நோய் எதிர்ப்பு சக்தியை மாற்றியமைக்கும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் கட்டி நுண்ணுயிர்சூழலின் (TME) ஒரு முக்கிய அம்சமாகும், ஆனால் சில விதிவிலக்குகளைத் தவிர, அவற்றின் அடையாளங்கள் பெரும்பாலும் அறியப்படாமலேயே இருக்கின்றன. இங்கே, உயர் தர சீரஸ் கார்சினோமா (HGSC) நோயாளிகளின் கட்டிகள் மற்றும் வயிற்று நீர்க்கோவையிலிருந்து பெறப்பட்ட கட்டிகள் மற்றும் T செல்களைப் பகுப்பாய்வு செய்து, இந்த வெவ்வேறு TME பிரிவுகளின் வளர்சிதை மாற்றத் தொகுப்பை வெளிப்படுத்தினோம். வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி செல்கள் விரிவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளைக் கொண்டுள்ளன. வயிற்று நீர்க்கோவையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​கட்டிக்குள் ஊடுருவும் T செல்கள் 1-மெத்தில்நிகோடினமைடில் (MNA) குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிந்துள்ளன. T செல்களில் MNA-வின் அளவு உயர்ந்திருந்தாலும், நிகோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸின் (S-அடினோசில்மெத்தியோனினிலிருந்து மெத்தில் குழுக்களை நிகோடினமைடுக்கு மாற்றும் வினையை ஊக்குவிக்கும் ஒரு நொதி) வெளிப்பாடு ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் மற்றும் கட்டி செல்களுக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. செயல்பாட்டு ரீதியாக, MNA, கட்டி வளர்ச்சியை ஊக்குவிக்கும் சைட்டோகைனான டியூமர் நெக்ரோசிஸ் ஃபேக்டர் ஆல்ஃபாவைச் சுரக்க T செல்களைத் தூண்டுகிறது. எனவே, TME-யிலிருந்து பெறப்படும் MNA, T செல்களின் நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குமுறைக்கு பங்களிப்பதோடு, மனித புற்றுநோய்க்கான சிகிச்சையில் ஒரு சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்காகவும் விளங்குகிறது.
கட்டியிலிருந்து பெறப்படும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள், கட்டிக்கு எதிரான நோய் எதிர்ப்புச் சக்தியில் ஒரு ஆழமான தடுப்பு விளைவைக் கொண்டிருக்கலாம், மேலும் அவை நோய் முன்னேற்றத்திற்கான ஒரு முக்கிய உந்து சக்தியாகவும் செயல்படக்கூடும் என்பதை மேலும் மேலும் சான்றுகள் காட்டுகின்றன (1). வார்பர்க் விளைவுக்குக் கூடுதலாக, சமீபத்திய ஆய்வுகள் கட்டி செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற நிலையையும், கட்டி நுண்ணுயிரின் (TME) நோயெதிர்ப்பு நிலையுடனான அதன் தொடர்பையும் வகைப்படுத்தத் தொடங்கியுள்ளன. எலி மாதிரிகள் மற்றும் மனித T செல்கள் மீதான ஆய்வுகள், குளுட்டமைன் வளர்சிதை மாற்றம் (2), ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் (3) மற்றும் குளுக்கோஸ் வளர்சிதை மாற்றம் (4) ஆகியவை பல்வேறு நோயெதிர்ப்பு செல் துணைக்குழுக்களில் சுயாதீனமாக செயல்பட முடியும் என்பதைக் காட்டியுள்ளன. இந்த வழித்தடங்களில் உள்ள பல வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் T செல்களின் கட்டிக்கு எதிரான செயல்பாட்டைத் தடுக்கின்றன. டெட்ராஹைட்ரோபயோப்டெரின் (BH4) என்ற துணை நொதியைத் தடுப்பது T செல்களின் பெருக்கத்தைச் சேதப்படுத்தும் என்றும், உடலில் BH4 அதிகரிப்பது CD4 மற்றும் CD8 மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படும் கட்டிக்கு எதிரான நோயெதிர்ப்புப் பதிலை மேம்படுத்தும் என்றும் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. கூடுதலாக, கைனூரினின் நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு விளைவை BH4 வழங்குவதன் மூலம் மீட்க முடியும் (5). ஐசோசிட்ரேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (IDH) மரபணு மாற்றமடைந்த கிளியோபிளாஸ்டோமாவில், எனான்டியோமெட்டாபாலிக் (R)-2-ஹைட்ராக்ஸி குளூட்டரேட் (R-2-HG) சுரப்பு, T செல் செயல்படுத்தல், பெருக்கம் மற்றும் சைட்டோலிசிஸ் செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது (6). சமீபத்தில், கிளைகோலிசிஸின் ஒரு துணைப் பொருளான மெத்தில்கிளையாக்சல், மைலாய்டு தோற்றம் கொண்ட அடக்கி செல்களால் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது என்றும், மெத்தில்கிளையாக்சலை T செல்களுக்கு மாற்றுவது எஃபெக்டர் T செல் செயல்பாட்டைத் தடுக்க முடியும் என்றும் காட்டப்பட்டுள்ளது. சிகிச்சையில், மெத்தில்கிளையாக்சலை நடுநிலையாக்குவது மைலாய்டு-வழித்தோன்றல் அடக்கி செல்களின் (MDSC) செயல்பாட்டை முறியடித்து, எலி மாதிரிகளில் செக்பாயிண்ட் தடுப்பு சிகிச்சையை ஒருங்கிணைந்து மேம்படுத்தும் (7). இந்த ஆய்வுகள் கூட்டாக T செல் செயல்பாடு மற்றும் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதில் TME-வழித்தோன்றல் வளர்சிதை மாற்றங்களின் முக்கிய பங்கை வலியுறுத்துகின்றன.
கருப்பை புற்றுநோயில் டி செல் செயலிழப்பு பரவலாகப் பதிவாகியுள்ளது (8). இது ஓரளவு ஹைபோக்ஸியா மற்றும் அசாதாரண கட்டி இரத்த நாளங்களில் உள்ளார்ந்த வளர்சிதை மாற்ற பண்புகள் காரணமாகும் (9), இது குளுக்கோஸ் மற்றும் டிரிப்டோபானை லாக்டிக் அமிலம் மற்றும் கைனூரினின் போன்ற துணைப் பொருட்களாக மாற்றுகிறது. அதிகப்படியான புறச்செல் லாக்டேட் இன்டர்ஃபெரான்-γ (IFN-γ) உற்பத்தியைக் குறைத்து, மைலோசப்ரெசிவ் துணைக்குழுக்களின் வேறுபாட்டைத் தூண்டுகிறது (10, 11). டிரிப்டோபானின் நுகர்வு டி செல் பெருக்கத்தை நேரடியாகத் தடுக்கிறது மற்றும் டி செல் ஏற்பி சமிக்ஞையைத் தடுக்கிறது (12-14). இந்த அவதானிப்புகள் இருந்தபோதிலும், நோயெதிர்ப்பு வளர்சிதை மாற்றம் தொடர்பான பல ஆய்வுகள், உகந்த ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி இன் விட்ரோ டி செல் வளர்ப்பில் மேற்கொள்ளப்பட்டன, அல்லது இன் விவோவில் ஒத்த எலி மாதிரிகளுக்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டன, இவை இரண்டுமே மனித புற்றுநோய்கள் மற்றும் உடலியல் பேரளவு மற்றும் நுண்ணளவு சூழலின் பன்முகத்தன்மையை முழுமையாகப் பிரதிபலிக்கவில்லை.
கருப்பை புற்றுநோயின் ஒரு பொதுவான அம்சம் பெரிட்டோனியல் பரவல் மற்றும் அசைட்ஸ் தோன்றுவதாகும். அசைட்ஸில் செல் திரவம் குவிவது முற்றிய நோய் மற்றும் மோசமான முன்கணிப்புடன் தொடர்புடையது (15). அறிக்கைகளின்படி, இந்த தனித்துவமான பகுதி ஹைபோக்ஸிக் ஆகும், வாஸ்குலர் எண்டோதீலியல் வளர்ச்சி காரணி (VEGF) மற்றும் இண்டோலமைன் 2,3-டையாக்ஸிஜனேஸ் (IDO) ஆகியவற்றின் அதிக அளவுகளைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் T ஒழுங்குமுறை செல்கள் மற்றும் மைலாய்டு தடுப்பு செல்களால் ஊடுருவப்படுகிறது (15-18). அசைட்ஸின் வளர்சிதை மாற்ற சூழல் கட்டியின் சூழலிலிருந்து வேறுபட்டிருக்கலாம், எனவே பெரிட்டோனியல் பகுதியில் T செல்களின் மறு நிரலாக்கம் தெளிவாக இல்லை. கூடுதலாக, அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டி சூழலில் உள்ள வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களுக்கு இடையிலான முக்கிய வேறுபாடுகள் மற்றும் பன்முகத்தன்மை, நோயெதிர்ப்பு செல்களின் ஊடுருவல் மற்றும் கட்டிகள் மீதான அவற்றின் செயல்பாட்டைத் தடுக்கக்கூடும், மேலும் கூடுதல் ஆராய்ச்சி தேவைப்படுகிறது.
இந்தப் பிரச்சனைகளைத் தீர்ப்பதற்காக, நோயாளியின் ஒரே வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டிச் சூழலில் உள்ள செல்களுக்கு இடையேயும், கட்டிகளுக்கு உள்ளேயும் உள்ள பல்வேறு செல் வகைகளையும் (CD4+ மற்றும் CD8+ T செல்கள் உட்பட), அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களையும் ஆய்வு செய்ய, ஒரு நுட்பமான செல் பிரிப்பு மற்றும் திரவ நிறப்பிரிகை இணை நிறை நிறமாலையியல் (LC-MS/MS) முறையை நாங்கள் வடிவமைத்தோம். இந்த முக்கிய செல் குழுக்களின் வளர்சிதை மாற்ற நிலையின் மிகத் தெளிவான சித்திரத்தை வழங்குவதற்காக, இந்த முறையை உயர்-பரிமாண பாய்வு சைட்டோமெட்ரி மற்றும் ஒற்றை-செல் ஆர்.என்.ஏ வரிசைமுறை (scRNA-seq) ஆகியவற்றுடன் இணைந்து பயன்படுத்துகிறோம். இந்த முறை, கட்டி T செல்களில் 1-மெத்தில்நிகோடினமைடு (MNA) அளவில் ஒரு குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பை வெளிப்படுத்தியது. மேலும், ஆய்வகச் சோதனைகள், T செல் செயல்பாட்டின் மீது MNA-வின் நோயெதிர்ப்பு சீராக்கும் விளைவு இதற்கு முன் அறியப்படாதது என்பதைக் காட்டின. பொதுவாக, இந்த முறை கட்டிகளுக்கும் நோயெதிர்ப்பு செல்களுக்கும் இடையிலான பரஸ்பர வளர்சிதை மாற்ற இடைவினைகளை வெளிப்படுத்துகிறது. மேலும், நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குமுறை வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் குறித்த தனித்துவமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது. இது T செல் அடிப்படையிலான கருப்பை புற்றுநோய் நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சைக்கான வாய்ப்புகளுக்குப் பயனுள்ளதாக இருக்கலாம்.
உயர் பரிமாண ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி, குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் [2-(N-(7-நைட்ரோஃபீனைல்-2-ஆக்ஸா-1,3-டையாஸா-4-யில்)அமினோ)-2-டீஆக்சிகுளுக்கோஸ் (2-NBDG)] மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு [மைட்டோட்ராக்கர் டீப் ரெட் (MT DR)] (7, 19, 20) ஆகியவற்றை ஒரே நேரத்தில் அளவிட்டோம். இவை நோயெதிர்ப்பு செல்கள் மற்றும் கட்டி செல் குழுக்களை வேறுபடுத்தி அறிய உதவும் பொதுவான குறிப்பான்களாகும் (அட்டவணை S2 மற்றும் படம் S1A). இந்த பகுப்பாய்வில், T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி செல்கள் அதிக குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் அளவுகளைக் கொண்டுள்ளன, ஆனால் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் சிறிய வேறுபாடுகளையே கொண்டுள்ளன என்பது தெரியவந்தது. கட்டி செல்களின் [CD45-EpCAM (EpCAM)+] சராசரி குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல், T செல்களின் உட்கொள்ளலை விட மூன்று முதல் நான்கு மடங்கு அதிகமாகவும், CD4 + T செல்களின் சராசரி குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல், CD8 + T செல்களின் உட்கொள்ளலை விட 1.2 மடங்கு அதிகமாகவும் உள்ளது. இது, கட்டிக்குள் ஊடுருவும் லிம்போசைட்டுகள் (TIL) ஒரே TME-இல் கூட வெவ்வேறு வளர்சிதை மாற்றத் தேவைகளைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 1A). இதற்கு மாறாக, கட்டி செல்களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD4 + T செல்களின் செயல்பாட்டை ஒத்திருக்கிறது, மேலும் இவ்விரு வகை செல்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடும் CD8 + T செல்களின் செயல்பாட்டை விட அதிகமாக உள்ளது (படம் 1B). பொதுவாக, இந்த முடிவுகள் வளர்சிதை மாற்ற அளவை வெளிப்படுத்துகின்றன. கட்டி செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு CD4 + T செல்களின் செயல்பாட்டை விட அதிகமாக உள்ளது, மேலும் CD4 + T செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு CD8 + T செல்களின் செயல்பாட்டை விட அதிகமாக உள்ளது. செல் வகைகளில் இந்த விளைவுகள் இருந்தபோதிலும், கட்டிகளுடன் ஒப்பிடும்போது வயிற்று நீரில் உள்ள CD4 + மற்றும் CD8 + T செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற நிலை அல்லது அவற்றின் சார்பு விகிதங்களில் சீரான வேறுபாடு எதுவும் இல்லை (படம் 1C). இதற்கு மாறாக, CD45-செல் பிரிவில், வயிற்று நீருடன் ஒப்பிடும்போது கட்டியில் EpCAM+ செல்களின் விகிதம் அதிகரித்துள்ளது (படம் 1D). EpCAM+ மற்றும் EpCAM- செல் கூறுகளுக்கு இடையே ஒரு தெளிவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாட்டையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். EpCAM+ (கட்டி) செல்கள், EpCAM- செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளலையும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டையும் கொண்டுள்ளன, இது TME-இல் உள்ள கட்டி செல்களில் உள்ள ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாட்டை விட மிகவும் அதிகமாகும் (படம் 1, E மற்றும் F).
