தற்போதைய முகவரி: OX11 0DE, UK, டயமண்ட் பில்டிங், ஹார்வெல் சயின்ஸ் அண்ட் இன்னோவேஷன் பார்க், டயட்கோட், ஆக்ஸ்போர்டுஷையர், UK, டயமண்ட் லைட் சோர்ஸ் கோ., லிமிடெட், எலக்ட்ரானிக் பயோலாஜிக்கல் இமேஜிங் சென்டர்.
எதிர்வினை மைய ஒளி-அறுவடை வளாகம் 1 (RC-LH1) என்பது ஊதா நிற ஒளிச்சேர்க்கை பாக்டீரியாவின் முக்கிய ஒளிச்சேர்க்கை கூறு ஆகும். ரோடோப்சுடோமோனாஸ் பலஸ்ட்ரிஸிலிருந்து RC-LH1 வளாகத்தின் இரண்டு கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி கட்டமைப்புகளை நாங்கள் அறிமுகப்படுத்தினோம். RC-LH114-W வளாகத்தின் 2.65-Å தெளிவுத்திறன் அமைப்பு RC ஐச் சுற்றியுள்ள 14 துணை அலகு LH1 சுழல்களைக் கொண்டுள்ளது, இது புரதம் W ஆல் குறுக்கிடப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் புரதம்-W இல்லாத வளாகம் RC ஆல் சூழப்பட்ட முற்றிலும் RC கலவையாகும். மூடப்பட்ட 16 துணை அலகு LH1 வளையம். இந்த கட்டமைப்புகளின் ஒப்பீடு RC-LH1 வளாகத்தில் குயினோனின் இயக்கவியல் பற்றிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது, இதில் RC QB தளத்தில் குயினோனை பிணைக்கும்போது முன்னர் தீர்மானிக்கப்படாத இணக்க மாற்றங்கள், அத்துடன் துணை குயினோன் பிணைப்பு தளங்களின் இருப்பிடம் ஆகியவை அடங்கும், அவை அவற்றை RC க்கு அனுப்ப உதவுகின்றன. W புரதத்தின் தனித்துவமான அமைப்பு LH1 வளையத்தை மூடுவதைத் தடுக்கிறது, இதன் மூலம் குயினோன்/குயினோலோன் பரிமாற்றத்தை துரிதப்படுத்துவதற்கான ஒரு சேனலை உருவாக்குகிறது.
ஒளிச்சேர்க்கையால் வழங்கப்படும் ஆற்றல் பூமியில் உள்ள அனைத்து உயிர்களையும் தாங்கும், மேலும் இது சூரிய உயிரி தொழில்நுட்பத்திற்கு பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டுள்ளது. உலகளாவிய ஒளிச்சேர்க்கையை ஊக்குவிக்கும் அதே வேளையில், ஊதா நிற ஃபோட்டோட்ரோபிக் பாக்டீரியாக்கள் பல்வேறு ஆற்றல் முறைகள் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற திறன்களையும் வெளிப்படுத்துகின்றன. அவை ஒளிச்சேர்க்கையைத் தவிர்த்து இருட்டில் ஹீட்டோரோட்ரோபிக் பாக்டீரியாவாக வளரலாம், நைட்ரஜன் மற்றும் கார்பன் டை ஆக்சைடை சரிசெய்யலாம், ஹைட்ரஜனை உற்பத்தி செய்யலாம் மற்றும் நறுமண சேர்மங்களை சிதைக்கலாம் (1-3). இந்த செயல்முறைகளுக்கு ஆற்றலை வழங்க, ஒளி விரைவாகவும் திறமையாகவும் வேதியியல் ஆற்றலாக மாற்றப்பட வேண்டும். ஒளி-பொறி ஆண்டெனா வளாகம் ஒளியை உறிஞ்சி சிக்கிய ஆற்றலை எதிர்வினை மையத்திற்கு (RC) மாற்றும்போது இந்த செயல்முறை தொடங்குகிறது, இதன் மூலம் மின்னூட்டப் பிரிப்பைத் தொடங்குகிறது (4 - 7). ஊதா நிற ஃபோட்டோட்ரோபிக் பாக்டீரியாவில் உள்ள ஒளிச்சேர்க்கையின் அடிப்படை அலகு வகை 2 RC ஆல் ஆனது, ஒளி அறுவடை வளாகம் 1 (LH1) ஆல் சூழப்பட்டு, RC-LH1 மைய வளாகத்தை உருவாக்குகிறது. LH1 வளைந்த αβ ஹெட்டோரோடைமர்களின் வரிசையால் உருவாகிறது, அவை ஒவ்வொன்றும் இரண்டு பாக்டீரியா குளோரோபில் (BChl) a மூலக்கூறுகள் மற்றும் ஒன்று அல்லது இரண்டு கரோட்டினாய்டுகளை (8-12) பிணைக்கின்றன. எளிமையான LH1 ஆண்டெனா, RC (9-13) ஐ ஒரு மூடிய வளையத்தில் சுற்றி 16 அல்லது 17 αβ ஹெட்டோரோடைமர்களைக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் மற்ற மைய வளாகங்களில், டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் பெப்டைடுகள் சுற்றியுள்ள LH1 இன் தொடர்ச்சியை குறுக்கிடுகின்றன, இதன் மூலம் RC மற்றும் சைட்டோக்ரோம் bc1 வளாகத்திற்கு இடையே குயினால்/குயினோன் பரவலை ஊக்குவிக்கிறது (11, 13-15). ஊதா நிற ஃபோட்டோட்ரோபிக் தாவரமான ரோடோப்சுடோமோனாஸ் (Rps.) ஒளிச்சேர்க்கையை ஆதரிக்கும் ஆற்றல் மற்றும் எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்தைப் புரிந்து கொள்ளக்கூடிய ஒரு மாதிரி உயிரினமாகும். Rps இன் முதல் படிக அமைப்பு. பலஸ்ட்ரிஸ் RC-LH1 வளாகத்தின் மாதிரியானது RC ஆகும், இது 15 ஹெட்டோரோடைமெரிக் LH1 சுழல்களால் சூழப்பட்டுள்ளது, அவை "புரதம் W" (14) எனப்படும் அறியப்படாத புரதத்தால் குறுக்கிடப்படுகின்றன. புரதம்-W பின்னர் RPA4402 என அடையாளம் காணப்பட்டது, இது மூன்று கணிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிஸ்கள் (TMH) (16) கொண்ட ஒரு வகைப்படுத்தப்படாத 10.5kDa புரதமாகும். RC-L, M (pufL, pufM) மற்றும் LH1α, β (pufA, pufB) துணை அலகுகளை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்களுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் பெயரிடலுடன் ஒத்துப்போகும் வகையில் rpa4402 மரபணு குறியாக்க புரதம் W ஐ pufW என மறுபெயரிட நாங்கள் முன்மொழிகிறோம். சுவாரஸ்யமாக, புரதம்-W RC-LH1 இன் சுமார் 10% இல் மட்டுமே உள்ளது, இது Rps. palustris இரண்டு வெவ்வேறு RC-LH1 வளாகங்களை உருவாக்குகிறது என்பதை வெளிப்படுத்துகிறது. இங்கே, இரண்டு மைய வளாகங்களின் உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட கிரையோ-EM (கிரையோ-EM) கட்டமைப்புகளைப் புகாரளிக்கிறோம், ஒன்று புரதம் W மற்றும் 14 αβ ஹெட்டோரோடைமர்கள், மற்றொன்று புரதம் W மற்றும் மூடிய 16 ஹெட்டோரோடைமர் LH1 வளையம் இல்லாமல். எங்கள் அமைப்பு Rps. palustris இன் RC-LH1 வளாகத்தைப் புரிந்துகொள்வதில் ஒரு படி மாற்றத்தைக் குறிக்கிறது, ஏனெனில் ஒவ்வொரு மாறுபாட்டின் ஒரே மாதிரியான மக்கள்தொகையை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்துள்ளோம், மேலும் ஒவ்வொரு பெப்டைட் மற்றும் பிணைக்கப்பட்ட நிறமிகள் மற்றும் தொடர்புடைய லிப்பிடுகள் மற்றும் குயினோன்களை தெளிவாக ஒதுக்க போதுமான தெளிவுத்திறனைக் கொண்டுள்ளோம். இந்த கட்டமைப்புகளின் ஒப்பீடு, இதுவரை வேறு எந்த RC-LH1 வளாகத்திலும் காணப்படாத மூன்று TMH புரதங்கள்-W, குயினோன்/குயினோன் பரிமாற்றத்தை துரிதப்படுத்த ஒரு குயினோன் சேனலை உருவாக்குகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. பல பாதுகாக்கப்பட்ட லிப்பிட் மற்றும் குயினோன் பிணைப்பு தளங்கள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் குயினோன் மற்றும் RC ஆகியவற்றின் கலவைக்குப் பிறகு ஒரு புதிய இணக்க மாற்றத்தை நாங்கள் வெளிப்படுத்தியுள்ளோம், இது ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஃபோட்டோட்ரோபிக் உயிரினங்களின் ஃபோட்டோசிஸ்டம் II (PSII) RC க்கு ஏற்றதாக இருக்கலாம். ஊதா நிற ஃபோட்டோட்ரோபிக் பாக்டீரியாவின் RC-LH1 மைய வளாகத்தில் குயினோன்/குயினோன் பிணைப்பு மற்றும் பரிமாற்றத்தின் இயக்கவியலில் எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன.
Rps. palustris இல் காணப்படும் இரண்டு வளாகங்களின் விரிவான ஆய்வை எளிதாக்குவதற்காக, ஒவ்வொரு RC-LH1 ஐயும் உயிர்வேதியியல் முறைகள் மூலம் தனிமைப்படுத்துகிறோம். புரத W-குறைபாடுள்ள வளாகம் (இனிமேல் ΔpufW என குறிப்பிடப்படுகிறது) pufW மரபணு இல்லாத திரிபிலிருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்டது (16), மேலும் ஒரே ஒரு RC-LH1 வளாகத்தை மட்டுமே உற்பத்தி செய்ய முடியும். புரத W-கொண்ட வளாகம் ஒரு திரிபால் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது. இந்த திரிபின் புரதம் W அதன் C-முனையத்தில் 10x His குறிச்சொல்லுடன் மாற்றியமைக்கப்படுகிறது, இதனால் புரத W-கொண்ட வளாகத்தை உலோகத்தை அசையாமல் செய்வதன் மூலம் மிகவும் குறைபாடுள்ள புரத W உடன் திறம்பட இணைக்க முடியும். வளாகம் திறம்பட பிரிக்கப்படுகிறது (16) இணைப்பு குரோமடோகிராபி (IMAC).
படம் 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, இரண்டு வளாகங்களும் LH1 ஆண்டெனாவால் சூழப்பட்ட மூன்று துணை-அலகு RC (RC-L, RC-M மற்றும் RC-H) ஐக் கொண்டுள்ளன. புரதம்-W இல்லாத வளாகத்தின் 2.80-A அமைப்பு 16 αβ ஹெட்டோரோடைமர்களைக் காட்டுகிறது, இது RC ஐ முழுமையாகச் சுற்றியுள்ள மூடிய LH1 வளையத்தை உருவாக்குகிறது, இனிமேல் RC-LH116 வளாகம் என்று குறிப்பிடப்படுகிறது. புரதம்-W-கொண்ட வளாகத்தின் 2.65Å அமைப்பு புரதம்-W ஆல் குறுக்கிடப்பட்ட 14-ஹீட்டோரோடைமர் LH1 ஐக் கொண்டுள்ளது, இனிமேல் RC-LH114-W என்று குறிப்பிடப்படுகிறது.
