLH என்ற கேரியர் புரதத்துடன் பிணைக்கப்பட்டு நியூசிலாந்து முயல்களுக்குள் செலுத்தப்பட்டன. நான்காவது ஊசிக்குப் பிறகு முயல்கள் பலியிடப்பட்டு, பிணைப்பு சுத்திகரிப்பு மூலம் மொத்த IgG பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. EPP-க்கு மிகவும் குறிப்பிட்ட முயலிலிருந்து பெறப்பட்ட IgG, மேலதிக வெஸ்டர்ன் பிளாட்டிங்கிற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
வெஸ்டர்ன் பிளாட்டுகளுக்காக, 4-நாள் வயதுடைய கன்னி ஆண் கொசுக்கள் மற்றும் கன்னி அல்லது வலுக்கட்டாயமாக இணைக்கப்பட்ட பெண் கொசுக்களிடமிருந்து (இணைந்த பிறகு <10 நாட்கள்) பெறப்பட்ட MAG (n = 10, இங்கு n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுதந்திரமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது) மற்றும் பெண் LRT (n = 30) புரதப் பிரித்தெடுப்பு இடையகக் கரைசல் (50 mM டிரிஸ், pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% சோடியம் டியோக்ஸிகோலேட்; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× புரோட்டியேஸ் தடுப்பான் கலவை (ரோச்)) தனித்தனியாகச் சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரிகள் துண்டாக்கப்பட்ட உடனேயே ஒரு பீடர் (2 மிமீ கண்ணாடி மணிகள், 2,400 rpm, 90 விநாடிகள்) கொண்டு கூழாக்கப்பட்டது. கரையாத சிதைவுகள் 4 °C வெப்பநிலையில் 20,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்வதன் மூலம் அகற்றப்பட்டன. புரதங்கள் பிராட்போர்டு மதிப்பீடு (பயோ-ராட்) மூலம் அளவிடப்பட்டன. பின்னர், 20 µg MAG புரதம், 40 µg LRT புரதம், மற்றும் 20 µg பெண் கொசுக்கள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. மீதமுள்ள மொத்தப் புரதத்தின் µg அளவு, MOPS பஃபரைப் பயன்படுத்தி 10% பிஸ்-டிரிஸ் நியூபேஜ் (Bis-Tris NuPAGE) மூலம் சிதைக்கப்பட்டுப் பிரிக்கப்பட்டது. iBlot2 பரிமாற்ற அமைப்பைப் (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி, புரதங்கள் பாலிவினைலிடீன் ஃபுளோரைடு சவ்வுகளுக்கு மாற்றப்பட்டன. சவ்வுகள் 1× PBS-T (PBS-இல் 0.1% ட்வீன்-20) கரைசலில் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் 22°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரத்திற்கு ஒடிஸி தடுப்பு பஃபரில் (Li-Cor) தடுக்கப்பட்டன. சவ்வுகள், தனிப்பயனாக்கப்பட்ட முயல் ஆன்டி-EPP பாலிக்குளோனல் முதன்மை ஆன்டிபாடி (தடுப்பு பஃபரில் 1:700) மற்றும் எலி ஆன்டி-ஆக்டின் மோனோக்குளோனல் முதன்மை ஆன்டிபாடி MAC237 (அபீம்; 1:4,000) ஆகியவற்றுடன் 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் குலுக்கப்பட்டன. சவ்வுகள் PBS-T கொண்டு கழுவப்பட்டு, பின்னர் தடுப்பு பஃபரில் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளுடன் (கழுதை ஆன்டி-முயல் 800CW மற்றும் வெள்ளாடு ஆன்டி-எலி 680LT (Li-Cor), இரண்டும் 1:20,000) அடைகாக்கப்பட்டன. 0.01% SDS மற்றும் 0.2% ட்வீன் -20 கொண்ட கரைசலில் 22 °C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் வைக்கப்பட்டது. சவ்வுகள் PBS-T கொண்டு கழுவப்பட்டு, ஒடிஸி CLx ஸ்கேனர் மூலம் படமெடுக்கப்பட்டன. படங்கள் இமேஜ் ஸ்டுடியோவில் (பதிப்பு 5.2) சேகரிக்கப்பட்டு செயலாக்கப்பட்டன. EPP-RA ஐசோஃபார்மிற்கு (82 kDa) உரிய ஒரு குறிப்பிட்ட பட்டை கண்டறியப்படவில்லை.