(A மற்றும் B) குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளலின் (2-NBDG) சராசரி ஒளிர்தல் செறிவு (MFI) (A) மற்றும் CD4 + T செல்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு (மைட்டோட்ராக்கர் அடர் சிவப்பு) (B) பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணைப்படுத்தப்பட்ட தரவு (வலது), வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டியிலிருந்து பெறப்பட்ட CD8 + T செல்கள் மற்றும் EpCAM + CD45-கட்டி செல்கள். (C) வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டியில் உள்ள CD4 + மற்றும் CD8 + செல்களின் (CD3 + T செல்களின்) விகிதம். (D) வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டியில் உள்ள EpCAM + கட்டி செல்களின் விகிதம் (CD45−). (E மற்றும் F) EpCAM + CD45-கட்டி மற்றும் EpCAM-CD45-அணி குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் (2-NBDG) (E) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு (மைட்டோட்ராக்கர் அடர் சிவப்பு) (F) பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணைப்படுத்தப்பட்ட தரவு (வலது) வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி செல்கள். (G) ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் CD25, CD137 மற்றும் PD1 வெளிப்பாட்டின் பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள். (H மற்றும் I) CD4 + T செல்கள் (H) மற்றும் CD8 + T செல்கள் (I) மீதான CD25, CD137 மற்றும் PD1 வெளிப்பாடு. (J மற்றும் K) CCR7 மற்றும் CD45RO வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் நைவ், சென்ட்ரல் மெமரி (Tcm), எஃபெக்டர் (Teff) மற்றும் எஃபெக்டர் மெமரி (Tem) ஃபீனோடைப்கள். அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள CD4 + T செல்கள் (J) மற்றும் CD8 + T செல்கள் (K) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணைத் தரவுகள் (வலது). இணைக்கப்பட்ட t-சோதனை மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்ட P மதிப்புகள் (*P<0.05, **P<0.01 மற்றும் ***P<0.001). கோடு பொருத்தப்பட்ட நோயாளிகளைக் குறிக்கிறது (n = 6). FMO, ஃப்ளோரசன்ஸ் மைனஸ் ஒன்; MFI, மீடியன் ஃப்ளோரசன்ஸ் இன்டென்சிட்டி.
மேலும் பகுப்பாய்வு, உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட T செல் ஃபீனோடைபிக் நிலைக்கு இடையே மற்ற குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கட்டிகளில் உள்ள செயல்படுத்தப்பட்ட (படம் 1, G முதல் I வரை) மற்றும் எஃபெக்டர் மெமரி (படம் 1, J மற்றும் K) ஆகியவை அசைட்டிஸை விட (CD3 + T செல்களின் விகிதம்) மிகவும் அதிகமாகக் காணப்படுகின்றன. இதேபோல், செயல்படுத்தும் குறிப்பான்கள் (CD25 மற்றும் CD137) மற்றும் குறைப்பு குறிப்பான்கள் [புரோகிராம் செய்யப்பட்ட செல் இறப்பு புரதம் 1 (PD1)] ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டின் மூலம் ஃபீனோடைப்பைப் பகுப்பாய்வு செய்ததில், இந்த பாப்புலேஷன்களின் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகள் வேறுபட்டிருந்தாலும் (படம் S1, B முதல் E வரை), நைவ், எஃபெக்டர் அல்லது மெமரி துணைக்குழுக்களுக்கு இடையில் குறிப்பிடத்தக்க வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகள் தொடர்ந்து காணப்படவில்லை (படம் S1, F முதல் I வரை). இந்த முடிவுகள், செல் ஃபீனோடைப்களை தானாகவே ஒதுக்குவதற்கு இயந்திர கற்றல் முறைகளைப் பயன்படுத்தி (21) உறுதிப்படுத்தப்பட்டன, இது நோயாளியின் அசைட்டிஸில் அதிக எண்ணிக்கையிலான எலும்பு மஜ்ஜை செல்கள் (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) இருப்பதையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் S2A). அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து செல் வகைகளிலும், இந்த மைலாய்டு செல் தொகுதியே மிக உயர்ந்த குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலையும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் S2, B முதல் G வரை). இந்த முடிவுகள், HGSC நோயாளிகளின் வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டிகளில் காணப்படும் பல செல் வகைகளுக்கு இடையேயான வலுவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளை எடுத்துக்காட்டுகின்றன.
TIL-இன் மெட்டாபோனமிக் பண்புகளைப் புரிந்துகொள்வதில் உள்ள முக்கிய சவால், கட்டிகளிலிருந்து போதுமான தூய்மை, தரம் மற்றும் அளவு கொண்ட T செல் மாதிரிகளைப் பிரித்தெடுக்க வேண்டிய தேவையாகும். ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரியை அடிப்படையாகக் கொண்ட வரிசைப்படுத்துதல் மற்றும் மணி செறிவூட்டல் முறைகள், செல்லுலார் மெட்டாபோலைட் சுயவிவரங்களில் மாற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கும் என்று சமீபத்திய ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன (22-24). இந்தச் சிக்கலைச் சமாளிக்க, LC-MS/MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு முன்னர், அறுவை சிகிச்சை மூலம் அகற்றப்பட்ட மனித கருப்பை புற்றுநோயிலிருந்து TIL-ஐப் பிரித்தெடுக்க மணி செறிவூட்டல் முறையை நாங்கள் மேம்படுத்தினோம் (பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்; படம் 2A). மெட்டாபோலைட் மாற்றங்கள் மீதான இந்த நெறிமுறையின் ஒட்டுமொத்த தாக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்காக, மேற்கூறிய மணி பிரிப்புப் படிக்குப் பிறகு ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்களால் செயல்படுத்தப்பட்ட T செல்களின் மெட்டாபோலைட் சுயவிவரங்களை, மணிகளால் பிரிக்கப்படாமல் பனிக்கட்டியில் வைக்கப்பட்டிருந்த செல்களுடன் ஒப்பிட்டோம். இந்தத் தரக் கட்டுப்பாட்டுப் பகுப்பாய்வில், இந்த இரண்டு நிலைகளுக்கும் இடையே அதிக தொடர்பு இருப்பதும் (r = 0.77), 86 மெட்டாபோலைட்டுகளின் குழுவின் தொழில்நுட்ப மீண்டும் மீண்டும் செய்யும் தன்மை அதிகமாக இருப்பதும் கண்டறியப்பட்டது (படம் 2B). எனவே, இந்த முறைகள் செல் வகை செறிவூட்டலுக்கு உட்படும் செல்களில் துல்லியமான வளர்சிதை மாற்றப் பகுப்பாய்வைச் செய்ய முடியும், இதன் மூலம் HGSC-யில் குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களைக் கண்டறிவதற்கான முதல் உயர்-தெளிவுத்திறன் தளத்தை வழங்குகின்றன, இதனால் மக்கள் செல் தனித்தன்மை குறித்த ஆழமான புரிதலைப் பெற முடிகிறது.
(A) காந்த மணி செறிவூட்டலின் திட்ட வரைபடம். LC-MS/MS மூலம் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு முன், செல்கள் தொடர்ச்சியாக மூன்று சுற்று காந்த மணி செறிவூட்டலுக்கு உட்படுத்தப்படும் அல்லது பனிக்கட்டியில் வைக்கப்படும். (B) வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் செறிவின் மீது செறிவூட்டல் வகையின் விளைவு. ஒவ்வொரு செறிவூட்டல் வகைக்கும் மூன்று அளவீடுகளின் சராசரி ± SE. சாம்பல் கோடு 1:1 உறவைக் குறிக்கிறது. மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்ட அளவீடுகளின் அகவகுப்புத் தொடர்பு (ICC) அச்சு லேபிளில் காட்டப்பட்டுள்ளது. NAD, நிக்கோடினமைடு அடினைன் டைநியூக்ளியோடைடு. (C) நோயாளியின் வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் பகுப்பாய்வின் பணிப்பாய்வு திட்ட வரைபடம். நோயாளிகளிடமிருந்து வயிற்று நீர்க்கோவை அல்லது கட்டிகள் சேகரிக்கப்பட்டு உறைநிலையில் பாதுகாக்கப்படுகின்றன. ஒவ்வொரு மாதிரியின் ஒரு சிறிய பகுதி ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மீதமுள்ள மாதிரிகள் CD4+, CD8+ மற்றும் CD45- செல்களுக்காக மூன்று சுற்று செறிவூட்டலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. இந்த செல் பின்னங்கள் LC-MS/MS ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. (D) தரப்படுத்தப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் செறிவின் வெப்ப வரைபடம். டென்ட்ரோகிராம் மாதிரிகளுக்கு இடையிலான யூக்ளிடியன் தூரங்களின் வார்டின் கிளஸ்டரிங்கைக் குறிக்கிறது. (E) மாதிரி வளர்சிதை மாற்ற வரைபடத்தின் முதன்மைக் கூறு பகுப்பாய்வு (PCA), ஒவ்வொரு மாதிரியின் மூன்று பிரதிகளையும் காட்டுகிறது; ஒரே நோயாளியின் மாதிரிகள் ஒரு கோட்டால் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. (F) நோயாளியின் அடிப்படையில் நிபந்தனைக்குட்படுத்தப்பட்ட மாதிரியின் வளர்சிதை மாற்ற விவரத்தின் PCA (அதாவது, பகுதி மிகைமையைப் பயன்படுத்தி); மாதிரி வகை குவிந்த உறையால் வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. PC1, முதன்மைக் கூறு 1; PC2, முதன்மைக் கூறு 2.
அடுத்து, ஆறு HGSC நோயாளிகளின் முதன்மை வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள CD4+, CD8+ மற்றும் CD45-செல் பிரிவுகளில் 99 வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைப் பகுப்பாய்வு செய்ய, இந்தச் செறிவூட்டும் முறையைப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 2C, படம் S3A மற்றும் அட்டவணை S3 மற்றும் S4). ஆய்வுக்குட்பட்ட செல் தொகுதியானது, உயிருள்ள செல்களின் அசல் பெரிய மாதிரியில் 2% முதல் 70% வரை உள்ளது, மேலும் செல்களின் விகிதம் நோயாளிகளுக்கு இடையில் பெரிதும் வேறுபடுகிறது. மணிகளைப் பிரித்தெடுத்த பிறகு, செறிவூட்டப்பட்ட ஆய்வுக்குட்பட்ட பிரிவு (CD4+, CD8+ அல்லது CD45-) மாதிரியில் உள்ள அனைத்து உயிருள்ள செல்களிலும் சராசரியாக 85%-க்கும் அதிகமாக உள்ளது. இந்தச் செறிவூட்டும் முறையானது, மனிதக் கட்டித் திசுக்களின் வளர்சிதை மாற்றத்திலிருந்து செல் தொகுதிகளைப் பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது, இது பெரிய மாதிரிகளிலிருந்து செய்ய முடியாத ஒன்றாகும். இந்த நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி, நன்கு அறியப்பட்ட நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களான எல்-கைனூரினின் மற்றும் அடினோசின் ஆகியவை கட்டி T செல்கள் அல்லது கட்டி செல்களில் அதிகமாக இருந்தன என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் S3, B மற்றும் C). எனவே, இந்த முடிவுகள், நோயாளிகளின் திசுக்களில் உள்ள உயிரியல் ரீதியாக முக்கியமான வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைக் கண்டறிவதில், நமது செல் பிரிப்பு மற்றும் நிறை நிறமாலைமானி தொழில்நுட்பத்தின் நம்பகத்தன்மையையும் திறனையும் நிரூபிக்கின்றன.