(A மற்றும் B) சேர்மத்தின் மேற்பரப்பு பிரதிநிதித்துவம். (C மற்றும் D) தண்டுகளில் வெளிப்படுத்தப்படும் பிணைக்கப்பட்ட நிறமிகள். (E மற்றும் F) சைட்டோபிளாஸ்மிக் மேற்பரப்பில் இருந்து கவனிக்கப்பட்ட வளாகங்கள் கார்ட்டூன்களில் குறிப்பிடப்படும் பெப்டைடுகள் மற்றும் LH1 துணை அலகுகளைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் அவை புரதம்-W இடைவெளியிலிருந்து கடிகார திசையில் எண்ணப்படுகின்றன [Rba எண்களுடன் ஒத்துப்போகின்றன. ஸ்பேராய்டுகள் வளாகம் (13)]. LH1-α க்கு, புரத துணை அலகின் நிறம் மஞ்சள்; LH1-β க்கு, புரத துணை அலகின் நிறம் நீலம்; புரதம்-W க்கு, புரதம் சிவப்பு; RC-H க்கு, இது சியான்; RC-L க்கு, இது ஆரஞ்சு; RC-M க்கு, மெஜந்தா. இணை காரணிகள் தண்டுகளால் குறிக்கப்படுகின்றன, பச்சை BChl மற்றும் BPh a மூலக்கூறுகளைக் குறிக்கிறது, ஊதா கரோட்டினாய்டுகளைக் குறிக்கிறது, மஞ்சள் UQ10 மூலக்கூறுகளைக் குறிக்கிறது. (G மற்றும் H) RC-LH114-W வளாகம் (G) மற்றும் RC-LH116 வளாகம் (H) ஆகியவற்றின் சமமான பகுதியில் புரதம்-W இடைவெளியின் பெரிதாக்கப்பட்ட பார்வை. இணை காரணிகள் இடத்தை நிரப்பும் வடிவத்திலும், செலேட்டட் குயினோன் நீல நிறத்திலும் காட்டப்படுகின்றன. புரதம்-W இடைவெளி (G) இல் நீல நிற கோடு கோட்டால் சிறப்பிக்கப்படுகிறது, மேலும் LH116 வளையத்தில் குயினோன்/குயினால் பரவும் சிறிய துளைகள் (H) இல் கருப்பு கோடு கோட்டால் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன.
படம் 1 (A மற்றும் B) LH1αβ ஹெட்டோரோடைமர்களின் திறந்த அல்லது மூடிய வரிசைகளால் சூழப்பட்ட RC ஐக் காட்டுகிறது, அவை ஒவ்வொன்றும் இரண்டு BChl மற்றும் ஒரு கரோட்டினாய்டை பிணைக்கின்றன (படம் 1, C மற்றும் D). முந்தைய ஆய்வுகள் Rps என்பது LH1 வளாகம் என்பதைக் காட்டுகின்றன. ஸ்பைருலினா சாந்தினின் உயிரியக்கவியல் பாதையில், இந்த இனங்கள் கரோட்டினாய்டுகளின் கலப்பு மக்கள்தொகையைக் கொண்டுள்ளன (17). இருப்பினும், ஸ்பைரோபிராக்சாந்தின் ஆதிக்கம் செலுத்தும் கரோட்டினாய்டு மற்றும் அதன் அடர்த்தி திருப்திகரமாக உள்ளது. எனவே, அனைத்து LH1 பிணைப்பு தளங்களிலும் ஸ்பைரோக்சாந்தினை மாதிரியாகக் காட்ட நாங்கள் தேர்வு செய்தோம். ஆல்பா மற்றும் பீட்டா பாலிபெப்டைடுகள் குறுகிய சவ்வு வெளிப்புற பகுதிகளைக் கொண்ட ஒற்றை TMHகள் (படம் 1, A, B, E, மற்றும் F). C-டெர்மினஸில் 17 எச்சங்களின் அடர்த்தி கவனிக்கப்படவில்லை என்றாலும், ஆல்பா பாலிபெப்டைட் Met1 இலிருந்து Ala46 வரை இரண்டு வளாகங்களிலும் பிளவுபட்டது. RC-LH116 இல் β பாலிபெப்டைடு Gly4 இலிருந்து Tyr52 ஆகவும், RC-LH114-W இல் Ser5 இலிருந்து Tyr52 ஆகவும் குறைக்கப்பட்டது. 3 அல்லது 4 N-முனையம் அல்லது 13 C-முனைய எச்சங்களின் அடர்த்தி காணப்படவில்லை (படம் S1). காட்டு-வகை திரிபிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட கலப்பு RC-LH1 வளாகத்தின் நிறை நிறமாலை பகுப்பாய்வு, காணாமல் போன பகுதி இந்த பெப்டைட்களின் ஹீட்டோரோலாஜஸ் பிளவுகளின் விளைவாகும் என்பதைக் காட்டியது (படம் S1 மற்றும் S2). α-Met1 இன் N-முனைய உருவாக்கமும் காணப்பட்டது (f). α-பெப்டைடு fMet1 முதல் Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 வரையிலான எச்சங்களைக் கொண்டுள்ளது என்றும், β-பெப்டைடு Ser2 முதல் Ala53 வரையிலான எச்சங்களைக் கொண்டுள்ளது என்றும் பகுப்பாய்வு காட்டுகிறது, இது குறைந்த வெப்பநிலை EM அடர்த்தி வரைபடத்துடன் நல்ல உடன்பாட்டில் உள்ளது.
α-His29 மற்றும் β-His36 இன் ஒருங்கிணைப்பு BChls ஐ நேருக்கு நேர் சந்திக்க வைக்கிறது; ஒவ்வொரு αβ ஹெட்டோரோடைமரும் அதன் அண்டை நாடுகளுடன் ஒன்றுகூடி RC ஐச் சுற்றி ஒரு திறந்த வளையத்தை (RC-LH114-W) அல்லது ஒரு மூடிய வளையத்தை (RC-LH116) உருவாக்குகிறது. எக்ஸிடான் இணைக்கப்பட்ட நிறமி வரிசை (படம் 1, C மற்றும் D). RC-LH114-W இன் 877 nm பட்டையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​RC-LH116 இன் 880 nm உறிஞ்சுதல் சிவப்பு மாற்றம் 3 nm ஆகும் (படம் 2A). இருப்பினும், வட்ட டைக்ரோயிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கிட்டத்தட்ட ஒரே மாதிரியாக உள்ளது (படம் 2B), இது திறந்த மற்றும் மூடிய சுழல்களுக்கு இடையே தெளிவான வேறுபாடு இருந்தாலும், BChls இன் உள்ளூர் சூழல் மிகவும் ஒத்திருக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. உறிஞ்சுதல் சிவப்பு மாற்றம் குறைக்கப்பட்ட வெப்ப இயக்கம் மற்றும் மூடிய வளையத்தில் அதிகரித்த நிலைத்தன்மையின் விளைவாக இருக்கலாம் (18, 19), மூடிய வளையத்தால் ஏற்படும் நிறமி இணைப்பில் ஏற்படும் மாற்றம் (20, 21), அல்லது இந்த இரண்டு விளைவுகளின் கலவையாக இருக்கலாம் (11).
(A) புற ஊதா/தெரியும்/அருகாமை-அகச்சிவப்பு உறிஞ்சுதல் நிறமாலை, அதன் சிகரங்கள் அவற்றின் தொடர்புடைய நிறமிகளால் குறிக்கப்பட்டு 775 nm இல் BPh உச்சத்திற்கு இயல்பாக்கப்படுகின்றன. (B) வட்ட டைக்ரோயிசம் நிறமாலை 805 nm இல் BChl உறிஞ்சுதலுக்கு இயல்பாக்கப்படுகிறது. (C மற்றும் D) RC-LH114-W வளாகம் (C) மற்றும் RC-LH116 வளாகம் (D) ஆகியவற்றின் நேர-தீர்க்கப்பட்ட உறிஞ்சுதல் நிறமாலையிலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ΔA நிறமாலை. சிறந்த ஒப்பீட்டிற்காக, அனைத்து நிறமாலைகளும் 0.2 ps இல் −A இன் ∆A க்கு இயல்பாக்கப்படுகின்றன. (E) UQ2 இன் பல்வேறு செறிவுகளின் முன்னிலையில் கதிர்வீச்சுக்குப் பிறகு சைட்டோக்ரோம் c2 ஆக்சிஜனேற்ற விகிதம் (மூல தரவுகளுக்கு படம் S8 ஐப் பார்க்கவும்). (F) குறைந்த, நடுத்தர அல்லது அதிக தீவிரம் கொண்ட ஒளியின் கீழ் வளர்க்கப்படும் செல்களில் (முறையே 10, 30 அல்லது 300μMm-2 s-1), சுத்திகரிக்கப்பட்ட வளாகத்தில் உள்ள புரதம் W மற்றும் RC-L துணை அலகுகள் மற்றும் பிரிக்கப்பட்ட சவ்வு விகிதம். SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் இம்யூனோஅஸ்ஸே மூலம் புரத அளவைத் தீர்மானிக்கவும் (மூல தரவுகளுக்கு படம் S9 ஐப் பார்க்கவும்). சுத்திகரிக்கப்பட்ட RC-LH114-W வளாகத்துடன் தொடர்புடைய விகிதத்தைத் தீர்மானிக்கவும். வளாகத்தின் RC-L மற்றும் புரதம்-W இன் ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் விகிதம் 1:1 ஆகும்.
RC-LH114-W இன் சிதைந்த αβ14 வளையத்தில் 1 நிலையில் உள்ள BChls (படம் 1, A, C, மற்றும் E) RC-LH116 இல் உள்ள சமமான BChls ஐ விட 6.8Å ஆல் RC முதன்மை நன்கொடையாளருக்கு (P) நெருக்கமாக உள்ளன (படம் 1, B, D, மற்றும் F, மற்றும் படம் S3); இருப்பினும், இரண்டு வளாகங்களின் நிலையற்ற உறிஞ்சுதல் இயக்கவியல் RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 க்கு, LH1 இலிருந்து RC வரையிலான தூண்டுதல் ஆற்றல் பரிமாற்ற நேர மாறிலிகள் 40 ±4 மற்றும் 44±3 ps என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 2). , C மற்றும் D, படம் S4 மற்றும் அட்டவணை S2). RC க்குள் மின்னணு பரிமாற்றத்திலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை (படம் S5 மற்றும் தொடர்புடைய துணை உரை). LH1 மற்றும் RC-P க்கு இடையிலான ஆற்றல் பரிமாற்ற நேரத்தின் நெருங்கிய தொடர்பு இரண்டு LH1 சுழல்களில் உள்ள பெரும்பாலான BChl இன் ஒத்த தூரம், கோணம் மற்றும் சாத்தியமான ஆற்றல் காரணமாக இருக்கலாம் என்று நாங்கள் சந்தேகிக்கிறோம். குறைந்தபட்ச தூரத்தை அடைய LH1 ஆற்றல் வடிவத்தை ஆராய்வது துணை உகந்த தளங்களிலிருந்து RC க்கு நேரடி ஆற்றல் பரிமாற்றத்தை விட வேகமானது அல்ல என்று தெரிகிறது. RC-LH114-W இல் உள்ள திறந்த-லூப் LH1 வளையம் கட்டமைப்பு பகுப்பாய்விற்காக குறைந்த வெப்பநிலை நிலைமைகளின் கீழ் முக்கியமற்ற வெப்ப இயக்கத்திற்கு உட்படக்கூடும், மேலும் RC 1 நிலையில் βBChls இன் நிறமி தூரத்திலிருந்து அறை வெப்பநிலையில் நீண்ட αβ14 வளைய இணக்கம் உள்ளது.