ஹிஸ்டிடின் பாஸ்படேஸ் டொமைனைக் கொண்ட AGAP002463-RB ஐசோஃபார்மாகிய EPP (NCBI பாதுகாக்கப்பட்ட டொமைன் தேடல் 34) மற்றும் EcK2 (AGAP002181) ஆகியவற்றின் குறியீட்டுப் பகுதிகள் pET-21a(+) பிளாஸ்மிட்டில் (Novagen Millipore Sigma) குளோன் செய்யப்பட்டன; பிரைமர்கள் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. pET-21a(+)-EcK2 கட்டமைப்பின் C-முனை 6xHis குறிச்சொல்லுக்கு முன்பு எட்டு GS4 இணைப்பிகள் (தொடர்ச்சியாக) செருகப்பட்டன. NEBExpress செல்-சாரா E. coli புரதத் தொகுப்பு வினையைப் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலேப்ஸ்) பயன்படுத்தி மறுசேர்க்கைப் புரதங்கள் உருவாக்கப்பட்டன. NEBExpress Ni ஸ்பின் காலம்களைப் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலேப்ஸ்) பயன்படுத்தி மறுசேர்க்கைப் புரதங்கள் தூய்மைப்படுத்தப்பட்டன. NEBExpress செல்-சாரா E. coli புரதத் தொகுப்பு கிட்-டிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎன்ஏ வார்ப்புருவைப் பயன்படுத்தி டைஹைட்ரோஃபோலேட் ரிடக்டேஸ் (DHFR) கட்டுப்பாட்டுப் புரதம் உருவாக்கப்பட்டது. புரதங்கள் 3 மாதங்கள் வரை PBS-இல் 50% கிளிசரினில் -20 °C-இல் சேமிக்கப்பட்டன.
4-நைட்ரோபினைல் பாஸ்பேட்டை (pNPP; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) பயன்படுத்தி EPP மற்றும் திசுச் சாறுகளின் பாஸ்பேடேஸ் செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது. வினைக்கலவையில் 25 mM டிரிஸ், 50 mM அசிட்டிக் அமிலம், 25 mM பிஸ்-டிரிஸ், 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA மற்றும் 1 mM DTT ஆகியவை இருந்தன. திசுவானது வினைக்கலவையில் கூழாக்கப்பட்டு, மையவிலக்கு மூலம் செல் சிதைவுகள் அகற்றப்பட்டன. 2.5 mg ml-1 pNPP கொண்ட வினைக்கலவையில் நொதி அல்லது திசுச் சாற்றைச் சேர்ப்பதன் மூலம் வினையைத் தொடங்கவும். வினைக்கலவையானது அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் அடைகாக்கப்பட்டு, பல்வேறு நேரங்களில் 405 nm-ல் உள்ள உறிஞ்சுதிறனை அளவிடுவதன் மூலம் pNPP-யிலிருந்து மாற்றப்பட்ட pNP-யின் அளவு கணக்கிடப்பட்டது.
இன் விட்ரோ EcK செயல்பாட்டிற்காக, புரதமானது 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP மற்றும் 10 mM MgCl2 ஆகியவற்றைக் கொண்ட 200 µl தாங்கல் கரைசலில் (pH 7.5) 0.2 mg 20E அல்லது 3D20E உடன் 27 °C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. 800 µl மெத்தனால் சேர்ப்பதன் மூலம் வினை நிறுத்தப்பட்டது, பின்னர் 1 மணி நேரத்திற்கு -20 °C வெப்பநிலையில் குளிர்விக்கப்பட்டது, பிறகு 4 °C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 20,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கம் செய்யப்பட்டது. பின்னர் மேல்கரைசல் HPLC-MS/MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் பயன்படுத்தப்பட்ட புரதங்களை வெப்பத்தால் செயலிழக்கச் செய்ய, அந்தப் புரதங்கள் PBS-இல் உள்ள 50% கிளிசரினில் 95°C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன.