எங்கள் பகுப்பாய்வு, நோயாளிகளுக்கு உள்ளேயும் மற்றும் அவர்களுக்கு இடையேயும் செல் வகைகளின் வலுவான வளர்சிதை மாற்றப் பிரிவையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் 2D மற்றும் படம் S4A). குறிப்பாக, மற்ற நோயாளிகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​நோயாளி 70 வேறுபட்ட வளர்சிதை மாற்றப் பண்புகளைக் காட்டினார் (படம் 2E மற்றும் படம் S4B), இது நோயாளிகளுக்கு இடையே கணிசமான வளர்சிதை மாற்றப் பன்முகத்தன்மை இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது. மற்ற நோயாளிகளுடன் (1.2 முதல் 2 லிட்டர்; அட்டவணை S1) ஒப்பிடும்போது, ​​நோயாளி 70-இடம் சேகரிக்கப்பட்ட மொத்த வயிற்று நீரின் அளவு (80 மிலி) குறைவாக இருந்தது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. முதன்மைக் கூறு பகுப்பாய்வின் போது (எடுத்துக்காட்டாக, பகுதி மிகை பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி) நோயாளிகளுக்கு இடையேயான பன்முகத்தன்மையைக் கட்டுப்படுத்துவது, செல் வகைகளுக்கு இடையே சீரான மாற்றங்களைக் காட்டுகிறது, மேலும் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரத்தின்படி செல் வகைகள் மற்றும்/அல்லது நுண்சூழல் தெளிவாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டுள்ளன (படம் 2F). தனிப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களின் பகுப்பாய்வு இந்த விளைவுகளை வலியுறுத்தியது மற்றும் செல் வகைகள் மற்றும் நுண்சூழலுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கவனிக்கத்தக்க வகையில், அவதானிக்கப்பட்ட மிகவும் தீவிரமான வேறுபாடு MNA ஆகும், இது பொதுவாக CD45- செல்களிலும், கட்டியில் ஊடுருவும் CD4+ மற்றும் CD8+ செல்களிலும் செறிவூட்டப்படுகிறது (படம் 3A). CD4+ செல்களுக்கு இந்த விளைவு மிகவும் வெளிப்படையாகத் தெரிகிறது, மேலும் CD8+ செல்களில் உள்ள MNA-வும் சூழலால் வலுவாகப் பாதிக்கப்படுவதாகத் தெரிகிறது. இருப்பினும், இது முக்கியமில்லை, ஏனெனில் ஆறு நோயாளிகளில் மூன்று பேருக்கு மட்டுமே கட்டியின் CD8+ மதிப்பெண்களை மதிப்பிட முடிகிறது. MNA-வைத் தவிர, வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள பல்வேறு வகையான செல்களில், TIL-ல் சரியாக வகைப்படுத்தப்படாத பிற வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களும் வேறுபட்ட அளவில் செறிந்து காணப்படுகின்றன (படங்கள் S3 மற்றும் S4). எனவே, இந்தத் தரவுகள் மேலதிக ஆய்வுகளுக்கு உகந்த, நோய் எதிர்ப்பு சக்தியை மாற்றியமைக்கும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய தொகுப்பை வெளிப்படுத்துகின்றன.
(A) வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டியிலிருந்து பெறப்பட்ட CD4+, CD8+ மற்றும் CD45- செல்களில் உள்ள MNA-வின் இயல்பாக்கப்பட்ட உள்ளடக்கம். பெட்டி வரைபடம் இடைநிலை (கோடு), கால்பகுதி இடைவெளி (சட்டக கீல்) மற்றும் கால்பகுதி இடைவெளியின் 1.5 மடங்கு வரையிலான தரவு வரம்பு (சட்டக மீசை) ஆகியவற்றைக் காட்டுகிறது. நோயாளி பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, P மதிப்பைத் தீர்மானிக்க நோயாளியின் லிம்மா மதிப்பைப் பயன்படுத்தவும் (*P<0.05 மற்றும் **P<0.01). (B) MNA வளர்சிதை மாற்றத்தின் திட்ட வரைபடம் (60). வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள்: S-அடினோசில்-1-மெத்தியோனைன்; SAH, S-அடினோசின்-1-ஹோமோசிஸ்டீன்; NA, நிக்கோடினமைடு; MNA, 1-மெத்தில்நிக்கோடினமைடு; 2-PY, 1-மெத்தில்-2-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு; 4-PY, 1-மெத்தில்-4-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு; NR, நிக்கோடினமைடு ரிபோஸ்; NMN, நிக்கோடினமைடு மோனோநியூக்ளியோடைடு. நொதிகள் (பச்சை): NNMT, நிக்கோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; SIRT, சிர்டூயின்கள்; NAMPT, நிக்கோடினமைடு பாஸ்போரிபோசில் ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; AOX1, ஆல்டிஹைட் ஆக்சிடேஸ் 1; NRK, நிக்கோடினமைடு ரிபோசைடு கைனேஸ்; NMNAT, நிக்கோடினமைடு மோனோ நியூக்ளியோடைடு அடினைலேட் ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; Pnp1, பியூரின் நியூக்ளியோசைடு பாஸ்போரிலேஸ். (C) வயிற்று நீர்க்கோவை (சாம்பல்) மற்றும் கட்டி (சிவப்பு; n = 3 நோயாளிகள்) ஆகியவற்றின் scRNA-seq-இன் t-SNE. (D) scRNA-seq-ஐப் பயன்படுத்தி அடையாளம் காணப்பட்ட வெவ்வேறு செல் தொகுதிகளில் NNMT வெளிப்பாடு. (E) SK-OV-3, மனித கரு சிறுநீரக (HEK) 293T, T செல்கள் மற்றும் MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் NNMT மற்றும் AOX1-இன் வெளிப்பாடு. மடிந்த வெளிப்பாடு SK-OV-3-ஐப் பொறுத்துக் காட்டப்பட்டுள்ளது. SEM உடனான வெளிப்பாட்டு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 6 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்). 35-ஐ விட அதிகமான Ct மதிப்புகள் கண்டறிய முடியாதவை (UD) எனக் கருதப்படுகின்றன. (F) SK-OV-3, HEK293T, T செல்கள் மற்றும் 8mM MNA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் SLC22A1 மற்றும் SLC22A2-இன் வெளிப்பாடு. SK-OV-3-ஐப் பொறுத்து மடங்கு வெளிப்பாடு காட்டப்பட்டுள்ளது. SEM உடனான வெளிப்பாட்டு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 6 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்). 35-ஐ விட அதிகமான Ct மதிப்புகள் கண்டறிய முடியாதவை (UD) எனக் கருதப்படுகின்றன. (G) MNA-வுடன் 72 மணிநேர அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, செயல்படுத்தப்பட்ட ஆரோக்கியமான கொடையாளர் T செல்களில் உள்ள செல் MNA உள்ளடக்கம். SEM உடனான வெளிப்பாட்டு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 4 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்).
S-அடினோசில்-1-மெத்தியோனைனிலிருந்து (SAM) மெத்தில் குழுவை நிக்கோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் (NNMT; படம் 3B) மூலம் நிக்கோடினமைடுக்கு (NA) மாற்றுவதன் மூலம் MNA உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது. NNMT பல்வேறு மனித புற்றுநோய்களில் மிகையாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் பெருக்கம், ஊடுருவல் மற்றும் மெட்டாஸ்டாசிஸ் (25-27) ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையது. TME-இல் உள்ள T செல்களில் MNA-வின் மூலத்தை நன்கு புரிந்துகொள்ள, மூன்று HGSC நோயாளிகளின் அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள செல் வகைகளில் NNMT-யின் வெளிப்பாட்டை வகைப்படுத்த நாங்கள் scRNA-seq-ஐப் பயன்படுத்தினோம் (அட்டவணை S5). சுமார் 6,500 செல்களின் பகுப்பாய்வில், அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டி சூழல்களில், NNMT வெளிப்பாடு, அனுமானிக்கப்பட்ட ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் மற்றும் கட்டி செல் பாப்புலேஷன்களுக்குள் கட்டுப்படுத்தப்பட்டிருந்தது தெரியவந்தது (படம் 3, C மற்றும் D). PTPRC (CD45 +) வெளிப்படுத்தும் எந்தவொரு பாப்புலேஷனிலும் வெளிப்படையான NNMT வெளிப்பாடு இல்லை என்பது குறிப்பிடத்தக்கது (படம் 3D மற்றும் படம் S5A), இது மெட்டபாலிட் ஸ்பெக்ட்ரத்தில் கண்டறியப்பட்ட MNA, T செல்களுக்குள் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. MNA-வை 1-மெத்தில்-2-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு (2-PYR) அல்லது 1-மெத்தில்-4-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு (4-PYR) ஆக மாற்றும் ஆல்டிஹைடு ஆக்சிடேஸ் 1 (AOX1)-இன் வெளிப்பாடு (படம் 3B), COL1A1-ஐ வெளிப்படுத்தும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களின் தொகுப்பிற்குள் மட்டுமே கட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது (படம் S5A). இவை அனைத்தும் சேர்ந்து, T செல்களுக்கு வழக்கமான MNA வளர்சிதை மாற்றத் திறன் இல்லை என்பதைக் குறிக்கின்றன. இந்த MNA-தொடர்பான மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டு முறை, HGSC நோயாளிகளின் வயிற்று நீர்க்கோவையிலிருந்து பெறப்பட்ட இரண்டாவது சுயாதீன செல் தரவுத் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி சரிபார்க்கப்பட்டது (படம் S5B; n = 6) (16). கூடுதலாக, MNA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்களின் அளவுசார் பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (qPCR) பகுப்பாய்வில், கட்டுப்பாட்டு SK-OV-3 கருப்பைக் கட்டி செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​NNMT அல்லது AOX1 கிட்டத்தட்ட வெளிப்படுத்தப்படவில்லை (படம் 3E). இந்த எதிர்பாராத முடிவுகள், MNA ஆனது ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் அல்லது கட்டிகளிலிருந்து TME-இல் உள்ள அருகிலுள்ள T செல்களுக்குள் சுரக்கப்படலாம் என்பதைக் குறிக்கின்றன.
கரையக்கூடிய கேரியர் 22 (SLC22) குடும்பத்தால் (SLC22A1, SLC22A2 மற்றும் SLC22A3) குறியிடப்பட்ட ஆர்கானிக் கேஷன் டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் 1 முதல் 3 (OCT1, OCT2 மற்றும் OCT3) குடும்பம் வேட்பாளர்களில் அடங்கும் என்றாலும், MNA இன் சாத்தியமான டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் இன்னும் வரையறுக்கப்படவில்லை (28). ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்களிலிருந்து mRNA இன் QPCR, SLC22A1 இன் குறைந்த வெளிப்பாட்டு அளவுகளையும், ஆனால் SLC22A2 இன் கண்டறிய முடியாத அளவுகளையும் காட்டியது, இது முன்னர் இலக்கியத்தில் தெரிவிக்கப்பட்டதை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 3F) (29). இதற்கு மாறாக, SK-OV-3 கருப்பை கட்டி செல் வரிசை இரண்டு டிரான்ஸ்போர்ட்டர்களையும் அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தியது (படம் 3F).
T செல்களுக்கு வெளி MNA-வை உறிஞ்சும் திறன் உள்ளதா என்பதைச் சோதிப்பதற்காக, ஆரோக்கியமான கொடையாளியின் T செல்கள், வெவ்வேறு செறிவுகளில் MNA முன்னிலையில் 72 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. வெளி MNA இல்லாத நிலையில், செல்களில் உள்ள MNA-வின் அளவைக் கண்டறிய முடியவில்லை (படம் 3G). இருப்பினும், வெளி MNA-வால் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட தூண்டப்பட்ட T செல்களில், 6 mM MNA வரை, செல்களின் MNA உள்ளடக்கம் அளவைப் பொறுத்து அதிகரித்தது (படம் 3G). கடத்தியின் வெளிப்பாடு குறைவாக இருந்தபோதிலும் மற்றும் செல்களுக்குள் MNA வளர்சிதை மாற்றத்திற்குப் பொறுப்பான முக்கிய நொதி இல்லாதபோதிலும், TIL-களால் MNA-வை எடுத்துக்கொள்ள முடியும் என்பதை இந்த முடிவு காட்டுகிறது.
நோயாளிகளின் T செல்களில் உள்ள வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் வரிசை மற்றும் இன் விட்ரோ MNA உறிஞ்சுதல் சோதனைகள், புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் (CAF) MNA-வைச் சுரக்கக்கூடும் மற்றும் கட்டி செல்கள் TIL-இன் புறத்தோற்றத்தையும் செயல்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்தக்கூடும் என்ற சாத்தியத்தை அதிகரிக்கின்றன. T செல்களின் மீது MNA-வின் விளைவைத் தீர்மானிக்க, ஆரோக்கியமான கொடையாளியின் T செல்கள், MNA-வின் முன்னிலையில் அல்லது அதன் இல்லாமையில் இன் விட்ரோவில் செயல்படுத்தப்பட்டு, அவற்றின் பெருக்கம் மற்றும் சைட்டோகைன் உற்பத்தி ஆகியவை மதிப்பிடப்பட்டன. அதிகபட்ச அளவில் MNA-வைச் சேர்த்த 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, செல் இரட்டிப்பு எண்ணிக்கை மிதமாகக் குறைந்தது, அதே சமயம் அனைத்து அளவுகளிலும் வீரியம் பராமரிக்கப்பட்டது (படம் 4A). கூடுதலாக, புறவழி MNA சிகிச்சையானது, கட்டி நசிவு காரணி-α (TNFα; படம் 4B) வெளிப்படுத்தும் CD4+ மற்றும் CD8+ T செல்களின் விகிதத்தில் அதிகரிப்பை ஏற்படுத்தியது. இதற்கு மாறாக, CD4+ T செல்களில் IFN-γ-இன் செல் உள் உற்பத்தி குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைக்கப்பட்டது, ஆனால் CD8+ T செல்களில் அவ்வாறு இல்லை, மேலும் இன்டர்லூகின் 2 (IL-2; படம் 4, C மற்றும் D)-இல் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றம் எதுவும் இல்லை. எனவே, இந்த MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல் வளர்ப்புகளின் மேற்புற திரவங்களின் நொதி-இணைக்கப்பட்ட நோயெதிர்ப்புப் பரிசோதனை (ELISA), TNFα-வில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பையும், IFN-γ-வில் குறைவையும், மற்றும் IL-2-வில் எந்த மாற்றமும் இல்லை என்பதையும் காட்டியது (படம் 4, E முதல் G வரை). IFN-γ-வின் குறைவானது, T செல்களின் கட்டி எதிர்ப்புச் செயல்பாட்டைத் தடுப்பதில் MNA ஒரு பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. T செல்-மத்தியஸ்த நச்சுத்தன்மையின் மீது MNA-வின் விளைவை உருவகப்படுத்துவதற்காக, ஃபோலேட் ஏற்பி α-வை இலக்காகக் கொண்ட கலப்பின ஆன்டிஜென் ஏற்பி T (FRα-CAR-T) செல்களும், பச்சை ஒளிரும் புரதத்தால் (GFP) கட்டுப்படுத்தப்படும் CAR-T (GFP) செல்களும் ஆரோக்கியமான கொடையாளியின் புற இரத்த ஒற்றை அணுக்களிலிருந்து (PBMC) உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன. CAR-T செல்கள் MNA-வின் முன்னிலையில் 24 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டு, பின்னர் ஃபோலேட் ஏற்பி α-வை வெளிப்படுத்தும் மனித SK-OV-3 கருப்பைக் கட்டி செல்களுடன் 10:1 என்ற விளைவு-இலக்கு விகிதத்தில் இணை-வளர்க்கப்பட்டன. MNA சிகிச்சையானது FRα-CAR-T செல்களின் கொல்லும் செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தியது, இது அடினோசின் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட FRα-CAR-T செல்களைப் போலவே இருந்தது (படம் 4H).