RC-LH116 வளாகத்தில் 32 BChls மற்றும் 16 கரோட்டினாய்டுகள் உள்ளன, மேலும் அதன் ஒட்டுமொத்த அமைப்பு தெர்மோக்ரோமேடியம் (Tch.) பிட்பிடம் [புரத தரவு வங்கி (PDB) ID 5Y5S] (9), தியோர்ஹோடோவிப்ரியோ (Trv.) 970 திரிபு (PDB ID 7C9R) (12) மற்றும் பச்சை ஆல்கா (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்டதைப் போன்றது. சீரமைப்புக்குப் பிறகு, αβ ஹெட்டோரோடைமர்களின் நிலைகளில் சிறிய விலகல்கள் மட்டுமே காணப்பட்டன, குறிப்பாக 1-5, 15, மற்றும் 16 (படம் S6). புரதம்-W இன் இருப்பு LH1 இன் கட்டமைப்பில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. அதன் மூன்று TMHகள் குறுகிய சுழல்களால் இணைக்கப்பட்டுள்ளன, வளாகத்தின் லுமேன் பக்கத்தில் N-முனையமும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்தில் C-முனையமும் உள்ளன (படங்கள் 1A மற்றும் 3, A முதல் D வரை). புரதம்-W பெரும்பாலும் நீர்வெறுப்பு தன்மை கொண்டது (படம் 3B), மேலும் TMH2 மற்றும் TMH3 ஆகியவை LH1αβ-14 உடன் தொடர்பு கொண்டு ஒரு டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் மேற்பரப்பை உருவாக்குகின்றன (படம் 3, B மற்றும் E முதல் G வரை). இடைமுகம் முக்கியமாக டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் பகுதியில் உள்ள Phe, Leu மற்றும் Val எச்சங்களால் ஆனது. இந்த எச்சங்கள் நீர்வெறுப்பு அமினோ அமிலங்கள் மற்றும் αβ-14 நிறமிகளுடன் அடுக்கி வைக்கப்பட்டுள்ளன. சில துருவ எச்சங்களும் தொடர்புக்கு பங்களிக்கின்றன, இதில் சிக்கலான குழியின் மேற்பரப்பில் W-Thr68 மற்றும் β-Trp42 க்கு இடையிலான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு அடங்கும் (படம் 3, F மற்றும் G). சைட்டோபிளாஸின் மேற்பரப்பில், Gln34 αβ-14 கரோட்டினாய்டுகளின் கீட்டோ குழுவிற்கு அருகில் உள்ளது. கூடுதலாக, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) மூலக்கூறு தீர்க்கப்பட்டது, மேலும் அதன் நீர்வெறுப்பு வால் புரதம்-W மற்றும் αβ-14 க்கு இடையிலான இடைமுகத்திற்கு நீட்டிக்கப்பட்டது, மேலும் லிப்பிட் வால் உடலில் அமைந்திருக்கலாம். புரதம் W மற்றும் RCH இன் C-முனைய தெளிவுத்திறன் பகுதிகள் மிக நெருக்கமாக இருப்பதையும், ஆனால் குறிப்பிட்ட இடைவினைகளை உருவாக்கும் எல்லைக்குள் இல்லை என்பதையும் நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 1, A மற்றும் E). இருப்பினும், இந்த இரண்டு புரதங்களின் தீர்க்கப்படாத C-முனைய அமினோ அமிலங்களில் இடைவினைகள் இருக்கலாம், இது RC-LH114-W வளாகத்தின் அசெம்பிளியின் போது புரதம்-W ஐ ஆட்சேர்ப்பு செய்வதற்கான ஒரு பொறிமுறையை வழங்கக்கூடும்.
(A) கார்ட்டூன் வடிவத்தில் LH1αβ14 உடன் இடைமுகத்தை எதிர்கொள்ளும் புரதம்-W, ஒரு தடி வடிவ பக்கச் சங்கிலியை (சிவப்பு) கொண்டுள்ளது, இது மின்னியல் ஆற்றல் வரைபடத்தின் ஒரு பகுதியில் காட்டப்படுகிறது (0.13 விளிம்பு நிலை கொண்ட வெளிப்படையான சாம்பல் மேற்பரப்பு). (B) புரதம்-W ஒரு ஹைட்ரோபோபிக் வண்ண மேற்பரப்பால் குறிக்கப்படுகிறது. துருவ மற்றும் சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பகுதிகள் சியான் நிறத்திலும், ஹைட்ரோபோபிக் பகுதிகள் வெள்ளை நிறத்திலும், வலுவான ஹைட்ரோபோபிக் பகுதிகள் ஆரஞ்சு நிறத்திலும் காட்டப்படுகின்றன. (C மற்றும் D) கார்ட்டூனில் குறிப்பிடப்படும் புரதம்-W, அதன் நோக்குநிலை (A) (C) இல் உள்ளதைப் போலவே உள்ளது, மேலும் 180° (D) ஆல் சுழற்றப்படுகிறது. வரிசையில் உள்ள நிலையின்படி, வேறுபடுத்தக்கூடிய எச்சங்கள் ஒரு வானவில் வண்ணத் திட்டத்தை ஏற்றுக்கொள்கின்றன, அங்கு N-முனையம் நீலமாகவும், C-முனையம் சிவப்பு நிறமாகவும் இருக்கும். (E) (A) இல் உள்ள அதே பார்வையில் புரதம்-W, மற்றும் புரதம்-W:LH1 இன் இடைமுகத்தில் உள்ள எச்சங்கள் இணைக்கப்பட்ட குறிகளுடன் தண்டுகளால் குறிக்கப்படுகின்றன. (F) கார்ட்டூன் பிரதிநிதித்துவத்தில் (E) மற்றும் LH1αβ14 உடன் ஒப்பிடும்போது புரதம்-W 90° சுழற்றப்படுகிறது, மேலும் பட்டை பிரதிநிதித்துவத்தில் உள்ள இடைமுக எச்சங்களுடன் ஒப்பிடும்போது. பீட்டா பாலிபெப்டைடில் இருந்து மேலெழும் எச்சங்கள் பெயரிடப்பட்டுள்ளன. படம் 1 இன் நிறத்துடன் பொருந்தக்கூடிய ஒரு பட்டையாக துணை காரணி காட்டப்பட்டுள்ளது, சிதைந்த β-DDM சாம்பல் நிறத்திலும், ஆக்ஸிஜன் சிவப்பு நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளது. (G) (F) இல் உள்ள பார்வை 180° சுழற்றப்பட்டுள்ளது, பெயரிடப்பட்ட ஆல்பா பாலிபெப்டைட்டின் முக்கிய எச்சங்களுடன்.
புரதம்-W ஒரு αβ ஹெட்டோரோடைமரை (படம் 1F இல் 15வது) மாற்றுகிறது, இதன் மூலம் வளைய மூடுதலைத் தடுக்கிறது மற்றும் முதல் மூன்று αβ ஹெட்டோரோடைமர்களை சாய்க்கிறது. முதல் αβ-1 ஹெட்டோரோடைமரின் அதிகபட்ச சாய்வு கோணம் படல இயல்பிற்கு ஒப்பிடும்போது 25° முதல் 29° வரை இருந்தது (படம் 1, A மற்றும் E), இது RC A கூர்மையான மாறுபாடு-LH116 இல் αβ-1 இன் 2° முதல் 8° சாய்வால் உருவாக்கப்பட்டது (படம் 1, B மற்றும் F). இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது ஹெட்டோரோடைமர்கள் முறையே 12° முதல் 22° வரை மற்றும் 5° முதல் 10° வரை சாய்ந்துள்ளன. RC இன் ஸ்டெரிக் தடையின் காரணமாக, αβ-1 இன் சாய்வு αβ இன் இரண்டாவது ஜோடியை உள்ளடக்குவதில்லை (இது படம் 1F இல் 16வது αβ உடன் ஒத்துள்ளது), இதனால் LH1 வளையத்தில் தெளிவான இடைவெளியை உருவாக்குகிறது (படம் 1, A மற்றும் E). இரண்டு αβ ஹெட்டோரோடைமர்கள் இல்லாததால், நான்கு BChl மற்றும் இரண்டு கரோட்டினாய்டுகள் இழப்புடன் சேர்ந்து, எந்த கரோட்டினாய்டுகளும் முறுக்கப்பட்ட αβ-1 துணை அலகுடன் பிணைக்கப்படவில்லை, இதன் விளைவாக 13 கரோட்டினாய்டுகள் சைவ உணவு மற்றும் 28 BChls கொண்ட LH114-W வளையம் உருவாகிறது. αβ1 முதல் 7 வரையிலான பகுதிகளில் உள்ள இரண்டு வளாகங்களின் உள்ளூர் தெளிவுத்திறன் மதிப்பீடுகள் LH1 வளையத்தின் மீதமுள்ளவற்றை விட குறைவாக உள்ளன, இது RC QB தளத்திற்கு அருகிலுள்ள LH1 துணை அலகின் உள்ளார்ந்த நெகிழ்வுத்தன்மையை பிரதிபலிக்கக்கூடும் (படம் 4).
RC-LH114-W (A மற்றும் B) மற்றும் RC-LH116 (C மற்றும் D) ஆகியவற்றின் படங்கள் படம் 1 (B மற்றும் D) இன் அதே மேல் பார்வை/பக்கக் காட்சி (A மற்றும் B) (A மற்றும் C) மற்றும் குழி மேற்பரப்பில் இருந்து காட்டப்பட்டுள்ளன. வண்ண விசைகள் வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
1:14 என்ற ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் விகிதத்தைக் கொண்ட மற்றொரு சிறப்பியல்பு மைய வளாகம் ரோடோகாக்கஸ் ஸ்பேராய்டுகள் (Rba.) RC-LH1-PufX டைமர் (13) ஆகும். இருப்பினும், புரதம் W மற்றும் PufX ஆகியவை வெளிப்படையான ஹோமோலஜியைக் கொண்டிருக்கவில்லை, மேலும் அவற்றின் LH1 கட்டமைப்புகளில் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகின்றன. PufX என்பது N-டெர்மினல் சைட்டோபிளாஸ்மிக் டொமைனைக் கொண்ட ஒற்றை TMH ஆகும், இது Rps. palustris LH116αβ-16 உடன் தொடர்புடைய நிலையில் RC-H துணை அலகின் (13) சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்துடன் தொடர்பு கொள்கிறது. RC-LH1 மற்றும் சைட்டோக்ரோம் bcl வளாகத்திற்கு இடையில் குயினோன்/குயினோன் பரிமாற்றத்திற்கான ஒரு சேனலை PufX உருவாக்குகிறது மற்றும் அனைத்து Rba. ஸ்பேராய்டுகள் மைய வளாகத்திலும் (13) உள்ளது. மோனோமர்-மோனோமர் இடைமுகம் Rba இல் இருந்தாலும். RC-LH114-W இல் புரதம் W இன் பிணைப்பு நிலையில் ஸ்பேராய்டுகள் RC-LH1-PufX டைமர் அமைந்துள்ளது, மேலும் PufX மற்றும் புரதம்-W ஆல் தூண்டப்பட்ட இடைவெளி சமமான நிலையில் உள்ளது (படம் S7A). RC-LH114-W இல் உள்ள இடைவெளி சூடோமோனாஸ் ரோசியா LH1 இன் அனுமான குயினோன் சேனல் (8) உடன் சீரமைக்கப்பட்டுள்ளது, இது புரதம் W அல்லது PufX உடன் தொடர்பில்லாத பெப்டைட்களால் உருவாகிறது (படம் S7B). கூடுதலாக, Blc இல் உள்ள குயினோன் சேனல். ஒரு γ துணை அலகை (7) விலக்குவதன் மூலம் உருவாக்கப்பட்ட மரகத பச்சை LH1 ஒத்த நிலையில் அமைந்துள்ளது (படம் S7C). வெவ்வேறு புரதங்களால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்டாலும், RC-LH1 வளாகத்தில் ஒரு பொதுவான நிலையில் இந்த குயினோன்/குயினோன் சேனல்களின் தோற்றம் குவிந்த பரிணாம வளர்ச்சியின் ஒரு எடுத்துக்காட்டு என்று தெரிகிறது, இது புரதம் W ஆல் உருவாக்கப்பட்ட இடைவெளி ஒரு குயினோன் சேனலாக செயல்படக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
LH114-W வளையத்தில் உள்ள இடைவெளி, புரதங்களைப் போல புரத துளை வழியாக இரண்டு களங்களையும் இணைப்பதற்குப் பதிலாக, RC-LH114-W வளாகத்தின் உள் இடத்திற்கும் மொத்த சவ்வுக்கும் (படம் 1G) இடையே ஒரு தொடர்ச்சியான சவ்வுப் பகுதியை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது. RC-LH116 வளாகம் ஒரு மூடிய Tch ஐப் போன்றது. ஊசி போன்ற வளாகம் (22) (படம் 1H). சவ்வு வழியாக குயினோனின் பரவல் குறுகிய புரத சேனல் வழியாக பரவுவதை விட வேகமாக இருப்பதால், திறந்த LH114-W வளையம் மூடிய LH116 வளையத்தை விட வேகமான RC வருவாயை அனுமதிக்கும், மேலும் RC இல் குயினோனின் பரவல் மிகவும் கட்டுப்படுத்தப்படலாம். புரதம் W RC வழியாக குயினோன்களின் மாற்றத்தை பாதிக்கிறதா என்பதை சோதிக்க, ubiquinone 2 (UQ2) இன் ஒரு குறிப்பிட்ட செறிவில் (குறுகிய ஐசோபிரீன் வால் கொண்ட இயற்கை UQ10 இன் அனலாக்) சைட்டோக்ரோம் ஆக்சிஜனேற்ற மதிப்பீட்டைச் செய்தோம் (படம் 2E). செலேட்டட் குயினோனின் இருப்பு வெளிப்படையான மைக்கேலிஸ் மாறிலியின் துல்லியமான தீர்மானத்தைத் தடுக்கிறது (RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 ஆகியவை முறையே 0.2±0.1μM மற்றும் 0.5±0.2μM க்கு ஏற்றவை), RC-LH114-W இன் அதிகபட்ச விகிதம் (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) ஐ விட 28±5% அதிகமாகும்.