இன் விட்ரோ EPP செயல்பாட்டிற்காக, புரதமானது 25 mM டிரிஸ், 50 mM அசிட்டிக் அமிலம், 25 mM பிஸ்-டிரிஸ், 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, மற்றும் 1 mM DTT ஆகியவற்றைக் கொண்ட 100 µl தாங்கல் கரைசலில் (pH 7.5), 3D20E22P (HPLC-MS/MS மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்ட 18 ஜோடி MAG-களில் காணப்படும் அளவிற்கு சமமானது) உடன் 27 °C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. 400 µl மெத்தனால் சேர்ப்பதன் மூலம் வினை நிறுத்தப்பட்டு, -20 °C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் குளிர்விக்கப்பட்டது, பின்னர் 4 °C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 20,000 g வேகத்தில் மையவிலக்கம் செய்யப்பட்டது. மேல்கரைசல் HPLC-MS/MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
கலப்புப் பாலின தலையற்ற கொசு சடலங்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட cDNA-விலிருந்து EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) மற்றும் EcK2 (556 bp) ஆகியவற்றிற்கான PCR துண்டுகள் பெருக்கப்பட்டன. eGFP கட்டுப்பாட்டின் (495 bp) PCR துண்டு, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட pCR2.1-eGFP-யிலிருந்து பெருக்கப்பட்டது; PCR பிரைமர்கள் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. PCR துண்டானது pL4440 பிளாஸ்மிடில் உள்ள தலைகீழ் T7 புரோமோட்டர்களுக்கு இடையில் செருகப்பட்டது. பிளாஸ்மிட் கட்டமைப்புகள் NEB 5-α திறன் கொண்ட E. coli (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) இலிருந்து மீட்கப்பட்டு, பயன்பாட்டிற்கு முன் DNA வரிசைப்படுத்தல் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டன (செருகப்பட்ட வரிசைக்கு துணைத் தரவு 1-ஐப் பார்க்கவும்). T7 புரோமோட்டருடன் பொருந்தக்கூடிய பிரைமர்கள் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2), pL4440-அடிப்படையிலான பிளாஸ்மிடிலிருந்து செருகலைப் பெருக்குவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன. PCR விளைபொருளின் அளவு அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோஃபோரசிஸ் மூலம் உறுதி செய்யப்பட்டது. மெகாஸ்கிரிப்ட் T7 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கிட் (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி PCR டெம்ப்ளேட்டுகளிலிருந்து dsRNA படியெடுக்கப்பட்டு, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட மாற்றங்களுடன் உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி சுத்திகரிக்கப்பட்டது.
dsRNA ஊசி செலுத்துதலுக்காக, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ஆனது, கூட்டுப்புழுவிலிருந்து வெளிவந்த 1 நாளுக்குள், வயதுவந்த ஆண் அல்லது பெண் பூச்சிகளின் மார்புப் பகுதிக்குள் 10 ng nl-1 என்ற செறிவில் செலுத்தப்பட்டது (Nanoject III, Drummond). மரபணு செயலிழப்பு அளவுகள், RNA பிரித்தெடுத்தல், cDNA தொகுப்பு மற்றும் RT-qPCR ஆகியவற்றின் மூலம் குறைந்தது மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் தீர்மானிக்கப்பட்டன. எக்டைசோன் ஊசி செலுத்துதலுக்காக, 4-நாள் வயதுடைய கன்னிப் பூச்சி அல்லது 6-நாள் வயதுடைய கன்னிப் பூச்சிக்கு இரத்தம் குடித்த பூச்சிக்கு, பரிசோதனை வடிவமைப்பைப் பொறுத்து முறையே 1.3, 2.1 அல்லது 6.3 ng nl-1 என்ற செறிவுகளில் 0.13, 0.21, அல்லது 0.63 µg 20E அல்லது 3D20E (Nanoject III, Drummond) செலுத்தப்பட்டது. 10% (vol/vol) எத்தனாலின் 100 nl-ஐ ஊசி மூலம் செலுத்தவும். தண்ணீர்; 10% எத்தனாலில் 100 நானோலிட்டர் 3D20E22P (ஒரு ஜோடி MAG-களில் காணப்படும் அளவில் 75% க்குச் சமமானது). கொசுக்கள் சீரற்ற முறையில் ஊசி செலுத்தும் குழுவிற்கு ஒதுக்கப்பட்டன.