(A) 7 ஆம் நாளில் வளர்ப்பிலிருந்து நேரடியாக மொத்த உயிருள்ள செல்களின் எண்ணிக்கை மற்றும் மக்கள் தொகை இரட்டிப்பு (PD). பட்டை வரைபடம் ஆறு ஆரோக்கியமான கொடையாளர்களின் சராசரி + SEM ஐக் குறிக்கிறது. குறைந்தது n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து பெறப்பட்ட தரவைக் குறிக்கிறது. (B முதல் D வரை) T செல்களைச் செயல்படுத்த, CD3/CD28 மற்றும் IL-2 ஆகியவை அவற்றின் MNA செறிவுகளில் 7 நாட்களுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்கு முன், செல்கள் 4 மணி நேரத்திற்கு கோல்ஜிஸ்டாப் உடன் PMA/அயனோமைசின் மூலம் தூண்டப்பட்டன. T செல்களில் TNFα (B) வெளிப்பாடு. உயிருள்ள செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டின் எடுத்துக்காட்டுப் படம் (இடது) மற்றும் அட்டவணைத் தரவு (வலது). T செல்களில் IFN-γ (C) மற்றும் IL-2 (D) வெளிப்பாடு. சைட்டோகைன்களின் வெளிப்பாடு ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் அளவிடப்பட்டது. பட்டை வரைபடம் சராசரி (n = 6 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்) + SEM ஐக் குறிக்கிறது. P மதிப்பைத் தீர்மானிக்க ஒருவழி மாறுபாடு பகுப்பாய்வு மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் அளவிடுதல்களைப் பயன்படுத்தவும் (*P<0.05 மற்றும் **P<0.01). குறைந்தது n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து பெறப்பட்ட தரவைக் குறிக்கிறது. (E முதல் G வரை) T செல்களைச் செயல்படுத்த, CD3/CD28 மற்றும் IL-2 ஆகியவை அவற்றின் MNA செறிவுகளில் 7 நாட்களுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன. PMA/அயனோமைசின் தூண்டுதலுக்கு முன்னும் 4 மணி நேரத்திற்குப் பிறகும் ஊடகம் சேகரிக்கப்பட்டது. TNFα (E), IFN-γ (F) மற்றும் IL-2 (G) ஆகியவற்றின் செறிவுகள் ELISA மூலம் அளவிடப்பட்டன. பட்டை வரைபடம் சராசரியை (n = 5 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்) + SEM ஆகக் குறிக்கிறது. ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகள் மூலம் P மதிப்பு தீர்மானிக்கப்பட்டது (*P<0.05). புள்ளியிடப்பட்ட கோடு கண்டறிதலின் கண்டறியும் வரம்பைக் குறிக்கிறது. (H) செல் சிதைவுச் சோதனை. FRα-CAR-T அல்லது GFP-CAR-T செல்கள் அடினோசின் (250μM) அல்லது MNA (10 mM) உடன் 24 மணி நேரத்திற்குச் சரிசெய்யப்பட்டன, அல்லது சிகிச்சையளிக்கப்படாமல் விடப்பட்டன (Ctrl). SK-OV-3 செல்களின் அழிக்கப்பட்ட சதவீதம் அளவிடப்பட்டது. வெல்ச் t சோதனை மூலம் P மதிப்பு தீர்மானிக்கப்பட்டது (*P<0.5 மற்றும் **P<0.01).
MNA-சார்ந்த TNFα வெளிப்பாட்டு ஒழுங்குமுறையின் இயந்திரவியல் புரிதலைப் பெறுவதற்காக, MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களின் TNFα mRNA-வில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன (படம் 5A). MNA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்கள், TNFα படியெடுத்தல் அளவுகளில் இரண்டு மடங்கு அதிகரிப்பைக் காட்டின, இது MNA ஆனது TNFα படியெடுத்தல் ஒழுங்குமுறையைச் சார்ந்துள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த சாத்தியமான ஒழுங்குமுறை பொறிமுறையை ஆராய்வதற்காக, TNFα-வை ஒழுங்குபடுத்தும் இரண்டு அறியப்பட்ட படியெடுத்தல் காரணிகளான, செயல்படுத்தப்பட்ட T செல் அணு காரணி (NFAT) மற்றும் குறிப்பிட்ட புரதம் 1 (Sp1) ஆகியவை, அருகிலுள்ள TNFα ஊக்குவிப்பானுடன் MNA பிணைவதற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன (30). TNFα ஊக்குவிப்பான், அடையாளம் காணப்பட்ட 6 NFAT பிணைப்பு தளங்களையும் 2 Sp1 பிணைப்பு தளங்களையும் கொண்டுள்ளது, இவை ஒரு தளத்தில் [5'cap-லிருந்து -55 அடிப்படை ஜோடிகள் (bp)] ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்துகின்றன (30). குரோமாடின் இம்யூனோபிரெசிபிடேஷன் (ChIP) காட்டியபடி, MNA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டபோது, ​​TNFα ஊக்குவிப்பானுடன் Sp1-இன் பிணைப்பு மூன்று மடங்கு அதிகரித்தது. NFAT-இன் ஒருங்கிணைப்பும் அதிகரித்து, முக்கியத்துவத்தை நெருங்கியது (படம் 5B). இந்தத் தரவுகள், MNA ஆனது Sp1 படியெடுத்தல் மூலம் TNFα-வின் வெளிப்பாட்டையும், குறைந்த அளவில் NFAT-இன் வெளிப்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன.
(A) MNA இல்லாமல் வளர்க்கப்பட்ட T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​MNA-வால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டின் மடங்கு மாற்றம். SEM உடனான வெளிப்பாட்டு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 5 ஆரோக்கியமான கொடையாளர்கள்). குறைந்தது n = 3 தனிப்பட்ட சோதனைகளின் தரவைக் குறிக்கிறது. (B) NFAT மற்றும் Sp1 ஆகியவை (Ctrl) மற்றும் PMA/அயனோமைசின் தூண்டுதலுடன் 4 மணிநேரம் இணைக்கப்பட்ட பிறகு, 8 mM MNA உடன் அல்லது இல்லாமல் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களின் TNFα புரோமோட்டர். இம்யூனோகுளோபுலின் G (IgG) மற்றும் H3 ஆகியவை முறையே இம்யூனோபிரெசிபிடேஷனுக்கான எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ChIP-இன் அளவீடு, கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களில் TNFα புரோமோட்டருடன் Sp1 மற்றும் NFAT-இன் பிணைப்பு பல மடங்கு அதிகரித்ததைக் காட்டியது. குறைந்தது n = 3 தனிப்பட்ட சோதனைகளின் தரவைக் குறிக்கிறது. P மதிப்பு பல t-சோதனைகள் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது (*** P <0.01). (C) HGSC-இன் அசைட்டிஸுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​T செல்கள் (சைட்டோடாக்ஸிக் அல்லாதவை) கட்டியில் TNF-இன் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டின. வண்ணங்கள் வெவ்வேறு நோயாளிகளைக் குறிக்கின்றன. காட்சிப்படுத்தப்பட்ட செல்கள் 300 என்ற எண்ணிக்கைக்கு சமவாய்ப்பு முறையில் மாதிரி எடுக்கப்பட்டு, மிகை வரைதலைக் கட்டுப்படுத்த ஜிட்டர் செய்யப்பட்டுள்ளன (** Padj = 0.0076). (D) கருப்பை புற்றுநோய்க்கான MNA-வின் முன்மொழியப்பட்ட மாதிரி. MNA, கட்டிச் சூழலில் (TME) உள்ள கட்டி செல்கள் மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களில் உற்பத்தி செய்யப்பட்டு, T செல்களால் எடுத்துக்கொள்ளப்படுகிறது. MNA, Sp1-ன் பிணைப்பை TNFα புரோமோட்டருடன் அதிகரிக்கிறது, இது TNFα படியெடுத்தல் மற்றும் TNFα சைட்டோகைன் உற்பத்தியை அதிகரிக்க வழிவகுக்கிறது. MNA, IFN-γ-ன் அளவையும் குறைக்கிறது. T செல் செயல்பாட்டைத் தடுப்பது, கொல்லும் திறனைக் குறைத்து, கட்டி வளர்ச்சியைத் துரிதப்படுத்துகிறது.
அறிக்கைகளின்படி, TNFα ஆனது முன் மற்றும் பின் சார்ந்த கட்டி எதிர்ப்பு மற்றும் கட்டி எதிர்ப்பு விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் கருப்பை புற்றுநோயின் வளர்ச்சி மற்றும் மெட்டாஸ்டாசிஸை ஊக்குவிப்பதில் இது ஒரு நன்கு அறியப்பட்ட பங்கைக் கொண்டுள்ளது (31-33). அறிக்கைகளின்படி, கருப்பை புற்றுநோய் நோயாளிகளின் அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டி திசுக்களில் TNFα-வின் செறிவு, தீங்கற்ற திசுக்களில் இருப்பதை விட அதிகமாக உள்ளது (34-36). செயல்முறையைப் பொறுத்தவரை, TNFα ஆனது வெள்ளை இரத்த அணுக்களின் செயல்படுத்தல், செயல்பாடு மற்றும் பெருக்கத்தை ஒழுங்குபடுத்தவும், புற்றுநோய் செல்களின் ஃபீனோடைப்பை மாற்றவும் முடியும் (37, 38). இந்தக் கண்டுபிடிப்புகளுக்கு இணங்க, வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, அசைட்ஸுடன் ஒப்பிடும்போது கட்டி திசுக்களில் உள்ள T செல்களில் TNF கணிசமாக அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டதைக் காட்டியது (படம் 5C). TNF வெளிப்பாட்டில் ஏற்பட்ட அதிகரிப்பு, சைட்டோடாக்ஸிக் அல்லாத ஃபீனோடைப் கொண்ட T செல் பாப்புலேஷன்களில் மட்டுமே தெளிவாகத் தெரிந்தது (படம் S5A). சுருக்கமாக, இந்தத் தரவுகள் HGSC-யில் MNA இரட்டை நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு மற்றும் கட்டி ஊக்குவிக்கும் விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது என்ற கருத்தை ஆதரிக்கின்றன.
ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரியை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிங், TIL வளர்சிதை மாற்றத்தைப் படிப்பதற்கான முக்கிய முறையாக மாறியுள்ளது. இந்த ஆய்வுகள், புற இரத்த லிம்போசைட்டுகள் அல்லது இரண்டாம் நிலை நிணநீர் உறுப்புகளிலிருந்து வரும் T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​எலி மற்றும் மனித TIL-கள் குளுக்கோஸை உட்கொள்ளும் அதிகப் போக்கையும் (4, 39) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டின் படிப்படியான இழப்பையும் (19, 40) கொண்டுள்ளன என்பதைக் காட்டியுள்ளன. இந்த ஆய்வில் நாங்கள் இதேபோன்ற முடிவுகளைக் கண்டறிந்தாலும், ஒரே அறுவை சிகிச்சை மூலம் அகற்றப்பட்ட கட்டி திசுவிலிருந்து வரும் கட்டி செல்கள் மற்றும் TIL-களின் வளர்சிதை மாற்றத்தை ஒப்பிடுவதே முக்கிய வளர்ச்சியாகும். இந்த முந்தைய அறிக்கைகளில் சிலவற்றுடன் ஒத்துப்போகும் வகையில், வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டிகளிலிருந்து வரும் கட்டி (CD45-EpCAM +) செல்கள், CD8 + மற்றும் CD4 + T செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளலைக் கொண்டுள்ளன, இது கட்டி செல்களின் அதிக குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளலை T செல்களுடன் ஒப்பிடலாம் என்பதை ஆதரிக்கிறது. T செல் போட்டியின் கருத்து. TME. இருப்பினும், கட்டி செல்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD8 + T செல்களை விட அதிகமாக உள்ளது, ஆனால் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD4 + T செல்களின் செயல்பாட்டைப் போலவே உள்ளது. இந்த முடிவுகள், ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் கட்டி செல்களுக்கு முக்கியமானது என்ற வளர்ந்து வரும் கருத்தை வலுப்படுத்துகின்றன (41, 42). CD8 + T செல்கள், CD4 + T செல்களை விட ஆக்ஸிஜனேற்ற செயலிழப்புக்கு அதிக பாதிப்புக்குள்ளாகலாம் அல்லது CD4 + T செல்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைப் பராமரிக்க குளுக்கோஸைத் தவிர வேறு கார்பன் மூலங்களைப் பயன்படுத்தலாம் என்றும் அவர்கள் பரிந்துரைக்கின்றனர் (43, 44). வயிற்று நீரில் உள்ள CD4 + T எஃபெக்டர்கள், T எஃபெக்டர் மெமரி மற்றும் T சென்ட்ரல் மெமரி செல்களுக்கு இடையில் குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் எந்த வித்தியாசத்தையும் நாங்கள் காணவில்லை என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இதேபோல், கட்டிகளில் உள்ள CD8 + T செல்களின் வேறுபாட்டு நிலைக்கும் குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளலில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கும் எந்த சம்பந்தமும் இல்லை, இது இன் விட்ரோவில் வளர்க்கப்பட்ட T செல்களுக்கும் இன் விவோவில் உள்ள மனித TIL-க்கும் இடையிலான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாட்டை எடுத்துக்காட்டுகிறது (22). இந்த அவதானிப்புகள் பாரபட்சமற்ற தானியங்கி செல் பாப்புலேஷன் ஒதுக்கீட்டின் பயன்பாட்டாலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன, இது கட்டி செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைக் கொண்ட CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + செல்கள் பரவலாக உள்ளன, ஆனால் அவை வளர்சிதை மாற்றத்தில் செயல்படும் செல் பாப்புலேஷனைக் கொண்டுள்ளன என்பதை மேலும் வெளிப்படுத்தியது. இந்த பாப்புலேஷன், scRNA-seq பகுப்பாய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட மைலாய்டு சப்ரஸர் செல்கள் அல்லது பிளாஸ்மாசைட்டாய்டு டென்ட்ரிடிக் செல்களின் அனுமான துணை பாப்புலேஷனைக் குறிக்கலாம். இவை இரண்டும் மனித கருப்பை கட்டிகளில் [45] பதிவாகியிருந்தாலும், இந்த மைலாய்டு துணைக்குழுவை விவரிக்க இன்னும் மேலதிக வேலை தேவைப்படுகிறது.