ஆரம்பத்தில், மைய வளாகத்தில் சுமார் 10% புரதம்-W இருப்பதாக நாங்கள் மதிப்பிட்டோம் (16); இங்கே, குறைந்த-ஒளி, நடுத்தர-ஒளி மற்றும் அதிக-ஒளி வளர்ச்சி செல்களின் ஆக்கிரமிப்பு விகிதங்கள் முறையே 15±0.6%, 11±1% மற்றும் 0.9±0.5 ஆகும் (படம் 2F). நிறை நிறமாலை அளவீட்டின் அளவு ஒப்பீடு, ஹிஸ்டைடின் டேக்கைச் சேர்ப்பது காட்டு-வகை விகாரங்களுடன் ஒப்பிடும்போது புரதம்-W இன் ஒப்பீட்டு மிகுதியைக் குறைக்கவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது (P = 0.59), எனவே இந்த அளவுகள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட புரதம்-W இன் ஒரு கலைப்பொருள் அல்ல (படம் S10). இருப்பினும், RC-LH1 வளாகத்தில் புரதம்-W இன் இந்த குறைந்த ஆக்கிரமிப்பு சில RC களை துரிதப்படுத்தப்பட்ட விகிதத்தில் புரட்ட அனுமதிக்கலாம், இதன் மூலம் RC-LH116 வளாகத்தில் மெதுவான குயினோன்/குயினோன் பரிமாற்றத்தைக் குறைக்கலாம். அதிக ஒளி ஆக்கிரமிப்பு விகிதம் சமீபத்திய டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் தரவுகளுடன் முரண்படுவதை நாங்கள் கவனித்தோம், இது pufW மரபணு வெளிப்பாடு வலுவான ஒளியின் கீழ் அதிகரிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் S11) (23). RC-LH1 வளாகத்தில் pufW டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் புரதம்-W இணைப்பிற்கு இடையிலான வேறுபாடு குழப்பமானதாக இருக்கிறது மற்றும் புரதத்தின் சிக்கலான ஒழுங்குமுறையை பிரதிபலிக்கக்கூடும்.
RC-LH114-W இல், 6 கார்டியோலிபின் (CDL), 7 பாஸ்பேட்டிடைல்கோலின் (POPC), 1 பாஸ்பேட்டிடைல்கிளிசரால் (POPG) மற்றும் 29 β-DDM மூலக்கூறுகள் ஒதுக்கப்பட்டு அதில் மாதிரியாக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன 6 CDLகள், 24 POPCகள், 2 POPGகள் மற்றும் 12 βDDMகள். RC-LH116 (படம் 5, A மற்றும் B). இந்த இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும், CDL கிட்டத்தட்ட வளாகத்தின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்தில் அமைந்துள்ளது, அதே நேரத்தில் POPC, POPG மற்றும் β-DDM பெரும்பாலும் லுமினல் பக்கத்தில் அமைந்துள்ளன. RC-LH114-W வளாகத்தின் αβ-1 முதல் αβ-6 பகுதியில் இரண்டு லிப்பிட் மற்றும் டிடர்ஜென்ட் மூலக்கூறுகள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன (படம் 5A), மேலும் ஐந்து RC-LH116 இன் சமமான பகுதியில் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன (படம் 5B). வளாகத்தின் மறுபுறத்தில் அதிக லிப்பிடுகள் காணப்பட்டன, முக்கியமாக CDL, RC மற்றும் αβ-7 முதல் αβ-13 வரை குவிந்துள்ளது (படம் 5, A மற்றும் B). மற்ற கட்டமைப்பு ரீதியாக தீர்க்கப்பட்ட லிப்பிடுகள் மற்றும் சவர்க்காரங்கள் LH1 வளையத்திற்கு வெளியே அமைந்துள்ளன, மேலும் நன்கு தீர்க்கப்பட்ட அசைல் சங்கிலிகள் LH1 துணை அலகுகளுக்கு இடையில் நீண்டுள்ளன, தற்காலிகமாக RC-LH114-W இல் β-DDM என நியமிக்கப்பட்டன, மேலும் RC இல் β-DDM என வரையறுக்கப்படுகின்றன. β-DDM மற்றும் POPC-LH116 இன் கலவை. எங்கள் கட்டமைப்பில் உள்ள செலாட்டிங் லிப்பிடுகள் மற்றும் சவர்க்காரங்களின் ஒத்த நிலைகள் அவை உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான பிணைப்பு தளங்கள் என்பதைக் குறிக்கின்றன (படம் S12A). Tch இல் சமமான மூலக்கூறுகளின் நிலைகளும் நல்ல நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன. மென்மையான மற்றும் Trv. ஸ்ட்ரெய்ன் 970 RC-LH1s (படம் S12, B முதல் E வரை) (9, 12) மற்றும் லிப்பிட் ஹெட் குழுவின் ஹைட்ரஜன்-பிணைப்பு எச்சங்கள் வரிசை சீரமைப்பில் (படம் S13) நல்ல பாதுகாப்பைக் காட்டின, இது RC (24) உடன் பிணைக்கும் பாதுகாக்கப்பட்ட CDL, இந்த தளங்கள் RC-LH1 வளாகத்தில் பாதுகாக்கப்படலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.
(A மற்றும் B) RC-LH114-W (A) மற்றும் RC-LH116 (B) பெப்டைடுகள் கார்ட்டூன்களால் குறிக்கப்படுகின்றன, மேலும் படம் 1 இல் உள்ள வண்ணத் திட்டத்தைப் பயன்படுத்தி நிறமிகள் தண்டுகளால் குறிக்கப்படுகின்றன. லிப்பிடுகள் சிவப்பு நிறத்திலும், சவர்க்காரங்கள் சாம்பல் நிறத்திலும் காட்டப்பட்டுள்ளன. RC QA மற்றும் QB தளங்களுடன் பிணைக்கப்பட்ட UQ மஞ்சள் நிறத்திலும், தனிமைப்படுத்தப்பட்ட UQ நீல நிறத்திலும் உள்ளது. (C மற்றும் D) லிப்பிடுகள் தவிர்க்கப்பட்ட நிலையில் (A) மற்றும் (B) போன்ற அதே காட்சிகள். (E முதல் G வரை) RC-LH116 இலிருந்து Q1(E), Q2(F) மற்றும் Q3(G) இன் விரிவாக்கப்பட்ட காட்சி, ஒன்றையொன்று பாதிக்கும் பக்கச் சங்கிலிகளுடன். ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் கருப்பு கோடு கோடுகளாகக் காட்டப்பட்டுள்ளன.
RC-LH116 இல், மின்னூட்டப் பிரிப்பு செயல்பாட்டில் எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்தில் பங்கேற்கும் RC QA மற்றும் QB UQ இரண்டும் அவற்றின் பிணைப்பு தளங்களில் சிதைக்கப்படுகின்றன. இருப்பினும், RC-LH114-W இல், QB குயினோன் தீர்க்கப்படவில்லை, மேலும் கீழே விரிவாக விவாதிக்கப்படும். QA மற்றும் QB குயினோன்களுக்கு கூடுதலாக, இரண்டு செலேட்டட் UQ மூலக்கூறுகள் (RC மற்றும் LH1 வளையங்களுக்கு இடையில் அமைந்துள்ளன) RC-LH114-W கட்டமைப்பில் அவற்றின் நன்கு தீர்க்கப்பட்ட தலை குழுக்களின் படி (முறையே Q1 மற்றும் Q2 இல் அமைந்துள்ளன) ஒதுக்கப்படுகின்றன. இடம்). படம் 5C). இரண்டு ஐசோபிரீன் அலகுகள் Q1 க்கு ஒதுக்கப்படுகின்றன, மேலும் அடர்த்தி வரைபடம் Q2 இன் முழுமையான 10 ஐசோபிரீன் வால்களைத் தீர்க்கிறது. RC-LH116 இன் கட்டமைப்பில், மூன்று செலேட்டட் UQ10 மூலக்கூறுகள் (Q1 முதல் Q3, படம் 5D) தீர்க்கப்பட்டன, மேலும் அனைத்து மூலக்கூறுகளும் வால் முழுவதும் தெளிவான அடர்த்தியைக் கொண்டுள்ளன (படம் 5, D முதல் G வரை). இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும், Q1 மற்றும் Q2 இன் குயினோன் தலை குழுக்களின் நிலைகள் சிறந்த நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன (படம் S12F), மேலும் அவை RC உடன் மட்டுமே தொடர்பு கொள்கின்றன. Q1 RC-LH114-W இன் W இடைவெளியின் நுழைவாயிலில் அமைந்துள்ளது (படம் 1G மற்றும் 5, C, D மற்றும் E), மற்றும் Q2 QB பிணைப்பு தளத்திற்கு அருகில் அமைந்துள்ளது (படம் 5, C, D) மற்றும் F). பாதுகாக்கப்பட்ட L-Trp143 மற்றும் L-Trp269 எச்சங்கள் Q1 மற்றும் Q2 க்கு மிக அருகில் உள்ளன மற்றும் சாத்தியமான π-ஸ்டாக்கிங் இடைவினைகளை வழங்குகின்றன (படம் 5, E மற்றும் F, மற்றும் படம் S12). Q1 இன் தொலைதூர ஆக்ஸிஜனிலிருந்து L-Gln88, 3.0 Å, ஒரு வலுவான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பை வழங்குகிறது (படம் 5E); இந்த எச்சம் மிகவும் தொலைதூர உறவைத் தவிர அனைத்து RC களிலும் பாதுகாக்கப்படுகிறது (படம் S13). பெரும்பாலான பிற RCகளில் (படம் S13) Thr க்கு பதிலாக L-Ser91 பழமைவாதமாக மாற்றப்படுகிறது, இது Q1 இன் மெத்தில் ஆக்ஸிஜனிலிருந்து 3.8 ஆங்ஸ்ட்ரோம்கள் ஆகும், மேலும் பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை வழங்கக்கூடும் (படம் 5E). Q3 ஒரு குறிப்பிட்ட தொடர்பு கொண்டதாகத் தெரியவில்லை, ஆனால் RC-M துணை அலகுக்கும் LH1-α துணை அலகு 5 முதல் 6 வரையிலான ஹைட்ரோபோபிக் பகுதியில் அமைந்துள்ளது (படம் 5, D மற்றும் G). Q1, Q2 மற்றும் Q3 அல்லது அருகிலுள்ள செலேட்டட் குயினோன்கள் Tch இல் தீர்க்கப்பட்டுள்ளன. ஜென்டில், Trv. ஸ்ட்ரெய்ன் 970 மற்றும் Blc. கருவிழி அமைப்பு (9, 10, 12) RC-LH1 வளாகத்தில் ஒரு பாதுகாக்கப்பட்ட துணை குயினோன் பிணைப்பு தளத்தைக் குறிக்கிறது (படம் S12G). RC-LH116 இல் உள்ள ஐந்து சிதைந்த UQகள், உயர் செயல்திறன் திரவ குரோமடோகிராபி (HPLC) மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் ஒவ்வொரு வளாகத்தின் 5.8±0.7 உடன் நல்ல உடன்பாட்டில் உள்ளன, அதே நேரத்தில் RC-LH114-W இல் உள்ள மூன்று சிதைந்த UQகள் 6.2±0.3 (படம். S14) இன் அளவிடப்பட்ட மதிப்பை விடக் குறைவாக உள்ளன. கட்டமைப்பில் தீர்க்கப்படாத UQ மூலக்கூறுகள் இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
போலி-சமச்சீர் L மற்றும் M பாலிபெப்டைடுகள் ஒவ்வொன்றும் ஐந்து TMHகளைக் கொண்டுள்ளன மற்றும் ஒரு BChl டைமர், இரண்டு BChl மோனோமர்கள், இரண்டு பாக்டீரியோபேஜ் (BPh) மோனோமர்கள் மற்றும் ஒரு ஹீம் அல்லாத இரும்பு மற்றும் ஒன்று அல்லது இரண்டு UQ10 மூலக்கூறுகளை இணைக்கும் ஒரு ஹெட்டோரோடைமரை உருவாக்குகின்றன. முனைய கீட்டோன் குழுவில் ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் இருப்பதன் மூலமும், Rps இல் அதன் அறியப்பட்ட குவிப்பதன் மூலமும், கரோட்டினாய்டுகள் M-துணை அலகில் இணைக்கப்படுகின்றன, இது cis-3,4-dehydrorhodopin என்று பெயரிடப்பட்டுள்ளது. இனங்கள் (25). RC-H இன் வெளிப்புற சவ்வு டொமைன் ஒரு TMH மூலம் சவ்வுடன் நங்கூரமிடப்படுகிறது. ஒட்டுமொத்த RC அமைப்பு தொடர்புடைய இனங்களின் மூன்று துணை அலகான RC ஐப் போன்றது (Rba). ஸ்பேராய்டுகள் (PDB ID: 3I4D). BChl மற்றும் BPh இன் மேக்ரோசைக்கிள்கள், கரோட்டினாய்டு முதுகெலும்பு மற்றும் ஹீம் அல்லாத இரும்பு ஆகியவை இந்த கட்டமைப்புகளின் தெளிவுத்திறன் வரம்பிற்குள் ஒன்றுடன் ஒன்று இணைகின்றன, அதே போல் QA தளத்தில் UQ10 தலைமைக் குழுவும் RC-LH116 இல் QB குயினோன் (படம் S15).