முட்டையிடும் சோதனைகளுக்காக, 3-நாள் வயதுடைய பெண் கொசுக்களுக்கு மனித இரத்தம் தாராளமாகக் கொடுக்கப்பட்டது. பாதியளவு உணவு உண்ட அல்லது உண்ணாத கொசுக்களை அகற்றவும். மேற்கொள்ளப்பட்ட சிகிச்சையைப் பொறுத்து, இரத்த உணவுக்குப் பிறகு குறைந்தது 48 மணிநேரம் கழித்து, பெண் கொசுக்கள் நான்கு இரவுகளுக்குத் தனித்தனி முட்டையிடும் கோப்பைகளில் வைக்கப்பட்டன. முட்டைகள் ஒரு ஸ்டீரியோஸ்கோப்பின் (Stemi 508, Zeiss) கீழ் எண்ணப்பட்டன; இணை சேர்ந்த பெண் கொசுக்களில், புழுக்களாகப் பொரித்த முட்டைகள் கருவுற்றவையாகக் கருதப்பட்டன.
இனப்பெருக்கச் சோதனைகளுக்காக, பெண் உயிரிகள் இனப்பெருக்கத்திற்கு எதிர்ப்புத்திறனை வளர்த்துக்கொள்ள, அளிக்கப்பட்ட சிகிச்சையைப் பொறுத்து குறைந்தது 2 நாட்கள் அனுமதிக்கப்பட்டன. பின்னர், அதே வயதுடைய இயல்புவகை ஆண் உயிரிகள் அதே கூண்டில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன. இரண்டு இரவுகள் கழித்து, பெண் உயிரிகளின் கருவுற்ற குமிழ்கள் பிரிக்கப்பட்டு, 10 mM டிரிஸ்-HCl, 1 mM EDTA, மற்றும் 25 mM NaCl (pH 8.2) கொண்ட ஒரு தாங்கல் கரைசலில், உறைதல்-உருகுதல் மற்றும் மீயொலி அலைகள் மூலம் மரபணு டி.என்.ஏ வெளியிடப்பட்டது. மாதிரிகள் 55 °C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கும், அதைத் தொடர்ந்து 95 °C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கும் புரோட்டினேஸ் K (0.86 µg µl-1) உடன் அடைகாக்கப்பட்டன. பதப்படுத்தப்படாத மரபணு டி.என்.ஏ தயாரிப்புகள் 10 மடங்கு நீர்க்கப்பட்டு, Y குரோமோசோம் வரிசைகளைக் கண்டறிய qPCR முறைக்கு உட்படுத்தப்பட்டன; தொடக்கிகள் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. Y குரோமோசோம் வரிசை இல்லாதது இனப்பெருக்கம் நடைபெறவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.
மறு-இனச்சேர்க்கை சோதனைகளுக்காக, வலுக்கட்டாயமாக இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண் உயிரிகள், இனச்சேர்க்கை நிலையை உறுதிப்படுத்த இனச்சேர்க்கை அடைப்பான்கள் உள்ளதா எனப் பரிசோதிக்கப்பட்டன. மேலும், முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி 36, ஆண் உயிரிகள் இல்லாத நிலையில் இனச்சேர்க்கைக்கு எதிர்ப்புத்தன்மையை வளர்த்துக்கொள்ள 2 நாட்கள் அனுமதிக்கப்பட்டன. பின்னர், DsRed மரபணு மாற்றப்பட்ட விந்தணுக்களைக் கொண்ட ஆண் உயிரிகள் பெண் உயிரிகளின் கூண்டுகளில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன. இரண்டு இரவுகள் கழித்து, பெண் உயிரிகளிடமிருந்து கருவுறுதல் குமிழ்கள் பிரிக்கப்பட்டு, மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி மரபணு டி.என்.ஏ தயாரிக்கப்பட்டு, DsRed மரபணு மாற்றத்தைக் கண்டறிய qPCR சோதனைக்கு உட்படுத்தப்பட்டது; பிரைமர்கள் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. DsRed மரபணு மாற்றம் இல்லாதது, மறு-இனச்சேர்க்கை எதுவும் நடைபெறவில்லை என்பதைக் குறித்தது.