செல் வகைகளுக்கு இடையிலான குளுக்கோஸ் மற்றும் ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றத்தில் உள்ள பொதுவான வேறுபாடுகளை ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி அடிப்படையிலான முறைகள் தெளிவுபடுத்த முடிந்தாலும், TME-இல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்திற்காக குளுக்கோஸ் அல்லது பிற கார்பன் மூலங்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் துல்லியமான வளர்சிதை மாற்றங்கள் இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை. ஒரு குறிப்பிட்ட TIL துணைக்குழுவில் வளர்சிதை மாற்றங்கள் இருப்பதையோ அல்லது இல்லாததையோ ஒதுக்குவதற்கு, வெட்டப்பட்ட திசுவிலிருந்து செல் எண்ணிக்கையைத் தூய்மைப்படுத்த வேண்டும். எனவே, நமது செல் செறிவூட்டல் முறையானது நிறை நிறமாலையியலுடன் இணைந்து, பொருத்தமான நோயாளி மாதிரிகளில் உள்ள T செல்கள் மற்றும் கட்டி செல் எண்ணிக்கையில் வேறுபட்ட முறையில் செறிவூட்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்கள் குறித்த நுண்ணறிவுகளை வழங்க முடியும். ஃப்ளோரசன்ஸ்-செயல்படுத்தப்பட்ட செல் வரிசைப்படுத்தலை விட இந்த முறைக்கு நன்மைகள் இருந்தாலும், உள்ளார்ந்த நிலைத்தன்மை மற்றும்/அல்லது விரைவான சுழற்சி விகிதம் (22) காரணமாக சில வளர்சிதை மாற்ற நூலகங்கள் பாதிக்கப்படலாம். ஆயினும்கூட, நமது முறையானது அடினோசின் மற்றும் கைனூரினின் ஆகிய இரண்டு அங்கீகரிக்கப்பட்ட நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு வளர்சிதை மாற்றங்களை அடையாளம் காண முடிந்தது, ஏனெனில் அவை மாதிரி வகைகளுக்கு இடையில் பெரிதும் வேறுபடுகின்றன.
கட்டிகள் மற்றும் TIL துணை வகைகளின் மீதான எங்களின் மெட்டாபோனமிக் பகுப்பாய்வு, சூலக TME-இல் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் பங்கு குறித்த கூடுதல் நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது. முதலாவதாக, ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி, கட்டிகளுக்கும் CD4+ T செல்களுக்கும் இடையில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் எந்த வேறுபாடும் இல்லை என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். இருப்பினும், LC-MS/MS பகுப்பாய்வு இந்த உயிரினக் கூட்டங்களிடையே வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் செறிவில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை வெளிப்படுத்தியது. இது, TIL வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் அதன் ஒட்டுமொத்த வளர்சிதை மாற்றச் செயல்பாடு குறித்த முடிவுகளுக்குக் கவனமான விளக்கம் தேவை என்பதைக் குறிக்கிறது. இரண்டாவதாக, வயிற்று நீர்க்கோவையில் உள்ள CD45-செல்களுக்கும் T செல்களுக்கும் இடையில் மிகப்பெரிய வேறுபாட்டைக் கொண்ட வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் MNA ஆகும், கட்டிகளில் அல்ல. எனவே, உட்பிரிவு மற்றும் கட்டியின் இருப்பிடம் ஆகியவை TIL வளர்சிதை மாற்றத்தில் வெவ்வேறு விளைவுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும், இது ஒரு குறிப்பிட்ட நுண்சூழலில் சாத்தியமான பன்முகத்தன்மையை எடுத்துக்காட்டுகிறது. மூன்றாவதாக, MNA-ஐ உற்பத்தி செய்யும் நொதியான NNMT-இன் வெளிப்பாடு முக்கியமாக CAF-இல் மட்டுமே காணப்படுகிறது, இது குறைந்த அளவில் கட்டி செல்களாகவும் உள்ளது, ஆனால் கட்டியிலிருந்து பெறப்பட்ட T செல்களில் கண்டறியக்கூடிய MNA அளவுகள் காணப்படுகின்றன. சினைப்பை CAF-ல் NNMT-யின் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு, CAF வளர்சிதை மாற்றம், கட்டி ஊடுருவல் மற்றும் மெட்டாஸ்டாசிஸ் ஆகியவற்றை ஊக்குவிப்பதன் காரணமாக, புற்றுநோயை ஊக்குவிக்கும் விளைவைக் கொண்டிருப்பதாக அறியப்படுகிறது (27). TIL-ன் ஒட்டுமொத்த அளவு மிதமாக இருந்தாலும், CAF-ல் NNMT-யின் வெளிப்பாடு, மோசமான முன்கணிப்புடன் தொடர்புடைய புற்றுநோய் மரபணு அட்லஸ் (TCGA) மெசென்கைமல் துணை வகையுடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது (27, 46, 47). இறுதியாக, MNA சிதைவுக்குப் பொறுப்பான AOX1 நொதியின் வெளிப்பாடும் CAF பாப்புலேஷனுக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது, இது T செல்களுக்கு MNA-வை வளர்சிதை மாற்றம் செய்யும் திறன் இல்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த கண்டுபிடிப்பை சரிபார்க்க மேலும் பணிகள் தேவைப்பட்டாலும், T செல்களில் அதிக அளவு MNA இருப்பது, நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு CAF மைக்ரோஎன்விரான்மென்ட் இருப்பதைக் குறிக்கலாம் என்ற கருத்தை இந்த முடிவுகள் ஆதரிக்கின்றன.
MNA கடத்திகளின் குறைந்த வெளிப்பாட்டு நிலை மற்றும் MNA வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஈடுபட்டுள்ள முக்கியப் புரதங்களின் கண்டறிய முடியாத அளவுகள் ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டால், T செல்களில் MNA இருப்பது எதிர்பாராதது. இரண்டு தனித்தனி குழுக்களின் scRNA-seq பகுப்பாய்வு மற்றும் இலக்கு qPCR மூலம் NNMT அல்லது AOX1 எதையும் கண்டறிய முடியவில்லை. இந்த முடிவுகள், MNA ஆனது T செல்களால் தொகுக்கப்படுவதில்லை, மாறாக சுற்றியுள்ள TME-இலிருந்து உறிஞ்சப்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன. ஆய்வகச் சோதனைகள், T செல்கள் புற MNA-ஐக் குவிக்கும் போக்கைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன.
எங்களின் இன் விட்ரோ ஆய்வுகள், புறவழி MNA ஆனது T செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுவதையும், TNFα ஊக்குவிப்பானுடன் Sp1 இன் பிணைப்பை அதிகரிப்பதையும் காட்டியுள்ளன. TNFα கட்டி எதிர்ப்பு மற்றும் கட்டி எதிர்ப்பு ஆகிய இரண்டு செயல்பாடுகளையும் கொண்டிருந்தாலும், கருப்பை புற்றுநோயில், TNFα கருப்பை புற்றுநோயின் வளர்ச்சியை ஊக்குவிக்கக்கூடும் (31-33). கருப்பை கட்டி செல் வளர்ப்பில் TNFα ஐ நடுநிலையாக்குவது அல்லது எலி மாதிரிகளில் TNFα சமிக்ஞையை நீக்குவது, TNFα-மத்தியஸ்த அழற்சி சைட்டோகைன் உற்பத்தியை மேம்படுத்தி, கட்டி வளர்ச்சியைத் தடுக்கக்கூடும் (32, 35). எனவே, இந்த நிலையில், TME-யிலிருந்து பெறப்பட்ட MNA, ஆட்டோகிரைன் சுழற்சி வழியாக TNFα-சார்ந்த பொறிமுறையின் மூலம் ஒரு அழற்சி சார்பு வளர்சிதை மாற்றப் பொருளாகச் செயல்பட்டு, அதன் மூலம் கருப்பை புற்றுநோய் ஏற்படுவதையும் பரவுவதையும் ஊக்குவிக்கும் (31). இந்த சாத்தியக்கூறின் அடிப்படையில், TNFα தடுப்பு கருப்பை புற்றுநோய்க்கான ஒரு சாத்தியமான சிகிச்சை முகவராக ஆய்வு செய்யப்பட்டு வருகிறது (37, 48, 49). கூடுதலாக, MNA ஆனது கருப்பை கட்டி செல்களுக்கு எதிரான CAR-T செல்களின் செல்நச்சுத்தன்மையைக் குறைக்கிறது, இது MNA-மத்தியஸ்த நோயெதிர்ப்பு ஒடுக்குமுறைக்கு மேலும் சான்றுகளை வழங்குகிறது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், கட்டிகளும் CAF செல்களும் MNA-வை செல்வெளி TME-க்குள் சுரக்கும் ஒரு மாதிரியை முன்வைக்கின்றன. (i) TNF-ஆல் தூண்டப்பட்ட கருப்பை புற்றுநோய் வளர்ச்சித் தூண்டுதல் மற்றும் (ii) MNA-ஆல் தூண்டப்பட்ட T செல் நச்சுத்தன்மை செயல்பாட்டுத் தடுப்பு ஆகியவற்றின் மூலம், இது ஒரு இரட்டைக் கட்டி விளைவைக் கொண்டிருக்கலாம் (படம் 5D).
முடிவாக, விரைவான செல் செறிவூட்டல், ஒற்றை-செல் வரிசைப்படுத்தல் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற விவரக்குறிப்பு ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், இந்த ஆய்வு HGSC நோயாளிகளின் கட்டிகளுக்கும் வயிற்று நீர்க்கோவை செல்களுக்கும் இடையே உள்ள மிகப்பெரிய நோயெதிர்ப்பு வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. இந்த விரிவான பகுப்பாய்வு, T செல்களுக்கு இடையே குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் வேறுபாடுகள் இருப்பதைக் காட்டியதுடன், MNA-வை ஒரு செல்-சாராத நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குபடுத்தும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருளாக அடையாளம் கண்டது. இந்தத் தரவுகள், மனிதப் புற்றுநோய்களில் TME எவ்வாறு T செல் வளர்சிதை மாற்றத்தைப் பாதிக்கிறது என்பதில் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகின்றன. T செல்களுக்கும் புற்றுநோய் செல்களுக்கும் இடையே ஊட்டச்சத்துக்களுக்கான நேரடிப் போட்டி பதிவாகியிருந்தாலும், வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் கட்டியின் வளர்ச்சியை ஊக்குவிக்கவும், உள்ளார்ந்த நோயெதிர்ப்புத் துலங்கல்களை அடக்கவும் மறைமுக ஒழுங்குபடுத்திகளாகவும் செயல்படக்கூடும். இந்த ஒழுங்குபடுத்தும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் செயல்பாட்டுப் பங்கைப் பற்றிய மேலதிக விளக்கம், கட்டிக்கு எதிரான நோயெதிர்ப்புத் துலங்கலை மேம்படுத்துவதற்கான மாற்று உத்திகளுக்கு வழிவகுக்கலாம்.