வெவ்வேறு QB தள ஆக்கிரமிப்பு விகிதங்களைக் கொண்ட இரண்டு RC கட்டமைப்புகளின் கிடைக்கும் தன்மை, QB குயினோன் பிணைப்புடன் கூடிய நிலையான இணக்க மாற்றங்களை ஆராய ஒரு புதிய வாய்ப்பை வழங்குகிறது. RC-LH116 வளாகத்தில், QB குயினோன் முழுமையாக பிணைக்கப்பட்ட "அருகாமையில்" நிலையில் அமைந்துள்ளது (26), ஆனால் RC-LH114-W இன் பிரிப்பில் QB குயினோன் இல்லை. RC-LH114-W இல் QB குயினோன் இல்லை, இது ஆச்சரியமளிக்கிறது, ஏனெனில் வளாகம் செயலில் உள்ளது, கட்டமைப்பு ரீதியாக தீர்க்கப்பட்ட QB குயினோன் கொண்ட RC-LH116 வளாகத்தை விட அதிகம். இரண்டு LH1 வளையங்களும் ஆறு குயினோன்களைச் செலேட் செய்தாலும், ஐந்து மூடிய RC-LH116 வளையத்தில் கட்டமைப்பு ரீதியாக தீர்க்கப்படுகின்றன, அதே நேரத்தில் திறந்த RC-LH114-W வளையத்தில் மூன்று மட்டுமே கட்டமைப்பு ரீதியாக வரையறுக்கப்பட்டுள்ளன. இந்த அதிகரித்த கட்டமைப்பு கோளாறு RC-LH114-W QB தளங்களின் விரைவான மாற்றீடு, வளாகத்தில் வேகமான குயினோன் இயக்கவியல் மற்றும் LH1 வளையத்தைக் கடக்கும் வாய்ப்பு அதிகரிப்பதை பிரதிபலிக்கக்கூடும். RC-LH114-W இன் RC QB தளத்தில் UQ இல்லாதது மிகவும் சிக்கலான மற்றும் மிகவும் செயலில் உள்ள வளாகத்தின் விளைவாக இருக்கலாம் என்றும், RC-LH114-W இன் QB தளம் உடனடியாக UQ விற்றுமுதலில் உறைந்துவிட்டது என்றும் நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம். குறிப்பிட்ட நிலை (QB தளத்திற்கான நுழைவு மூடப்பட்டுள்ளது) இந்த செயல்பாட்டின் இணக்கத்தை பிரதிபலிக்கிறது.
QB இல்லாமல், L-Phe217 இன் சுழற்சி UQ10 பிணைப்புடன் பொருந்தாத ஒரு நிலைக்குச் செல்லும், ஏனெனில் இது வால் பகுதியின் முதல் ஐசோபிரீன் அலகுடன் இடஞ்சார்ந்த மோதலை ஏற்படுத்தும் (படம் 6A). கூடுதலாக, வெளிப்படையான முக்கிய இணக்க மாற்றங்கள் வெளிப்படையானவை, குறிப்பாக ஹெலிக்ஸ் டி (TMH D மற்றும் E க்கு இடையிலான வளையத்தில் குறுகிய ஹெலிக்ஸ்) அங்கு L-Phe217 QB பிணைப்பு பாக்கெட்டுக்கு மாற்றப்படுகிறது மற்றும் L-Tyr223 இன் சுழற்சி (படம் 6A) M-Asp45 கட்டமைப்போடு ஹைட்ரஜன் பிணைப்பை உடைத்து QB பிணைப்பு தளத்தின் நுழைவாயிலை மூட (படம் 6B). ஹெலிக்ஸ் அதன் அடிப்பகுதியில் சுழல்கிறது, L-Ser209 இன் Cα 0.33Å ஆல் மாற்றப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் L-Val221Cα 3.52Å ஆல் மாற்றப்படுகிறது. TMH D மற்றும் E இல் காணக்கூடிய மாற்றங்கள் எதுவும் இல்லை, அவை இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும் மிகைப்படுத்தக்கூடியவை (படம் 6A). நமக்குத் தெரிந்தவரை, இயற்கையான RC இல் QB தளத்தை மூடும் முதல் அமைப்பு இதுவாகும். முழுமையான (QB-பிணைக்கப்பட்ட) அமைப்புடன் ஒப்பிடுகையில், குயினோன் குறைக்கப்படுவதற்கு முன்பு, அதை குயினோனுக்குள் நுழையச் செய்ய ஒரு இணக்க மாற்றம் தேவை என்பதைக் காட்டுகிறது. L-Phe217 சுழன்று குயினோன் தலை குழுவுடன் π-ஸ்டாக்கிங் தொடர்புகளை உருவாக்குகிறது, மேலும் ஹெலிக்ஸ் வெளிப்புறமாக நகர்கிறது, இது L-Gly222 இன் எலும்புக்கூடு மற்றும் L-Tyr223 இன் பக்கச் சங்கிலியை நிலையான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு அமைப்புடன் ஒரு ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு வலையமைப்பை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது (படம் 6, A மற்றும் C).
(A) ஹாலோகிராம் (L சங்கிலி, ஆரஞ்சு/M சங்கிலி, மெஜந்தா) மற்றும் apo (சாம்பல்) அமைப்பின் ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த கார்ட்டூன், இதில் முக்கிய எச்சங்கள் ஒரு தடி போன்ற பிரதிநிதித்துவ வடிவத்தில் காட்டப்படுகின்றன. UQ10 ஒரு மஞ்சள் பட்டையால் குறிக்கப்படுகிறது. புள்ளியிடப்பட்ட கோடு முழு கட்டமைப்பிலும் உருவாகும் ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளைக் குறிக்கிறது. (B மற்றும் C) அபோலிபோபுரோட்டீன் மற்றும் முழு வளைய அமைப்பின் மேற்பரப்பு பிரதிநிதித்துவம், முறையே நீல நிறத்தில் L-Phe217 இன் பக்கச் சங்கிலி ஆக்ஸிஜனையும் சிவப்பு நிறத்தில் L-Tyr223 ஐயும் எடுத்துக்காட்டுகிறது. L துணை அலகு ஆரஞ்சு நிறத்தில் உள்ளது; M மற்றும் H துணை அலகுகள் நிறத்தில் இல்லை. (D மற்றும் E) அபோலிபோபுரோட்டீன் (D) மற்றும் முழு (E) RC QB தளங்கள் [முறையே (A) ஆல் வண்ணம்] மற்றும் தெர்மோபிலஸ் தெர்மோபிலஸ் PSII (பிளாஸ்டிக் குயினோனுடன் பச்சை, நீலம்; PDB ID: 3WU2) சீரமை (58).
எதிர்பாராத விதமாக, LH1 இல்லாத QB-குறைபாடுள்ள RCகளின் பல கட்டமைப்புகள் கிடைத்தாலும், இந்த ஆய்வில் காணப்பட்ட இணக்க மாற்றங்கள் முன்னர் தெரிவிக்கப்படவில்லை. இவற்றில் Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) மற்றும் Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ஆகியவற்றிலிருந்து QB குறைப்பு அமைப்பு அடங்கும், இவை அனைத்தும் அவற்றின் ஒட்டுமொத்த QB அமைப்பைப் போலவே உள்ளன. 3PRC ஐ நெருக்கமாக ஆய்வு செய்ததில் LDAO (லாரில் டைமெதில் அமீன் ஆக்சைடு) சோப்பு மூலக்கூறுகள் QB நிலையின் நுழைவாயிலில் பிணைக்கப்படுவதைக் கண்டறிந்தது, இது மூடிய இணக்கமாக மறுசீரமைப்பைத் தடுக்கலாம். 1EYS அல்லது 1OGV இல் அதே நிலையில் LDAO சிதைவதில்லை என்றாலும், இந்த RCகள் ஒரே சோப்புப் பொருளைப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்படுகின்றன, எனவே அதே விளைவை உருவாக்கக்கூடும். Rba இன் படிக அமைப்பு. சைட்டோக்ரோம் c2 (PDB ID: 1L9B) உடன் இணைந்து படிகமாக்கப்பட்ட ஸ்பேராய்டுகள் RC, ஒரு மூடிய QB தளத்தைக் கொண்டிருப்பதாகத் தெரிகிறது. இருப்பினும், இந்த விஷயத்தில், RC-M பாலிபெப்டைட்டின் N-முனையப் பகுதி (Q ஹெலிக்ஸில் உள்ள டைர் எச்சத்தின் H பிணைப்பு மூலம் QB பிணைப்பு தளத்துடன் தொடர்பு கொள்கிறது) ஒரு இயற்கைக்கு மாறான இணக்கத்தை ஏற்றுக்கொள்கிறது, மேலும் QB இணக்க மாற்றம் மேலும் ஆராயப்படவில்லை (30). RC-LH114-W கட்டமைப்பில் M பாலிபெப்டைட்டின் இந்த வகையான சிதைவை நாம் காணவில்லை என்பது உறுதியளிக்கிறது, இது RC-LH116 RC இன் N-முனையப் பகுதியைப் போலவே உள்ளது. சோப்பு அடிப்படையிலான LH1 ஆண்டெனாவின் ஒழிப்புக்குப் பிறகு, PDB இல் உள்ள அபோலிபோபுரோட்டீன் RCகள் தீர்க்கப்பட்டன, இது RC மற்றும் சுற்றியுள்ள LH1 வளையத்தின் உள் மேற்பரப்புக்கு இடையிலான இடைவெளியில் உள்ள உள் குயினோன் குளங்கள் மற்றும் லிப்பிட்களை நீக்கியது என்பதையும் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும் (31, 32). சிதைக்கக்கூடிய QB குயினோன் தவிர, அனைத்து துணை காரணிகளையும் RC தக்கவைத்துக்கொள்வதால் அது தொடர்ந்து செயல்படுகிறது, இது குறைவான நிலைத்தன்மை கொண்டது மற்றும் தயாரிப்பு செயல்பாட்டின் போது பெரும்பாலும் இழக்கப்படுகிறது (33). கூடுதலாக, RC இலிருந்து LH1 மற்றும் இயற்கை சுழற்சி லிப்பிட்களை அகற்றுவது சார்ஜ்-பிரிக்கப்பட்ட P+QB-நிலையின் குறைக்கப்பட்ட ஆயுட்காலம் போன்ற செயல்பாடுகளில் தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் என்பது அறியப்படுகிறது (31, 34, 35). எனவே, RC ஐச் சுற்றியுள்ள உள்ளூர் LH1 வளையத்தின் இருப்பு "மூடப்பட்ட" QB தளத்தை பராமரிக்கக்கூடும், இதன் மூலம் QB க்கு அருகிலுள்ள உள்ளூர் சூழலைப் பாதுகாக்கக்கூடும் என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம்.