3D20E முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி தயாரிக்கப்பட்டது 37. சுருக்கமாக, 10 மி.கி 20E (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) 10 மி.லி தண்ணீரில் கரைக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 30 மி.கி பிளாட்டினம் பிளாக் (தூள் வடிவில், சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சேர்க்கப்பட்டது. வினைக்கலவையில் O2 வாயுவின் மென்மையான ஓட்டம் தொடர்ந்து குமிழாக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் கலக்கப்பட்டது. 6 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, வினையை நிறுத்த 30 மி.லி மெத்தனால் சேர்க்கப்பட்டது. வினையூக்கித் துகள்களை அகற்ற கலவை மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. மேல்தேங்கிய திரவம் அறை வெப்பநிலையில் வெற்றிடத்தில் உலரும் வரை ஆவியாக்கப்பட்டது. உலர்ந்த வினை விளைபொருள், HPLC-MS/MS பகுப்பாய்விற்காக 10% எத்தனால் மற்றும் ஊசி போடுவதற்கான மெத்தனாலில் கரைக்கப்பட்டது. மாற்ற விகிதம் (20E இலிருந்து 3D20E ஆக) தோராயமாக 97% ஆக இருந்தது (படம் 4b), மற்றும் தயாரிக்கப்பட்ட 3D20E இன் MS நிறமாலை, இணைந்த பெண் உயிரிகளில் காணப்பட்ட நிறமாலையுடன் பொருந்தியது (படம் 4c).
செய்யப்பட்ட புள்ளிவிவர சோதனைகளின் குறிப்பிட்ட விவரங்கள் விளக்கக்குறிப்பில் உள்ளன. ஃபிஷரின் துல்லிய சோதனை, மான்டெல்-காக்ஸ் சோதனை மற்றும் ஸ்டூடண்ட்ஸ் டி-சோதனை ஆகியவற்றைச் செய்ய கிராஃப்பேட் (பதிப்பு 9.0) பயன்படுத்தப்பட்டது. காக்ரன்-மான்டெல்-ஹேன்செல் சோதனைகள் ஒரு தனிப்பயன் R ஸ்கிரிப்டைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test இல் கிடைக்கிறது). தரவுப் பரவல், 0.05 என்ற முக்கியத்துவ வரம்புடன் ஷாபிரோ-வில்க் சோதனையைப் பயன்படுத்தி இயல்புநிலைக்குச் சோதிக்கப்பட்டது. தரவு இயல்புநிலை சோதனையில் தோல்வியுற்றபோது, ​​மான்-விட்னி சோதனை செய்யப்பட்டது. உயிர்வாழ்வுத் தரவு மான்டெல்-காக்ஸ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. RNA-seq மரபணு-நிலை வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டுப் பகுப்பாய்வைச் செய்ய DESeq2 தொகுப்பு (பதிப்பு 1.28.1) பயன்படுத்தப்பட்டது. வரைபடத்தில் உள்ள கிடைமட்டப் பட்டை இடைநிலையைக் குறிக்கிறது. அனைத்து சோதனைகளுக்கும் P = 0.05 என்ற முக்கியத்துவ மதிப்பு வரம்பாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
ஆய்வின் வடிவமைப்பு குறித்த கூடுதல் தகவல்களுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள நேச்சர் ரிசர்ச் ரிப்போர்ட் சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
MS புரோட்டியோமிக் தரவுகள், PXD032157 என்ற தரவுத்தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியுடன், PRIDE பார்ட்னர் ரெபாசிட்டரி (https://www.ebi.ac.uk/pride/) வழியாக புரோட்டியோம்எக்ஸ்சேஞ்ச் கூட்டமைப்பில் (http://proteomecentral.proteomexchange.org) பதிவேற்றப்பட்டன.
RNA-seq தரவுத்தொகுப்பு, GSE198665 என்ற தொடர் பதிவின் கீழ், மரபணு வெளிப்பாடு விரிவான நூலகத்தில் (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) சமர்ப்பிக்கப்பட்டுள்ளது.
தற்போதைய ஆய்வின் போது உருவாக்கப்பட்ட மற்றும்/அல்லது பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட கூடுதல் தரவுத்தொகுப்புகளை, நியாயமான கோரிக்கையின் பேரில் தொடர்புடைய ஆசிரியர்களிடமிருந்து பெறலாம். இந்தக் கட்டுரை மூலத் தரவை வழங்குகிறது.
டி லூஃப், ஏ. எக்டிஸ்டீராய்டுகள்: புறக்கணிக்கப்பட்ட பூச்சி பாலின ஸ்டீராய்டுகளா? ஆண்: மர்மப் பெட்டி. பூச்சி அறிவியல். 13, 325–338 (2006).
அனோபிலிஸ் ஸ்டீபன்ஸில் ரெட்ஃபெர்ன், CPF 20-ஹைட்ராக்ஸியெக்டைசோன் மற்றும் சூலக வளர்ச்சி. ஜே. இன்செக்ட் ஃபிசியாலஜி. 28, 97–109 (1982).