கனடிய திசு களஞ்சிய வலையமைப்பால் சான்றளிக்கப்பட்ட BC புற்றுநோய் கட்டி திசு களஞ்சியத்தின் மூலம் நோயாளியின் மாதிரிகள் மற்றும் மருத்துவத் தரவுகள் பெறப்பட்டன. BC புற்றுநோய் ஆராய்ச்சி நெறிமுறைக் குழு மற்றும் பிரிட்டிஷ் கொலம்பியா பல்கலைக்கழகத்தால் (H07-00463) அங்கீகரிக்கப்பட்ட நெறிமுறையின்படி, அனைத்து நோயாளிகளின் மாதிரிகள் மற்றும் மருத்துவத் தரவுகளுக்கு, தகவலறிந்த எழுத்துப்பூர்வ ஒப்புதல் பெறப்பட்டது அல்லது அவர்கள் தங்கள் ஒப்புதலை முறையாகத் துறந்தனர். இந்த மாதிரிகள் சான்றளிக்கப்பட்ட பயோபேங்கில் (BRC-00290) சேமிக்கப்பட்டுள்ளன. நோயாளியின் விரிவான பண்புகள் அட்டவணைகள் S1 மற்றும் S5-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. உறைபதனப் பாதுகாப்பிற்காக, நோயாளியின் கட்டி மாதிரியை இயந்திர முறையில் சிதைக்க ஒரு அறுவைக்கத்தி பயன்படுத்தப்படுகிறது, பின்னர் ஒற்றை செல் கூழ்மத்தைப் பெறுவதற்காக அது 100-மைக்ரான் வடிகட்டி வழியாகச் செலுத்தப்படுகிறது. செல்களைத் திரட்டி மேல்திரவத்தை அகற்றுவதற்காக, நோயாளியின் வயிற்று நீர் 4°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 1500 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. கட்டி மற்றும் வயிற்று நீர்க்கோவையிலிருந்து பெறப்பட்ட செல்கள், 50% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட மனித AB சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்), 40% RPMI-1640 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 10% டைமெத்தில் சல்ஃபாக்சைடு ஆகியவற்றில் உறைநிலையில் பாதுகாக்கப்பட்டன. இவ்வாறு பாதுகாக்கப்பட்ட ஒற்றைச் செல் கூழ்மங்கள் உருக்கப்பட்டு, கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ள வளர்சிதை மாற்றவியல் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றப் பொருள் நிர்ணயத்திற்காகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
முழுமையான ஊடகமானது 0.22 μm வடிகட்டப்பட்ட 50:50 விகிதத்தில் சேர்க்கப்பட்ட RPMI 1640: AimV-ஐக் கொண்டுள்ளது. RPMI 1640 + 2.05 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) உடன் 10% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட மனித AB சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்), 12.5 mM ஹெப்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்), 2 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்), 1 x பென்சிலின் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (பென்ஸ்ட்ரெப்) கரைசல் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 50 μMB-மெர்காப்டோஎத்தனால் ஆகியவை சேர்க்கப்பட்டுள்ளன. AimV (இன்விட்ரோஜென்) உடன் 20 mM ஹெப்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 2 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஆகியவை சேர்க்கப்பட்டுள்ளன. ஃப்ளோ சைட்டோமீட்டர் சாயமேற்றல் தாங்கல் கரைசலானது, 3% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட AB மனித சீரம் (சிக்மா) சேர்க்கப்பட்ட 0.22μm வடிகட்டப்பட்ட பாஸ்பேட் தாங்கல் உப்புக்கரைசலைக் (PBS; இன்விட்ரோஜென்) கொண்டிருந்தது. செல் செறிவூட்டல் தாங்கல் கரைசலானது, 0.5% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட AB மனித சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சேர்க்கப்பட்ட 0.22μm வடிகட்டப்பட்ட PBS-ஐக் கொண்டு உருவாக்கப்பட்டது.
37°C முழுமையான ஊடகத்தில், செல்கள் 10 nM MT DR மற்றும் 100 μM 2-NBDG கொண்டு 30 நிமிடங்களுக்குச் சாயமிடப்பட்டன. அடுத்து, செல்கள் 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு eF506 உயிர்வாழ்திறன் சாயம் கொண்டு சாயமிடப்பட்டன. செல்களை FC Block (eBioscience) மற்றும் Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ஆகியவற்றில் மீண்டும் கரைத்து, ஃப்ளோ சைட்டோமீட்டர் சாயமிடும் தாங்கல் கரைசலில் (உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி) நீர்த்து, அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும். ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி சாயமிடும் தாங்கல் கரைசலில் 4°C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு ஒரு தொகுதி ஆன்டிபாடிகளைக் (அட்டவணை S2) கொண்டு செல்களுக்குச் சாயமிடவும். பகுப்பாய்வுக்கு முன், செல்களை ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி சாயமிடும் தாங்கல் கரைசலில் (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R கட்டமைப்பு) மீண்டும் கரைக்கவும். செல் எண்ணிக்கைத் தரவைப் பகுப்பாய்வு செய்ய SpectroFlo மற்றும் FlowJo V10-ஐயும், தரவை உருவாக்க GraphPad Prism 8-ஐயும் பயன்படுத்தவும். 2-NBDG மற்றும் MT DR-இன் இடைநிலை ஒளிர்தல் செறிவு (MFI) மடக்கை இயல்பாக்கம் செய்யப்பட்டது, பின்னர் பொருத்தப்பட்ட நோயாளிகளைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்வதற்காக புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்விற்கு இணைக்கப்பட்ட t சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டது. 40-க்கும் குறைவான நிகழ்வுகளைக் கொண்ட அனைத்துத் தொகுதிகளையும் பகுப்பாய்விலிருந்து நீக்கவும்; புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வு மற்றும் தரவுக் காட்சிப்படுத்தலைச் செய்வதற்கு முன், ஏதேனும் எதிர்மறை மதிப்புகளுக்கு MFI மதிப்பாக 1-ஐ உள்ளிடவும்.
மேலே உள்ள செயல்முறை பேனலின் கைமுறை கேட்டிங் உத்தியை நிரப்புவதற்காக, ஃப்ளோஜோவில் இறந்த செல்களை நீக்கிய பிறகு, செல்களை தானாகவே பாப்புலேஷனுக்கு ஒதுக்க, வடிவ கட்டுப்பாட்டு மரம் (FAUST) (21) மூலம் முழுமையான குறிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தினோம். தவறாக ஒதுக்கப்பட்டதாகத் தோன்றும் பாப்புலேஷன்களையும் (PD1+ மற்றும் PD1- கட்டி செல்களை இணைத்தல்) மற்றும் தக்கவைக்கப்பட்ட பாப்புலேஷன்களையும் ஒன்றிணைக்க, வெளியீட்டை நாங்கள் கைமுறையாக நிர்வகிக்கிறோம். ஒவ்வொரு மாதிரியும் சராசரியாக 2% க்கும் அதிகமான செல்களைக் கொண்டுள்ளது, மொத்தம் 11 பாப்புலேஷன்கள் உள்ளன.
லியூகோசைட் பிரிப்புப் பொருட்களிலிருந்து PBMC-ஐப் பிரிக்க ஃபிகால் கிரேடியன்ட் அடர்த்தி சென்ட்ரிஃபியூகேஷன் பயன்படுத்தப்பட்டது (ஸ்டெம்செல் டெக்னாலஜிஸ்). CD8 மைக்ரோபீட்ஸை (மில்டெனி) பயன்படுத்தி PBMC-இலிருந்து CD8+ T செல்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி 2 வாரங்களுக்கு டிரான்ஸ்ஆக்ட் (மில்டெனி) பயன்படுத்தி முழுமையான ஊடகத்தில் பெருக்கப்பட்டன. IL-7 (10 ng/ml; பெப்ரோடெக்) கொண்ட முழுமையான ஊடகத்தில் செல்கள் 5 நாட்களுக்கு நிற்க அனுமதிக்கப்பட்டு, பின்னர் டிரான்ஸ்ஆக்ட் மூலம் மீண்டும் தூண்டப்பட்டன. 7-ஆம் நாளில், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, மனித CD45 மைக்ரோபீட்ஸ் (மில்டெனி) மூன்று தொடர்ச்சியான சுற்றுகளில் செல்களைச் செறிவூட்டப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி பகுப்பாய்விற்காக (மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி) செல்கள் சிறு பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டன, மேலும் LC-MS/MS பகுப்பாய்விற்காக ஒரு மில்லியன் செல்கள் மூன்று முறை சிறு பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி LC-MS/MS மூலம் செயலாக்கப்பட்டன. 1,000 அயனி எண்ணைக் கொண்டு விடுபட்ட மெட்டபாலிட் மதிப்பை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். ஒவ்வொரு மாதிரியும் மொத்த அயனி எண்ணிக்கையால் (TIC) இயல்பாக்கப்பட்டு, மடக்கையாக மாற்றப்பட்டு, பகுப்பாய்விற்கு முன் MetaboAnalystR இல் தானாகவே இயல்பாக்கப்படுகிறது.
ஒவ்வொரு நோயாளியின் ஒற்றை செல் சஸ்பென்ஷனும் உருக வைக்கப்பட்டு, 40 μm வடிகட்டி வழியாக முழுமையான ஊடகத்தில் (மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி) வடிகட்டப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, CD8+, CD4+ மற்றும் CD45- செல்களுக்காக மாதிரிகளைச் செறிவூட்டுவதற்கு, மைக்ரோபீட்ஸை (மில்டெனி) பயன்படுத்தி காந்த மணி பிரிப்பு மூலம் மூன்று தொடர்ச்சியான நேர்மறைத் தேர்வுச் சுற்றுகள் (பனிக்கட்டியில்) பயன்படுத்தப்பட்டன. சுருக்கமாக, செல்கள் செல் செறிவூட்டல் பஃபரில் (மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி) மீண்டும் சஸ்பென்ஷன் செய்யப்பட்டு எண்ணப்படுகின்றன. செல்கள் மனித CD8 மணிகள், மனித CD4 மணிகள் அல்லது மனித CD45 மணிகளுடன் (மில்டெனி) 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் செல் செறிவூட்டல் பஃபரால் கழுவப்பட்டன. மாதிரி LS காலம் (மில்டெனி) வழியாகச் செலுத்தப்பட்டு, நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறைப் பகுதிகள் சேகரிக்கப்படுகின்றன. கால அளவைக் குறைக்கவும், செல் மீட்புப் படியை அதிகரிக்கவும், CD8-பகுதி பின்னர் CD4+ செறிவூட்டலின் இரண்டாவது சுற்றுக்கும், CD4-பகுதி அதைத் தொடர்ந்த CD45-செறிவூட்டலுக்கும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. பிரித்தெடுக்கும் செயல்முறை முழுவதும் கரைசலைப் பனிக்கட்டியில் வைக்கவும்.
வளர்சிதை மாற்றப் பகுப்பாய்விற்கான மாதிரிகளைத் தயாரிக்க, செல்கள் பனிக்கட்டி குளிர் உப்பு கரைசலால் ஒருமுறை கழுவப்பட்டன, மேலும் ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் 1 மிலி 80% மெத்தனால் சேர்க்கப்பட்டு, பின்னர் சுழற்றி கலக்கப்பட்டு திரவ நைட்ரஜனில் உடனடியாக உறையவைக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் மூன்று உறைதல்-உருகுதல் சுழற்சிகளுக்கு உட்படுத்தப்பட்டு, 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 14,000 rpm வேகத்தில் மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டன. வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைக் கொண்ட மேல்கரைசல் உலரும் வரை ஆவியாக்கப்பட்டது. வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள் 50 மைக்ரோலிட்டர் 0.03% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, கலப்பதற்காக சுழற்றி கலக்கப்பட்டு, பின்னர் சிதைவுகளை அகற்ற மையவிலக்கி சுழற்றப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைப் பிரித்தெடுக்கவும். வளர்சிதை மாற்றவியல் ஆராய்ச்சிக்காக, மேற்புற திரவத்தை உயர் செயல்திறன் திரவ நிறப்பிரிகை பாட்டிலுக்கு மாற்றவும். தொகுதி விளைவுகளைத் தடுக்க, ஒவ்வொரு மாதிரியையும் ஏறக்குறைய சம எண்ணிக்கையிலான செல்களுடன் கையாள ஒரு சமவாய்ப்பு சிகிச்சை நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தவும். AB SCIEX QTRAP 5500 டிரிபிள் குவாட்ரூபோல் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (50) முன்னர் வெளியிடப்பட்ட உலகளாவிய வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் தரமான மதிப்பீட்டை நாங்கள் செய்தோம். மல்டிகுவாண்ட் பதிப்பு 2.1 மென்பொருளைப் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் SCIEX) பயன்படுத்தி நிறப்பிரிகை பகுப்பாய்வு மற்றும் உச்சப் பகுதி ஒருங்கிணைப்பு செய்யப்பட்டன.
விடுபட்ட மெட்டபாலிட் மதிப்பை மதிப்பிடுவதற்கு 1000 அயனி எண்ணிக்கை பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் மாதிரி செயலாக்கத்திலிருந்து கருவி பகுப்பாய்வினால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட மாற்றங்களைச் சரிசெய்ய, கண்டறியப்பட்ட ஒவ்வொரு மெட்டபாலிட்டின் இயல்பாக்கப்பட்ட உச்சப் பரப்பைக் கணக்கிட ஒவ்வொரு மாதிரியின் TIC பயன்படுத்தப்பட்டது. TIC இயல்பாக்கப்பட்ட பிறகு, மடக்கை மாற்றம் மற்றும் தானியங்கி நெறிமுறை வரி அளவிடுதலுக்காக MetaboAnalystR(51) (இயல்புநிலை அளவுரு) பயன்படுத்தப்படுகிறது. மாதிரி வகைகளுக்கு இடையிலான மெட்டபாலோம் வேறுபாடுகளின் ஆய்வுப் பகுப்பாய்வைச் செய்ய, நாங்கள் வீகன் R தொகுப்புடன் PCA-ஐப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் நோயாளிகளைப் பகுப்பாய்வு செய்ய பகுதி மிகை பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தினோம். மாதிரிகளுக்கு இடையிலான யூக்ளிடியன் தூரத்தைக் குழுவாக்க, வெப்ப வரைபட டென்ட்ரோகிராமை உருவாக்க வார்டு முறையைப் பயன்படுத்தவும். முழு செல் வகை மற்றும் நுண்சூழல் முழுவதும் வேறுபட்ட அளவில் உள்ள மெட்டபாலிட்களை அடையாளம் காண, தரப்படுத்தப்பட்ட மெட்டபாலிட் மிகுதியில் லிம்மா (52)-ஐப் பயன்படுத்தினோம். விளக்கத்தை எளிதாக்குவதற்காக, மாதிரியைக் குறிப்பிட குழு சராசரி அளவுருவைப் பயன்படுத்துகிறோம், மேலும் நுண்சூழலில் உள்ள செல் வகைகளை ஒவ்வொரு குழுவாகவும் (n = 6 குழுக்கள்) கருதுகிறோம்; முக்கியத்துவச் சோதனைக்காக, ஒவ்வொரு வளர்சிதை மாற்றப் பொருளுக்கும் மூன்று முறை மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகளைச் செய்தோம். தவறான நகலெடுப்பைத் தவிர்ப்பதற்காக, லிம்மா வடிவமைப்பில் நோயாளி ஒரு தடையாகச் சேர்க்கப்பட்டார். வெவ்வேறு நோயாளிகளுக்கிடையிலான வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் வேறுபாடுகளைச் சரிபார்க்க, நோயாளிகளை ஒரு நிலையான முறையில் உள்ளடக்கி லிம்மா மாதிரியைச் சரிசெய்தோம். செல் வகைக்கும் நுண்சூழலுக்கும் இடையே முன்வரையறுக்கப்பட்ட மாறுபாட்டின் முக்கியத்துவத்தை Padj <0.05 (பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் திருத்தம்) என நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம்.