அபோலிபோபுரோட்டீன் (QB குயினோன் இல்லாமல்) மற்றும் முழுமையான அமைப்பு, தொடர்ச்சியான நிகழ்வுகளுக்குப் பதிலாக, QB தளத்தின் விற்றுமுதலின் இரண்டு ஸ்னாப்ஷாட்களை மட்டுமே பிரதிநிதித்துவப்படுத்தினாலும், ஹைட்ரோகுயினோன் மூலம் மீண்டும் பிணைப்பதைத் தடுக்க பிணைப்பை கேட் செய்ய முடியும் என்பதற்கான அறிகுறிகள் உள்ளன. அபோலிபோபுரோட்டீனின் QB தளத்திற்கு அருகில் குயினோல் மற்றும் குயினோனின் தொடர்பு வேறுபட்டிருக்கலாம், இது RC ஆல் நிராகரிக்கப்படுவதற்கு வழிவகுக்கிறது. குயினோன்களின் பிணைப்பு மற்றும் குறைப்பில் இணக்க மாற்றங்கள் ஒரு பங்கை வகிக்கின்றன என்று நீண்ட காலமாக முன்மொழியப்பட்டது. இருண்ட தழுவலுக்குப் பிறகு குயினோன்களைக் குறைக்க உறைந்த RC களின் திறன் பலவீனமடைகிறது (36); எக்ஸ்-ரே படிகவியல் இந்த சேதம் QB குயினோன்கள் செயலில் உள்ள அருகாமையில் இருந்து சுமார் 4.5 Å தொலைவில் "தொலைதூர" இணக்கத்தில் சிக்கியிருப்பதால் ஏற்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது (26), 37). இந்த தொலைதூர பிணைப்பு இணக்கம் என்பது அபோலிபோபுரோட்டீனுக்கும் முழு வளைய அமைப்புக்கும் இடையிலான இடைநிலை நிலையின் ஒரு ஸ்னாப்ஷாட் ஆகும், இது குயினோன் உடனான ஆரம்ப தொடர்பு மற்றும் QB தளத்தின் திறப்பைத் தொடர்ந்து வருகிறது என்று நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம்.
சில ஃபோட்டோட்ரோபிக் பாக்டீரியாக்கள் மற்றும் சயனோபாக்டீரியா, பாசிகள் மற்றும் தாவரங்களின் PSII வளாகத்தில் காணப்படும் வகை II RC, கட்டமைப்பு மற்றும் செயல்பாட்டு பாதுகாப்பைக் கொண்டுள்ளது (38). படம் 6 (D மற்றும் E) இல் காட்டப்பட்டுள்ள கட்டமைப்பு சீரமைப்பு, PSII RC களுக்கும் பாக்டீரியா RC வளாகத்தின் QB தளத்திற்கும் இடையிலான ஒற்றுமையை வலியுறுத்துகிறது. இந்த ஒப்பீடு நீண்ட காலமாக குயினோன் பிணைப்பு மற்றும் குறைப்பு ஆகியவற்றின் நெருங்கிய தொடர்புடைய அமைப்புகளைப் படிப்பதற்கான ஒரு மாதிரியாக இருந்து வருகிறது. முந்தைய வெளியீடுகள், இணக்க மாற்றங்கள் குயினோன்களின் PSII குறைப்புடன் சேர்ந்துள்ளன என்று பரிந்துரைத்தன (39, 40). எனவே, RC இன் பரிணாம பாதுகாப்பைக் கருத்தில் கொண்டு, ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஃபோட்டோட்ரோபிக் தாவரங்களில் PSII RC இன் QB தளத்திற்கும் இந்த முன்னர் கவனிக்கப்படாத பிணைப்பு வழிமுறை பொருந்தக்கூடும்.
Rps ΔpufW (பெயரிடப்படாத pufW நீக்கம்) மற்றும் PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ஆகியவை இயற்கையான pufW locus) விகாரங்களிலிருந்து வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன. palustris CGA009 எங்கள் முந்தைய வேலையில் (16) விவரிக்கப்பட்டது. இந்த விகாரங்கள் மற்றும் ஐசோஜெனிக் காட்டு-வகை பெற்றோர் PYE (ஒவ்வொன்றும் 5 கிராம் லிட்டர் -1) (LB இல் -80 °C இல் சேமிக்கப்பட்டது, 50% (w/v) கிளிசரால்) புரதம், ஈஸ்ட் சாறு மற்றும் சக்சினேட் ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது) agar [1.5% (w/v)] தட்டில் ஒரு சிறிய எண்ணிக்கையிலான செல்களை ஸ்ட்ரீக் செய்வதன் மூலம் ஃப்ரீசரில் இருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்டது. இந்த தட்டு காற்றில்லா நிலைமைகளின் கீழ் அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் OSRAM 116-W ஹாலஜன் பல்புகள் (RS கூறுகள், UK) வழங்கிய வெள்ளை ஒளியால் (~50 μmolm-2 s-1) ஒளிரச் செய்யப்பட்டது, ஒரு ஒற்றை காலனி தோன்றும் வரை 3 முதல் 5 நாட்கள் வரை. ஒரு ஒற்றைக் காலனியில் 10 மில்லி M22+ மீடியம் (41) ஐ 0.1% (w/v) காசமினோ அமிலங்களுடன் (இனி M22 என குறிப்பிடப்படுகிறது) கூடுதலாக வழங்கினர். இந்த வளர்ப்பு குறைந்த ஆக்ஸிஜன் சூழ்நிலையில் இருட்டில் 34°C வெப்பநிலையில் 180 rpm இல் 48 மணி நேரம் குலுக்கல் மூலம் வளர்க்கப்பட்டது, பின்னர் 70 மில்லி வளர்ப்பு அதே நிலைமைகளின் கீழ் 24 மணி நேரம் செலுத்தப்பட்டது. 1 மில்லி அளவு கொண்ட ஒரு அரை-ஏரோபிக் வளர்ப்பு, 30 மில்லி உலகளாவிய திருகு-மேல் வெளிப்படையான கண்ணாடி பாட்டிலில் 30 மில்லி M22 மீடியத்தை செலுத்தப் பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் மலட்டு காந்த விசை கிளறி கம்பியால் 48 மணி நேரம் கிளர்ச்சியுடன் (~50μmolm-2 s-1) கதிர்வீச்சு செய்யப்படுகிறது. பின்னர் 30 மில்லி வளர்ப்பு அதே நிலைமைகளின் கீழ் சுமார் 1 லிட்டர் வளர்ப்புடன் செலுத்தப்பட்டது, பின்னர் இது ~200 μmolm-2 s-1 இல் ஒளிரும் சுமார் 9 லிட்டர் வளர்ப்பை 72 மணி நேரம் செலுத்தப் பயன்படுத்தப்பட்டது. செல்கள் 7132 RCF இல் 30 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டு, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) இன் ~10 மில்லியில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, தேவைப்படும் வரை -20°C இல் சேமிக்கப்பட்டன.
உருகிய பிறகு, மீண்டும் இணைக்கப்பட்ட செல்களில் டிஆக்ஸிரைபோனூக்லீஸ் I (மெர்க், யுகே), லைசோசைம் (மெர்க், யுகே) மற்றும் இரண்டு ரோச் ஹோலோஎன்சைம் புரோட்டீஸ் தடுப்பான் மாத்திரைகள் (மெர்க், யுகே) ஆகியவற்றின் சில படிகங்களைச் சேர்க்கவும். 20,000 psi பிரெஞ்சு அழுத்த கலத்தில் (அமின்கோ, யுஎஸ்ஏ), செல்கள் 8 முதல் 12 முறை சீர்குலைக்கப்பட்டன. 18,500 RCF இல் 4°C இல் 15 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் உடைக்கப்படாத செல்கள் மற்றும் கரையாத குப்பைகளை அகற்றிய பிறகு, 113,000 RCF இல் 43,000°C இல் 2 மணி நேரம் மையவிலக்கு மூலம் நிறமி லைசேட்டிலிருந்து சவ்வு வீழ்படிவாக்கப்பட்டது. கரையக்கூடிய பகுதியை நிராகரித்து, 100 முதல் 200 மில்லி 20 mM tris-HCl (pH 8.0) இல் வண்ண சவ்வை மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, காணக்கூடிய திரட்டுகள் இல்லாத வரை ஒரே மாதிரியாக மாற்றவும். இடைநிறுத்தப்பட்ட சவ்வு 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) இல் 2% (w/v) β-DDM ஐக் கொண்டு 4°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் இருட்டில் மெதுவாகக் கிளறி அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர் 70°C வெப்பநிலையில் மையவிலக்கு மூலம் 150,000 RCF ஐ 4°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் கரைத்து மீதமுள்ள கரையாத பொருட்களை அகற்றவும்.
ΔpufW திரிபிலிருந்து கரைக்கும் சவ்வு, 0.03% (w / v) β-DDM கொண்ட பிணைப்பு இடையகத்தின் மூன்று நெடுவரிசை தொகுதிகள் (CV) கொண்ட 50 மில்லி DEAE செபரோஸ் அயன் பரிமாற்ற நெடுவரிசையில் பயன்படுத்தப்பட்டது [20 mM tris-HCl (pH 8.0)]. இரண்டு CV பிணைப்பு இடையகங்களைக் கொண்டு நெடுவரிசையைக் கழுவவும், பின்னர் 50 mM NaCl கொண்ட இரண்டு பிணைப்பு இடையகங்களைக் கொண்டு நெடுவரிசையைக் கழுவவும். RC-LH116 வளாகம் 1.75 CV இல் 150 முதல் 300 mM NaCl (பிணைப்பு இடையகத்தில்) நேரியல் சாய்வுடன் நீக்கப்பட்டது, மீதமுள்ள பிணைப்பு வளாகம் 0.5 CV இல் 300 mM NaCl கொண்ட பிணைப்பு இடையகத்துடன் நீக்கப்பட்டது. 250 முதல் 1000 nm வரையிலான உறிஞ்சுதல் நிறமாலையைச் சேகரித்து, உறிஞ்சுதல் விகிதம் (A880/A280) 1 ஐ விட அதிகமாக உள்ள பகுதியை 880 முதல் 280 nm வரை வைத்து, பிணைப்பு இடையகத்தில் இரண்டு முறை நீர்த்துப்போகச் செய்து, DEAE நெடுவரிசையில் மீண்டும் அதே நடைமுறையைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிப்பு செய்யவும். 1.7 ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதங்களுடனும், 3.0 ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதங்களுடனும் பின்னங்களை நீர்த்துப்போகச் செய்து, மூன்றாவது சுற்று அயனி பரிமாற்றத்தைச் செய்து, 2.2 ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதங்களுடனும், 5.0 ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதங்களுடனும் பின்னங்களைத் தக்க வைத்துக் கொள்ளுங்கள். பகுதியளவு சுத்திகரிக்கப்பட்ட வளாகம் அமிகான் 100,000 மூலக்கூறு எடை கட்-ஆஃப் (MWCO) மையவிலக்கு வடிகட்டியில் (மெர்க், UK) ~2 மில்லிக்கு செறிவூட்டப்பட்டு, 200 mM NaCl இடையகத்தைக் கொண்ட சூப்பர்டெக்ஸ் 200 16/600 அளவு விலக்கு நெடுவரிசையில் (GE ஹெல்த்கேர், US) ஏற்றப்பட்டு, பின்னர் அதே இடையகத்தில் 1.5 CV இல் நீக்கப்பட்டது. அளவு விலக்கு பின்னத்தின் உறிஞ்சுதல் நிறமாலையைச் சேகரித்து, உறிஞ்சுதல் நிறமாலையை 2.4 க்கு மேல் A880/A280 விகிதங்களுடனும், 5.8 முதல் 100 A880 க்கு மேல் A880/A805 விகிதங்களுடனும் செறிவூட்டவும், உடனடியாக அவற்றை கிரையோ-TEM கட்டம் தயாரிப்பு அல்லது சேமிப்பிற்காகப் பயன்படுத்தவும். தேவைப்படும் வரை -80°C இல் வைத்திருங்கள்.