மில்டெனி இறந்த செல் அகற்றும் கருவியைப் பயன்படுத்தி (80% க்கும் அதிகமான உயிர்வாழும் திறன்) உயிர்ச்சக்தி செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு, 10x 5′ மரபணு வெளிப்பாட்டு நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி, மொத்த உயிருள்ள உறைந்த வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி மாதிரிகளில் ஒற்றை-செல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் வரிசைப்படுத்தல் செய்யப்பட்டது. ஒத்த கட்டிகள் மற்றும் வயிற்று நீர்க்கோவை கொண்ட ஐந்து நிகழ்வுகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, இருப்பினும் ஒரு கட்டி மாதிரியின் குறைந்த உயிர்வாழும் திறன் அதைச் சேர்ப்பதைத் தடுத்தது. நோயாளிகளின் பல தேர்வுகளை அடைவதற்காக, நாங்கள் ஒவ்வொரு நோயாளியின் மாதிரிகளையும் 10x குரோமியம் கட்டுப்படுத்தியின் தடங்களில் இணைத்து, வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி இடங்களைத் தனித்தனியாகப் பகுப்பாய்வு செய்தோம். வரிசைப்படுத்தலுக்குப் பிறகு [இலுமினா ஹைசீக் 4000 28×98 bp இணை முனை (PE), கியூபெக் மரபணுத்தொகுதி; கட்டி மற்றும் அசைட்ஸ்க்கு முறையே ஒரு செல்லுக்கு சராசரியாக 73,488 மற்றும் 41,378 ரீட்ஸ்]], நாங்கள் CellSNP மற்றும் Vireo (53) ஐப் பயன்படுத்தினோம் (GLRCh38 ஆல் வழங்கப்படும் பொதுவான மனித SNP (VCF) ஒரு நன்கொடையாளர் அடையாளத்தை ஒதுக்குகிறது. ஒதுக்கப்படாத செல்கள் மற்றும் டூப்ளெக்ஸ்கள் என அடையாளம் காணப்பட்ட செல்கள் மற்றும் அசைட்ஸ் மற்றும் கட்டி மாதிரிகளுக்கு இடையில் பொருந்தும் நன்கொடையாளர்களைத் தவிர்த்து, நோயாளியின் மரபணு நிலையின் (IBS) நெருங்கிய அடையாளத்தை (IBS) ஊகிப்பதற்கு நாங்கள் SNPRelate ஐப் பயன்படுத்துகிறோம் (54). இந்தப் பணியின் அடிப்படையில், கட்டி மற்றும் அசைட்ஸில் அதிக செல் பிரதிநிதித்துவம் கொண்ட மூன்று நிகழ்வுகளை அடுத்தகட்ட பகுப்பாய்விற்காக நாங்கள் தக்க வைத்துக் கொண்டோம். scater (55) மற்றும் scran (56) BioConductor பேக்கேஜிங்கில் ஒரு மாஸ் ஃபில்ட்ரேஷன் படிநிலையைச் செய்த பிறகு, இது பகுப்பாய்விற்காக 6975 செல்களை (கட்டி மற்றும் அசைட்ஸிலிருந்து முறையே 2792 மற்றும் 4183 செல்கள்) அளித்தது. ஜக்கார்ட் தூரத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட பகிரப்பட்ட அருகிலுள்ள அண்டை நெட்வொர்க்கின் (SNN) igraph இன் (57) லூவைன் கிளஸ்டரிங்கைப் பயன்படுத்துகிறோம். வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் செல்களைக் குழுவாக்க. குறிப்பான் மரபணு வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் குழுக்கள் சாத்தியமான செல் வகைகளாகக் கைமுறையாகக் குறிக்கப்பட்டு t-SNE மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. குறைந்த ரைபோசோமல் புரத வெளிப்பாடு கொண்ட துணைக்குழுக்களைத் தவிர்த்து, CD8A மற்றும் GZMA வெளிப்பாட்டின் மூலம் சைட்டோடாக்ஸிக் T செல்கள் வரையறுக்கப்படுகின்றன. இசார் மற்றும் குழுவினரின் (16) வெளியிடப்பட்ட தரவை நாங்கள் அணுகினோம், அவர்களின் t-SNE உட்பொதித்தல் உட்பட, நோயெதிர்ப்பு செல் குறிப்பான்கள் மற்றும் NNMT வெளிப்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான வெளிப்பாடு ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்வதைக் கட்டுப்படுத்த முடியும்.
ஃபிகால் கிரேடியன்ட் அடர்த்தி மையவிலக்கு முறை மூலம் லியூகோசைட் பிரிப்புப் பொருட்களிலிருந்து (ஸ்டெம்செல் டெக்னாலஜிஸ்) பிபிஎம்சி-க்கள் பிரிக்கப்பட்டன. சிடி3 மணிகளை (மில்டெனி) பயன்படுத்தி பிபிஎம்சி-க்களிலிருந்து சிடி3+ செல்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. எம்என்ஏ-வின் முன்னிலையில் அல்லது அதன் இல்லாமையில், தட்டுடன் பிணைக்கப்பட்ட சிடி3 (5μg/ml), கரையக்கூடிய சிடி28 (3μg/ml) மற்றும் ஐஎல்-2 (300 U/ml; புரோலூகின்) ஆகியவற்றைக் கொண்டு சிடி3+ செல்கள் தூண்டப்பட்டன. விரிவாக்கத்தின் கடைசி நாளில், உயிர்வாழும் தன்மை (ஃபிக்ஸபிள் வயபிலிட்டி டை இஃப்ளூர்450, இபயோசயின்ஸ்) மற்றும் பெருக்கம் (123 எண்ணிக்கை இபீட்ஸ், தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஆகியவை ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன. கோல்ஜிஸ்டாப் (GolgiStop) உடன் PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1μg/ml) கொண்டு 4 மணி நேரம் செல்களைத் தூண்டி, அவற்றின் செயல்திறன் செயல்பாட்டை மதிப்பிடவும். மேலும், CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) மற்றும் TNFα-ஃப்ளோரசெய்ன் ஐசோதியோசயனேட் (FITC) (MAb11, BD) ஆகியவற்றைக் கண்காணிக்கவும். qPCR மற்றும் ChIP செல்களை PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1μg/ml) கொண்டு 4 மணி நேரம் தூண்டவும். ELISA சூப்பர்நேட்டன்ட், PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1 μg/ml) கொண்டு 4 மணி நேரம் தூண்டுவதற்கு முன்னும் பின்னும் சேகரிக்கப்பட்டது.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தி RNA ஐப் பிரித்தெடுக்க உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையைப் பின்பற்றவும். மாதிரியை ஒருபடித்தாக்க QIAshredder (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தவும். நிரப்பு DNA (cDNA) ஐ தொகுக்க உயர்-திறன் RNA to cDNA கிட் (Thermo Fisher Scientific) ஐப் பயன்படுத்தவும். பின்வரும் ஆய்விகளுடன் மரபணு வெளிப்பாட்டை (உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி) அளவிட TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ஐப் பயன்படுத்தவும்: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] மற்றும் Hs01010726_m1 (SLC22A2). மாதிரிகள், மைக்ரோஆம்ப் ஆப்டிகல் ஃபிலிம் கொண்ட மைக்ரோஆம்ப் ஃபாஸ்ட் ஆப்டிகல் 96-வெல் ரியாக்ஷன் பிளேட்டில் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்), ஸ்டெப்ஒன்பிளஸ் ரியல்-டைம் பிசிஆர் சிஸ்டத்தில் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்) பரிசோதிக்கப்பட்டன. 35-ஐத் தாண்டும் எந்தவொரு Ct மதிப்பும் கண்டறியும் வரம்பிற்கு மேல் உள்ளதாகக் கருதப்பட்டு, கண்டறிய முடியாததாகக் குறிக்கப்படுகிறது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி (58) ChIP-ஐ செய்யவும். சுருக்கமாக, செல்கள் ஃபார்மால்டிஹைடுடன் (இறுதி செறிவு 1.42%) சிகிச்சையளிக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன. துணை வீக்க இடையகத்தை (25 mM ஹெப்ஸ், 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl மற்றும் 0.1% NP-40) பனிக்கட்டியில் 10 நிமிடங்கள் பயன்படுத்தவும், பின்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி (58) இம்யூனோபிரெசிபிடேஷன் இடையகத்தில் மீண்டும் இடைநிறுத்தவும். பின்னர் மாதிரி பின்வரும் சுழற்சிகளுடன் சோனிகேட் செய்யப்பட்டது: 10 சுழற்சிகள் (20 1-வினாடி துடிப்புகள்) மற்றும் 40 வினாடிகளின் நிலையான நேரம். ChIP-தர இம்யூனோகுளோபுலின் G (செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி; 1μl), ஹிஸ்டோன் H3 (செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி; 3μl), NFAT (இன்விட்ரோஜென்; 3μl) மற்றும் SP1 (செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி; 3μl) ஆன்டிபாடிகளை மாதிரியுடன் 4°CC-ல் இரவு முழுவதும் குலுக்கி அடைகாக்கவும். புரோட்டீன் A மணிகளை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மாதிரியுடன் 4°C வெப்பநிலையில், ஒரு மணி நேரம் மெதுவாகக் குலுக்கியவாறு அடைகாக்கவும். பின்னர், டிஎன்ஏ-வை செறிவூட்ட செலெக்ஸ் மணிகளையும் (பயோ-ராட்), புரதச் செரிமானத்திற்கு புரோட்டினேஸ் K-வையும் (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தவும். TNFα புரோமோட்டர் PCR மூலம் கண்டறியப்பட்டது: முன்னோக்கி, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; இதற்கு மாறாக, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp தயாரிப்பு). படங்கள் இமேஜ் லேப் (பயோ-ராட்) மூலம் உருவாக்கப்பட்டு, இமேஜ்ஜே மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி செல் வளர்ப்பு மேல்திரவம் சேகரிக்கப்பட்டது. மனித TNFα ELISA கிட் (இன்விட்ரோஜென்), மனித IL-2 ELISA கிட் (இன்விட்ரோஜென்) மற்றும் மனித IFN-γ ELISA கிட் (அப்காம்) ஆகியவற்றின் உற்பத்தியாளரின் செயல்முறைகளின்படி இந்த நிர்ணயம் மேற்கொள்ளப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, TNFα மற்றும் IL-2-ஐக் கண்டறிய மேல்திரவம் 1:100 என்ற விகிதத்திலும், IFN-γ-ஐக் கண்டறிய 1:3 என்ற விகிதத்திலும் நீர்க்கப்பட்டது. 450 nm-இல் உறிஞ்சுதலை அளவிட EnVision 2104 மல்டிலேபிள் ரீடரை (பெர்கின்எல்மர்) பயன்படுத்தவும்.