PufW-His திரிபிலிருந்து கரைக்கும் சவ்வு, IMAC இடையகத்தில் (GE Healthcare) 200 mM NaCl மற்றும் 0.03% (w/w) கொண்ட 20 mM tris-HCl (pH 8.0) கொண்ட 200 mM NaCl) β-DDM] 20 மில்லி HisPrep FF Ni-NTA செபரோஸ் நெடுவரிசையில் பயன்படுத்தப்பட்டது. நெடுவரிசை ஐந்து CVகள் IMAC இடையகத்தாலும், பின்னர் 10 mM ஹிஸ்டைடைன் கொண்ட ஐந்து CVகள் IMAC இடையகத்தாலும் கழுவப்பட்டது. மைய வளாகம் 100 mM ஹிஸ்டைடைன் கொண்ட ஐந்து IMAC இடையகத்தாலும் நெடுவரிசையிலிருந்து நீக்கப்பட்டது. RC-LH114-W வளாகத்தைக் கொண்ட பின்னம், அமிகான் 100,000 MWCO வடிகட்டி (மெர்க், UK) பொருத்தப்பட்ட ஒரு கிளறி தொட்டியில் ~10 மில்லி வரை செறிவூட்டப்பட்டு, பிணைப்பு இடையகத்துடன் 20 முறை நீர்த்தப்பட்டு, பின்னர் 25 மில்லியுடன் சேர்க்கப்படுகிறது. DEAE செபரோஸ் நெடுவரிசையில், இடையகத்துடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்கு CVகள் முன்கூட்டியே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. நான்கு CV பிணைப்பு இடையகங்களுடன் நெடுவரிசையைக் கழுவவும், பின்னர் 0 முதல் 100 mM NaCl (பிணைப்பு இடையகத்தில்) வரையிலான நேரியல் சாய்வில் எட்டு CVகளில் வளாகத்தை நீக்கவும், மீதமுள்ள நான்கு CVகளில் 100 mM பிணைப்பு இடையகத்தைக் கொண்டவை. சோடியம் குளோரைடில் நீக்கப்பட்ட எஞ்சிய வளாகங்கள் 2.4 ஐ விட அதிகமான A880/A280 விகிதம் மற்றும் 4.6 ஐ விட அதிகமான A880/A805 விகிதம் பின்னங்களுடன் இணைந்து அமிகான் 100,000 MWCO மையவிலக்கு வடிகட்டியில் ~2 மில்லிக்கு செறிவூட்டப்பட்டு, முன்கூட்டியே 1.5 CV IMAC உடன் நிரப்பப்பட்டன. இடையக சமநிலைப்படுத்தப்பட்ட Superdex 200 16/600 அளவு விலக்கு நெடுவரிசை, பின்னர் 1.5 CV க்கு மேல் அதே இடையகத்தில் நீக்கப்பட்டது. அளவு-விலக்கு பின்னங்களின் உறிஞ்சுதல் நிறமாலையைச் சேகரித்து, உறிஞ்சுதல் நிறமாலையை 2.1 க்கு மேல் A880/A280 விகிதங்களுடனும், 4.6 முதல் 100 A880 க்கு மேல் A880/A805 விகிதங்களுடனும் செறிவூட்டவும், இவை உடனடியாக உறைந்த TEM கட்டம் தயாரிப்பிற்குப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன அல்லது தேவைப்படும் வரை -80°C இல் சேமிக்கப்படுகின்றன.
குறைந்த வெப்பநிலை TEM கட்டங்களைத் தயாரிக்க Leica EM GP மூழ்கல் உறைவிப்பான் பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த வளாகம் IMAC இடையகத்தில் 50 இன் A880 க்கு நீர்த்தப்பட்டது, பின்னர் 5μl புதிதாக ஒளிரும்-வெளியேற்றப்பட்ட QUANTIFOIL 1.2/1.3 கார்பன்-பூசப்பட்ட செப்பு வலையில் (Agar Scientific, UK) ஏற்றப்பட்டது. கட்டத்தை 20°C மற்றும் 60% ஈரப்பதத்தில் 30 வினாடிகளுக்கு அடைகாத்து, பின்னர் 3 வினாடிகளுக்கு உலர வைத்து, பின்னர் -176°C இல் திரவ ஈத்தேன் இல் தணிக்கவும்.
RC-LH114-W வளாகத்தின் தரவு, 300kV முடுக்க மின்னழுத்தத்தில் இயங்கும் டைட்டன் கிரியோஸ் நுண்ணோக்கி மூலம் eBIC (எலக்ட்ரானிக் பயோஇமேஜிங் சென்டர்) (பிரிட்டிஷ் வைர ஒளி மூலம்) இல் பதிவு செய்யப்பட்டது, இது 130,000× பெயரளவு உருப்பெருக்கம் மற்றும் 20 eV இடைவெளியைத் தேர்ந்தெடுக்கும் ஆற்றலுடன் செயல்படுகிறது. K2 பீக் டிடெக்டருடன் கூடிய ஒரு கட்டான் 968 GIF குவாண்டம், தரவைச் சேகரிக்க எண்ணும் முறையில் படங்களைப் பதிவு செய்யப் பயன்படுத்தப்பட்டது. அளவீடு செய்யப்பட்ட பிக்சல் அளவு 1.048Å, மற்றும் டோஸ் விகிதம் 3.83 e-Å-2s-1. 11 வினாடிகளில் மூவியைச் சேகரித்து 40 பகுதிகளாகப் பிரித்தது. நுண்ணோக்கியை மீண்டும் குவியப்படுத்த கார்பன் பூசப்பட்ட பகுதியைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் ஒரு துளைக்கு மூன்று மூவிகளைச் சேகரிக்கவும். மொத்தத்தில், 3130 மூவிகள் சேகரிக்கப்பட்டன, -1 மற்றும் -3μm க்கு இடையில் டிஃபோகஸ் மதிப்புகளுடன்.
RC-LH116 வளாகத்திற்கான தரவு, ஆஸ்டர்பரி பயோஸ்ட்ரக்சர் ஆய்வகத்தில் (லீட்ஸ் பல்கலைக்கழகம், UK) அதே நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி சேகரிக்கப்பட்டது. தரவு 130 k உருப்பெருக்கத்துடன் எண்ணும் முறையில் சேகரிக்கப்பட்டது, மேலும் பிக்சல் அளவு 4.6 e-Å-2s-1 டோஸுடன் 1.065 Å ஆக அளவீடு செய்யப்பட்டது. திரைப்படம் 12 வினாடிகளில் பதிவு செய்யப்பட்டு 48 பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது. மொத்தத்தில், 3359 படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன, -1 முதல் -3μm வரையிலான டிஃபோகஸ் மதிப்புகளுடன்.
அனைத்து தரவு செயலாக்கமும் Relion 3.0 பைப்லைனில் (42) செய்யப்படுகிறது. டோஸ் வெயிட்டிங் மூலம் பீம் இயக்கத்தை சரிசெய்ய Motioncorr 2 (43) ஐப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் CTF (கான்ட்ராஸ்ட் டிரான்ஸ்ஃபர் செயல்பாடு) அளவுருவை தீர்மானிக்க CTFFIND 4.1 (44) ஐப் பயன்படுத்தவும். இந்த ஆரம்ப செயலாக்க நிலைகளுக்குப் பிறகு வழக்கமான ஃபோட்டோமைக்ரோகிராஃப்கள் படம் 2 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. S16. 250-பிக்சல் சட்டகத்தில் 1000 துகள்களில் சுமார் 250 பிக்சல்களை கைமுறையாகத் தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலமும், எந்த குறிப்பு இரு பரிமாண (2D) வகைப்பாட்டிலும் தானியங்கி தேர்வு டெம்ப்ளேட் உருவாக்கப்படுகிறது, இதன் மூலம் மாதிரி மாசுபாட்டை சந்திக்கும் அல்லது எந்த தெளிவான பண்புகளும் இல்லாத வகைப்பாடுகளை நிராகரிக்கிறது. பின்னர், அனைத்து மைக்ரோஃபோட்டோகிராஃப்களிலும் தானியங்கி தேர்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் RC-LH114-W 849,359 துகள்களாகவும், RC-LH116 வளாகம் 476,547 துகள்களாகவும் இருந்தது. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து துகள்களும் இரண்டு சுற்றுகள் அல்லாத குறிப்பு 2D வகைப்பாட்டிற்கு உட்பட்டுள்ளன, மேலும் ஒவ்வொரு ஓட்டத்திற்கும் பிறகு, கார்பன் பகுதியை சந்திக்கும் துகள்கள், மாதிரி மாசுபாடு, வெளிப்படையான அம்சங்கள் இல்லை அல்லது வலுவாக ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும் துகள்கள் நிராகரிக்கப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக 772,033 (90.9%) மற்றும் 359,678 (75.5%) ) RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 இன் 3D வகைப்பாட்டிற்கு துகள்கள் முறையே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. ஆரம்ப 3D குறிப்பு மாதிரி சீரற்ற சாய்வு இறங்கு முறையைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டது. ஆரம்ப மாதிரியை ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தி, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட துகள்கள் 3D இல் நான்கு வகைகளாக வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. இந்த வகை மாதிரியை ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தி, மிகப்பெரிய வகையிலுள்ள துகள்களில் 3D சுத்திகரிப்பைச் செய்யவும், பின்னர் கரைப்பான் பகுதியை மறைக்க ஆரம்ப 15Å குறைந்த-பாஸ் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தவும், மென்மையான விளிம்புகளின் 6 பிக்சல்களைச் சேர்க்கவும், மற்றும் மேல் கண்டறிபவரின் கட்டான் K2 உச்ச மாடுலேஷன் பரிமாற்ற செயல்பாட்டை சரிசெய்ய பிக்சல்களை பிந்தைய செயலாக்கத்தைப் பயன்படுத்தவும். RC-LH114-W தரவுத்தொகுப்பிற்கு, முகமூடியின் விளிம்புகளில் உள்ள வலுவான அடர்த்தியை அகற்றுவதன் மூலம் இந்த ஆரம்ப மாதிரி மாற்றியமைக்கப்பட்டது (UCSF கைமேராவில் உள்ள மைய சிக்கலான அடர்த்தியிலிருந்து துண்டிக்கப்பட்டது). இதன் விளைவாக வரும் மாதிரிகள் (RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 இன் தீர்மானங்கள் முறையே 3.91 மற்றும் 4.16 Å ஆகும்) 3D வகைப்பாட்டின் இரண்டாவது சுற்றுக்கான குறிப்பாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பயன்படுத்தப்படும் துகள்கள் ஆரம்ப 3D வகுப்பில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளன மற்றும் அக்கம் பக்கத்துடன் வலுவான தொடர்பைக் கொண்டிருக்கவில்லை. வெளிப்படையான கட்டமைப்பு அம்சங்கள் ஒன்றுடன் ஒன்று அல்லது இல்லாமை. 3D வகைப்பாட்டின் இரண்டாவது சுற்றுக்குப் பிறகு, மிக உயர்ந்த தெளிவுத்திறன் கொண்ட வகை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது [RC-LH114-W க்கு, ஒரு வகை 377,703 துகள்கள் (44.5%), RC-LH116 க்கு, இரண்டு பிரிவுகள் உள்ளன, மொத்தம் 260,752 துகள்கள் (54.7%), ஆரம்ப சுழற்சிக்குப் பிறகு ஒரு சிறிய வித்தியாசத்துடன் சீரமைக்கப்படும்போது மட்டுமே அவை ஒரே மாதிரியாக இருக்கும்]. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட துகள்கள் 400-பிக்சல் பெட்டியில் மீண்டும் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு 3D சுத்திகரிப்பு மூலம் சுத்திகரிக்கப்படுகின்றன. கரைப்பான் முகமூடி ஆரம்ப 15Å குறைந்த-பாஸ் வடிகட்டி, 3 பிக்சல் வரைபட விரிவாக்கம் மற்றும் 3 பிக்சல் மென்மையான முகமூடியைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்படுகிறது. ஒவ்வொரு துகள் CTF சுத்திகரிப்பு, ஒவ்வொரு துகள் இயக்க திருத்தம் மற்றும் இரண்டாவது சுற்று CTF சுத்திகரிப்பு, 3D சுத்திகரிப்பு, கரைப்பான் மறைத்தல் மற்றும் பிந்தைய செயலாக்கம் ஆகியவை ஒவ்வொரு படிநிலைக்குப் பிறகும் செய்யப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக வரும் அமைப்பை மேலும் சுத்திகரிக்கின்றன. FSC (ஃபோரியர் ஷெல் கூட்டுறவு குணகம்) கட்-ஆஃப் மதிப்பு 0.143 ஐப் பயன்படுத்தி, RC-LH114-W மற்றும் RC-LH116 இன் இறுதி மாதிரிகளின் தீர்மானங்கள் முறையே 2.65 மற்றும் 2.80Å ஆகும். இறுதி மாதிரியின் FSC வளைவு படம் 2. S17 இல் காட்டப்பட்டுள்ளது.