ஃபிகால் கிரேடியன்ட் அடர்த்தி மையவிலக்கு முறை மூலம் லியூகோசைட் பிரிப்புப் பொருட்களிலிருந்து (ஸ்டெம்செல் டெக்னாலஜிஸ்) பிபிஎம்சி பிரிக்கப்பட்டது. சிடி3 மணிகளை (மில்டெனி) பயன்படுத்தி பிபிஎம்சியிலிருந்து சிடி3+ செல்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. எம்என்ஏ முன்னிலையில் அல்லது அதன் இல்லாமையில், தட்டுடன் பிணைக்கப்பட்ட சிடி3 (5μg/ml), கரையக்கூடிய சிடி28 (3μg/ml) மற்றும் ஐஎல்-2 (300 U/ml; புரோலூகின்) ஆகியவற்றைக் கொண்டு 3 நாட்களுக்கு சிடி3+ செல்கள் செயல்படுத்தப்பட்டன. 3 நாட்களுக்குப் பிறகு, செல்கள் சேகரிக்கப்பட்டு 0.9% உப்புக்கரைசலால் கழுவப்பட்டன, மேலும் வீழ்படிவு உடனடியாக உறைய வைக்கப்பட்டது. 123கவுண்ட் ஈபீட்ஸைப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி (சைடெக் அரோரா; 3L-16V-14B-8R கட்டமைப்பு) மூலம் செல் எண்ணிக்கை மேற்கொள்ளப்பட்டது.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைப் பிரித்தெடுக்கவும். உலர்ந்த சாறு 4000 செல் சமமானவை/μl என்ற செறிவில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டது. தலைகீழ்-கட்ட நிறப்பிரிகை (1290 இன்ஃபினிட்டி II, அஜிலென்ட் டெக்னாலஜிஸ், சாண்டா கிளாரா, CA) மற்றும் CORTECS T3 நெடுவரிசை (2.1×150 மிமீ, துகள் அளவு 1.6-μm, துளை அளவு 120-Å; #186008500, வாட்டர்ஸ்) ஆகியவற்றைக் கொண்டு மாதிரியைப் பகுப்பாய்வு செய்யவும். துருவ நிறை நிறமாலைமானி (6470, அஜிலென்ட்), இதில் எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் நேர்மறை பயன்முறையில் செயல்படுகிறது. நகரும் கட்டம் A என்பது 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் (H2O-வில்), நகரும் கட்டம் B என்பது 90% அசிட்டோநைட்ரைல், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம். LC கிரேடியன்ட் 100% A-க்கு 0 முதல் 2 நிமிடங்கள் வரையிலும், 99% B-க்கு 2 முதல் 7.1 நிமிடங்கள் வரையிலும், மற்றும் 99% B-க்கு 7.1 முதல் 8 நிமிடங்கள் வரையிலும் ஆகும். பின்னர், 0.6 மிலி/நிமிடம் என்ற பாய்வு விகிதத்தில் 3 நிமிடங்களுக்கு மொபைல் ஃபேஸ் A உடன் காலத்தை மீண்டும் சமநிலைப்படுத்தவும். பாய்வு விகிதம் 0.4 மிலி/நிமிடம் ஆகும், மற்றும் காலம் சேம்பர் 50°C-க்கு சூடுபடுத்தப்படுகிறது. தக்கவைப்பு நேரம் (RT) மற்றும் உருமாற்றத்தை (RT = 0.882 நிமிடங்கள், உருமாற்றம் 1 = 137→94.1, உருமாற்றம் 2 = 137→92, உருமாற்றம் 3 = 137→78) நிறுவ MNA-வின் தூய வேதியியல் தரநிலையை (M320995, டொராண்டோ ரிசர்ச் கெமிக்கல் கம்பெனி, நார்த் யார்க், ஒன்டாரியோ, கனடா) பயன்படுத்தவும். மூன்று உருமாற்றங்களும் சரியான தக்கவைப்பு நேரத்தில் நிகழும்போது, ​​குறிப்பிட்ட தன்மையை உறுதிப்படுத்த அளவீட்டிற்கு உருமாற்றம் 1 பயன்படுத்தப்படுகிறது. MNA-வின் (டொராண்டோ ரிசர்ச் கெமிக்கல் கம்பெனி) தரநிலை வளைவானது, மூலக் கரைசலை (1 மி.கி/மி.லி) ஆறு முறை தொடர்ச்சியாக நீர்த்துப்போகச் செய்து, முறையே 0.1, 1.0, 10 மற்றும் 100 ng/ml மற்றும் 1.0 மற்றும் 10μg/ml திரவத் தரநிலைகளைப் பெறுவதன் மூலம் உருவாக்கப்பட்டது. கண்டறியும் வரம்பு 1 ng/ml ஆகும், மற்றும் நேரியல் துலங்கல் 10 ng/ml மற்றும் 10μg/ml-க்கு இடையில் உள்ளது. LC/MS பகுப்பாய்விற்காக, மாதிரி மற்றும் தரநிலையின் இரண்டு மைக்ரோலிட்டர் கொண்ட ஒவ்வொரு உட்செலுத்தலும் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் பகுப்பாய்வு தளத்தின் நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு எட்டு உட்செலுத்தல்களுக்கும் ஒரு கலப்பு தரக் கட்டுப்பாட்டு மாதிரி இயக்கப்படுகிறது. MNA-வால் பதப்படுத்தப்பட்ட அனைத்து செல் மாதிரிகளின் MNA துலங்கல்களும் மதிப்பீட்டின் நேரியல் வரம்பிற்குள் இருந்தன. தரவுப் பகுப்பாய்வானது MassHunter அளவுசார் பகுப்பாய்வு மென்பொருளைப் (v9.0, Agilent) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.
இரண்டாம் தலைமுறை αFR-CAR கட்டமைப்பு சாங் மற்றும் பலரிடமிருந்து (59) எடுக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, இந்த கட்டமைப்பில் பின்வரும் உள்ளடக்கங்கள் உள்ளன: CD8a லீடர் வரிசை, மனித αFR-குறிப்பிட்ட ஒற்றை-சங்கிலி மாறுபடும் துண்டு, CD8a கீல் மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் பகுதி, CD27 இன்ட்ராசெல்லுலார் டொமைன் மற்றும் CD3z இன்ட்ராசெல்லுலார் டொமைன். முழுமையான CAR வரிசை ஜென்ஸ்கிரிப்ட் மூலம் தொகுக்கப்பட்டது, பின்னர் டிரான்ஸ்டக்ஷன் செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் GFP எக்ஸ்பிரஷன் கேசட்டிற்கு மேலே இரண்டாம் தலைமுறை லென்டிவைரல் எக்ஸ்பிரஷன் வெக்டரில் குளோன் செய்யப்பட்டது.
லென்டிவைரஸ், 10% கரு மாட்டு சீரம் (FBS) மற்றும் 1% பென்ஸ்ட்ரெப் கொண்ட டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள் ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட HEK293T செல்களை [அமெரிக்கன் டைப் கல்ச்சர் கலெக்ஷன் (ATCC)] டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் செய்வதன் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது. மேலும், CAR-GFP வெக்டர் மற்றும் லிப்போஃபெக்ஷன் அமீன் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) பயன்படுத்தப்படும் பேக்கேஜிங் பிளாஸ்மிடுகள் (psPAX2 மற்றும் pMD2.G, Addgene) பயன்படுத்தப்படுகின்றன. டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷனுக்குப் பிறகு 48 மற்றும் 72 மணிநேரங்களில் வைரஸ் அடங்கிய சூப்பர்நேட்டன்ட் சேகரிக்கப்பட்டு, வடிகட்டப்பட்டு, அல்ட்ராசென்ட்ரிஃபியூகேஷன் மூலம் அடர்த்தியாக்கப்பட்டது. அடர்த்தியாக்கப்பட்ட வைரஸ் சூப்பர்நேட்டன்ட்டை டிரான்ஸ்டக்ஷன் செய்யப்படும் வரை -80°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கவும்.
ஆரோக்கியமான கொடையாளரின் லியூகோசைட் பிரிப்புப் பொருட்களிலிருந்து (STEMCELL Technologies) ஃபிகால் கிரேடியன்ட் அடர்த்தி மையவிலக்கு முறை மூலம் PBMC-கள் பிரிக்கப்படுகின்றன. PBMC-களிலிருந்து CD8+ செல்களைப் பிரித்தெடுக்க, பாசிட்டிவ் செலக்ஷன் CD8 மைக்ரோபீட்ஸ்களை (Miltenyi) பயன்படுத்தவும். T செல்களை TransAct (Miltenyi) மற்றும் TexMACS ஊடகத்தில் [Miltenyi; 3% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட மனித சீரம், 1% PenStrep மற்றும் IL-2 (300 U/ml) சேர்க்கப்பட்டது] தூண்டவும். தூண்டப்பட்ட 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, T செல்கள் லென்டிவைரஸால் டிரான்ஸ்டியூஸ் செய்யப்பட்டன (10⁶ செல்களுக்கு 10 μl செறிவூட்டப்பட்ட வைரஸ் சூப்பர்நேட்டன்ட்). Cytek Aurora-வில் (FSC (ஃபார்வர்ட் ஸ்கேட்டர்)/SSC (சைட் ஸ்கேட்டர்), சிங்லெட், GFP+) டிரான்ஸ்டியூஸ் செய்யப்பட்ட 1 முதல் 3 நாட்களுக்குப் பிறகு, குறைந்தபட்சம் 30% டிரான்ஸ்டியூஷன் செயல்திறனை நிரூபிக்க, செல்களின் GFP வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடவும்.
CAR-T செல்கள், இம்யூனோகல்ட் (ஸ்டெம்செல் டெக்னாலஜிஸ்; 1% பென்ஸ்ட்ரெப் சேர்க்கப்பட்டது) ஊடகத்தில் 24 மணி நேரம் பின்வரும் நிபந்தனைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்டன: சிகிச்சை அளிக்கப்படாத நிலை, 250 μM அடினோசின் அல்லது 10 mM MNA கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட நிலை. முன்சிகிச்சைக்குப் பிறகு, CAR-T செல்கள் PBS கொண்டு கழுவப்பட்டு, 20,000 SK-OV-3 செல்களுடன் [ATCC; மெக்காய் 5A ஊடகத்தில் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) 10% FBS மற்றும் 1% பென்ஸ்ட்ரெப் சேர்க்கப்பட்டு 10:1 என்ற விகிதத்தில்] இணைக்கப்பட்டன. எஃபெக்டர்-டு-டார்கெட் விகிதம் 1 என்பது, சேர்க்கப்பட்ட இம்யூனோகல்ட் ஊடகத்தில் மும்மடங்காகப் பெருக்கப்பட்டது. SK-OV-3 செல்கள் மற்றும் டிஜிட்டலிஸ் சாபோனின் (0.5mg/ml; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) கொண்டு சிதைக்கப்பட்ட SK-OV-3 செல்கள் முறையே எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறைக் கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. 24 மணி நேர இணை வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, மேற்பகுதித் திரவம் சேகரிக்கப்பட்டு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) லாக்டேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (LDH) அளவிடப்பட்டது. LDH மேற்பகுதித் திரவம், LDH பஃபரில் 1:50 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டது. கொல்லும் சதவீதம் பின்வரும் சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது: கொல்லும் சதவீதம் = திருத்தத்தின் சதவீதம் / அதிகபட்ச கொல்லும் விகிதம் x 100%, இதில் திருத்தத்தின் சதவீதம் = இணை வளர்ப்பு - T செல்கள் மட்டும், மற்றும் அதிகபட்ச கொல்லும் விகிதம் = நேர்மறைக் கட்டுப்பாடு - எதிர்மறைக் கட்டுப்பாடு.
உரை அல்லது பொருள்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்விற்காக GraphPad Prism 8, Microsoft Excel அல்லது R v3.6.0-ஐப் பயன்படுத்தவும். ஒரே நோயாளியிடமிருந்து பல மாதிரிகள் (வயிற்று நீர்க்கோவை மற்றும் கட்டி போன்றவை) சேகரிக்கப்பட்டால், பொருத்தமானவாறு இணைக்கப்பட்ட t சோதனையைப் பயன்படுத்துவோம் அல்லது நேரியல் அல்லது பொதுமைப்படுத்தப்பட்ட மாதிரியில் நோயாளியை ஒரு சமவாய்ப்பு விளைவாகச் சேர்ப்போம். வளர்சிதை மாற்றவியல் பகுப்பாய்விற்காக, முக்கியத்துவச் சோதனை மும்முறை செய்யப்படுகிறது.
இந்தக் கட்டுரைக்கான கூடுதல் தகவல்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 என்ற இணைப்பைப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-நான்-கமர்ஷியல் உரிமத்தின் கீழ் விநியோகிக்கப்பட்ட ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரை ஆகும். இந்த உரிமம், இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக இல்லாத வரையிலும், அசல் படைப்பு சரியானது என்ற அடிப்படையிலும், எந்தவொரு ஊடகத்திலும் இதன் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது. மேற்கோள்.
குறிப்பு: நீங்கள் இந்தப் பக்கத்திற்குப் பரிந்துரைக்கும் நபர், இந்த மின்னஞ்சலை அவர்கள் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் அறிந்துகொள்வதற்காக மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் கேட்டுக்கொள்கிறோம். நாங்கள் எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் சேகரிக்க மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளர்தானா என்பதைச் சோதிப்பதற்கும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுப்பதற்கும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
மரிசா கே. கில்கோர் (மரிசா கே. கில்கோர்), சாரா மேக்பெர்சன் (சாரா மேக்பெர்சன்), லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ் (லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ்), அபிகெய்ல் எலி அரிஸ் ஜி. வாட்சன் (எச். வாட்சன்), ஜான் ஸ்டாக் (ஜான் ஸ்டாக்), பிராட் எச். நெல்சன் (டிபிராட் நெல்சன்), ஆர். (ரால்ப் ஜே. டிபெரார்டினிஸ்), ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ் (ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ்), ஃபினாஸ் டி. ஹாமில்டன் (பினியாஸ் டி.
MNA, T செல்களின் நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பிற்குப் பங்களிப்பதோடு, மனிதப் புற்றுநோய்க்கான சிகிச்சையில் ஒரு சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்காகவும் விளங்குகிறது.
மரிசா கே. கில்கோர் (மரிசா கே. கில்கோர்), சாரா மேக்பெர்சன் (சாரா மேக்பெர்சன்), லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ் (லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ்), அபிகெய்ல் எலி அரிஸ் ஜி. வாட்சன் (எச். வாட்சன்), ஜான் ஸ்டாக் (ஜான் ஸ்டாக்), பிராட் எச். நெல்சன் (டிபிராட் நெல்சன்), ஆர். (ரால்ப் ஜே. டிபெரார்டினிஸ்), ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ் (ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ்), ஃபினாஸ் டி. ஹாமில்டன் (பினியாஸ் டி.
MNA, T செல்களின் நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பிற்குப் பங்களிப்பதோடு, மனிதப் புற்றுநோய்க்கான சிகிச்சையில் ஒரு சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்காகவும் விளங்குகிறது.
©2021 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS ஆனது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.