அனைத்து புரத வரிசைகளும் UniProtKB இலிருந்து பதிவிறக்கம் செய்யப்படுகின்றன: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); புரதம்-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M மற்றும் RC-H ஆகியவற்றின் புரத வரிசைகளையும் Rba இன் படிக அமைப்பையும் கொண்ட RC இன் ஹோமோலஜி மாதிரியை உருவாக்க SWISS-MODEL (45) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஸ்பேராய்டுகள் RC ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது (PDB ID: 5LSE) (46). உருவாக்கப்பட்ட மாதிரியை வரைபடத்துடன் பொருத்த UCSF கைமேராவில் உள்ள “ஃபிட் மேப்” கருவியைப் பயன்படுத்தவும் (47), புரத அமைப்பை மேம்படுத்தவும், இணை காரணி [4×BChl a (மோனோமர் நூலக எச்சத்தின் பெயர் = BCL), 2×BPh a (BPH), ஒன்று அல்லது இரண்டு வகையான UQ10 (U10), ஒரு ஹீம் அல்லாத இரும்பு (Fe) மற்றும் ஒரு 3,4-டைஹைட்ரோஹெக்ஸாகார்போனைல்கோலின் (QAK)] ஆகியவற்றைச் சேர்க்க கூட் (48) ஐப் பயன்படுத்தவும். மோனோமர் நூலகத்தில் QAK கிடைக்காததால், அது PHENIX (49) இல் உள்ள eLBOW கருவியைப் பயன்படுத்தி அளவுருவாக்கப்பட்டது.
அடுத்து, LH1 துணை அலகு கட்டமைக்கப்பட்டது. ஆரம்பத்தில், PHENIX (49) இல் உள்ள தானியங்கி கட்டுமான கருவி, வரைபடத்தைப் பயன்படுத்தி LH1-α மற்றும் LH1-β புரத வரிசைகளை உள்ளீடாக LH1 வரிசையின் ஒரு பகுதியை தானாக உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது. மிகவும் முழுமையான LH1 துணை அலகைத் தேர்ந்தெடுத்து, அதைப் பிரித்தெடுத்து, கூட்டில் ஏற்றவும், அதில் காணாமல் போன வரிசையை கைமுறையாகச் சேர்க்கவும், மேலும் இரண்டு BCls a (BCL) மற்றும் ஒரு ஸ்பைரில்லோக்சாந்தின் (CRT) ஆகியவற்றைச் சேர்ப்பதற்கு முன் முழு அமைப்பையும் கைமுறையாகச் செம்மைப்படுத்தவும் [தொடர்புடைய Rps படி LH1 வளாகத்தின் அடர்த்தி மற்றும் அறியப்பட்ட கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கம். இனங்கள் (17)]. முழுமையான LH1 துணை அலகை நகலெடுத்து, UCSF சிமேரா “டாக்கிங் மேப் கருவி”யைப் பயன்படுத்தி அருகிலுள்ள மாதிரி அல்லாத LH1 அடர்த்தி பகுதியில் டாக் செய்யவும், பின்னர் அதை கூட்டில் சுத்திகரிக்கவும்; அனைத்து LH1 துணை அலகுகளும் மாதிரியாக்கப்படும் வரை செயல்முறையை மீண்டும் செய்யவும். RC-LH114-W கட்டமைப்பிற்கு, கூட்டில் ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தியைப் பிரித்தெடுப்பதன் மூலம், USCF கைமேரா வரைபடத்தில் மீதமுள்ள புரதமற்ற கூறுகளிலிருந்து புரதம் பிரிக்கப்படுகிறது, மேலும் ஆரம்ப மாதிரியை நிறுவ ஆட்டோபில்ட் கருவி பயன்படுத்தப்படுகிறது, மீதமுள்ள துணை அலகுகள் (புரதம்-W) மாடலிங். PHENIX (49) இல். கூட்டில் (48) விளைந்த மாதிரியில் ஏதேனும் விடுபட்ட வரிசைகளைச் சேர்க்கவும், பின்னர் முழு துணை அலகையும் கைமுறையாகச் செம்மைப்படுத்தவும். மீதமுள்ள ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தி லிப்பிடுகளின் சேர்க்கைக்கு (CDL = CDL, POPC = 6PL மற்றும் POPG = PGT இன் PDB மோனோமர் நூலக ஐடி), β-DDM சோப்பு (LMT) மற்றும் UQ10 மூலக்கூறுகள் (U10) பொருந்துகிறது. மாதிரி புள்ளிவிவரங்கள் மற்றும் பொருத்தத்தின் காட்சி தரத்தை மேலும் மேம்படுத்த முடியாத வரை முழுமையான ஆரம்ப மாதிரியை முழுமையாக்க, கூடில் (48) PHENIX உகப்பாக்கம் (49) மற்றும் கைமுறை உகப்பாக்கம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தவும். இறுதியாக, உள்ளூர் வரைபடத்தைக் கூர்மைப்படுத்த LocScale (50) ஐப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் ஒதுக்கப்படாத அடர்த்தி மற்றும் தானியங்கி மற்றும் கைமுறை உகப்பாக்கத்தை மாதிரியாக்குவதற்கான பல சுழற்சிகளைச் செய்யவும்.
அந்தந்த அடர்த்திகளுக்குள் இணைக்கப்பட்ட அந்தந்த பெப்டைடுகள், இணை காரணிகள் மற்றும் பிற லிப்பிடுகள் மற்றும் குயினோன்கள் படங்கள் 1 மற்றும் 2 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. S18 முதல் S23 வரை. இறுதி மாதிரியின் புள்ளிவிவரத் தகவல்கள் அட்டவணை S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், UV/Vis/NIR உறிஞ்சுதல் நிறமாலைகள் ஒரு Cary60 ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரில் (அஜிலன்ட், அமெரிக்கா) 250 nm முதல் 1000 nm வரை 1 nm இடைவெளியிலும் 0.1s ஒருங்கிணைப்பு நேரத்திலும் சேகரிக்கப்பட்டன.
மாதிரியை 2 மிமீ பாதை A880 க்கு 1 உடன் குவார்ட்ஸ் குவெட்டில் நீர்த்துப்போகச் செய்து, உறிஞ்சுதல் நிறமாலையை 400 முதல் 1000 nm வரை சேகரிக்கவும். வட்ட டைக்ரோயிக் நிறமாலை ஜாஸ்கோ 810 ஸ்பெக்ட்ரோபோலரிமீட்டரில் (ஜாஸ்கோ, ஜப்பான்) 400 nm முதல் 950 nm வரை 1 nm இடைவெளியில் 20 nm நிமிடம்-1 ஸ்கேன் விகிதத்தில் சேகரிக்கப்பட்டது.
மைய வளாகத்தை தோராயமாக 50 இன் A880 ஆக நீர்த்துப்போகச் செய்வதன் மூலம் மோலார் அழிவு குணகம் தீர்மானிக்கப்படுகிறது. 10μl அளவை 990μl பிணைப்பு இடையகம் அல்லது மெத்தனாலில் நீர்த்துப்போகச் செய்து, BChl சிதைவைக் குறைக்க உடனடியாக உறிஞ்சுதல் நிறமாலையைச் சேகரிக்கவும். ஒவ்வொரு மெத்தனால் மாதிரியின் BChl உள்ளடக்கமும் 54.8 mM-1 cm-1 இன் 771 nm இல் அழிவு குணகம் மூலம் கணக்கிடப்பட்டது, மேலும் அழிவு குணகம் தீர்மானிக்கப்பட்டது (51). மைய சிக்கலான செறிவைத் தீர்மானிக்க அளவிடப்பட்ட BChl செறிவை 32 (RC-LH114-W) அல்லது 36 (RC-LH116) ஆல் வகுக்கவும், பின்னர் இடையக அழிவு குணகத்தில் சேகரிக்கப்பட்ட அதே மாதிரியின் உறிஞ்சுதல் நிறமாலையை தீர்மானிக்க இது பயன்படுத்தப்படுகிறது. இணையாக. ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் மூன்று முறை மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகள் எடுக்கப்பட்டன, மேலும் BChl Qy அதிகபட்சத்தின் சராசரி உறிஞ்சுதல் கணக்கீட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. 878 nm இல் அளவிடப்பட்ட RC-LH114-W இன் அழிவு குணகம் 3280±140 mM-1 cm-1 ஆகும், அதே நேரத்தில் 880 nm இல் அளவிடப்பட்ட RC-LH116 இன் அழிவு குணகம் 3800±30 mM-1 cm-1 ஆகும்.
(52) இல் உள்ள முறையின்படி UQ10 அளவிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, தலைகீழ் கட்ட HPLC (RP-HPLC) அஜிலன்ட் 1200 HPLC அமைப்பைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. 0.02% (w/v) ஃபெரிக் குளோரைடு கொண்ட 50:50 மெத்தனால்: குளோரோஃபார்மில் சுமார் 0.02 nmol RC-LH116 அல்லது RC-LH114-W ஐ 50μl இல் கரைத்து, 0.02% (w/v) ஃபெரிக் குளோரைடு கொண்ட முன்-சமநிலைப்படுத்தப்பட்ட பெக்மேன் கூல்டர் அல்ட்ராஸ்பியர் ODS 4.6 மிமீ செலுத்தவும். ×25 செ.மீ நெடுவரிசையில் HPLC கரைப்பானில் (80:20 மெத்தனால்:2-புரோப்பனால்) 40°C இல் 1 மில்லி-1 நிமிடம்-1 இல் கரைக்கவும். 275 nm (UQ10), 450 nm (கரோட்டினாய்டுகள்) மற்றும் 780 nm (BChl) இல் 1 மணி நேரத்திற்கு உறிஞ்சுதலைக் கண்காணிக்க HPLC கரைப்பானில் ஐசோக்ரடிக் நீக்குதலைச் செய்யவும். 25.5 நிமிடங்களில் 275 nm குரோமடோகிராமில் உச்சம் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது, இதில் வேறு எந்த கண்டறியக்கூடிய சேர்மங்களும் இல்லை. 0 முதல் 5.8 nmol வரையிலான தூய தரநிலைகளை செலுத்துவதன் மூலம் கணக்கிடப்பட்ட அளவுத்திருத்த வளைவைக் குறிப்பிட்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்ட UQ10 இன் மோலார் அளவைக் கணக்கிட ஒருங்கிணைந்த பகுதி பயன்படுத்தப்படுகிறது (படம் S14). ஒவ்வொரு மாதிரியும் மூன்று பிரதிகளில் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் அறிக்கையிடப்பட்ட பிழை சராசரியின் SD உடன் ஒத்துள்ளது.
அதிகபட்ச Qy உறிஞ்சுதல் 0.1 கொண்ட RC-LH1 வளாகத்தைக் கொண்ட ஒரு கரைசல் 30 μM குறைக்கப்பட்ட குதிரை இதய சைட்டோக்ரோம் c2 (மெர்க், UK) மற்றும் 0 முதல் 50 μMUQ2 (மெர்க், UK) ஆகியவற்றைக் கொண்டு தயாரிக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு UQ2 செறிவிலும் மூன்று 1-மிலி மாதிரிகள் தயாரிக்கப்பட்டு, அளவீட்டிற்கு முன் இருட்டிற்கு முழுமையான தழுவலை உறுதி செய்வதற்காக 4°C வெப்பநிலையில் இருட்டில் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டன. இந்தக் கரைசல் 300 nm சுடர்/500 வரி கிராட்டிங், 1.24 mm இன்லெட், 0.12 mm நடுத்தர மற்றும் 0.6 mm அவுட்லெட் பிளவுகளுடன் பொருத்தப்பட்ட OLIS RSM1000 மாடுலர் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரில் ஏற்றப்பட்டது. தூண்டுதல் ஒளியைத் தவிர்ப்பதற்காக மாதிரி போட்டோடியூப் மற்றும் குறிப்பு போட்டோமல்டிபிளையர் குழாயின் நுழைவாயிலில் 600 nm நீளமான பாஸ் வடிகட்டி வைக்கப்பட்டுள்ளது. உறிஞ்சுதல் 550 nm இல் 0.15 வினாடிகள் ஒருங்கிணைப்பு நேரத்துடன் கண்காணிக்கப்பட்டது. இந்த தூண்டுதல் ஒளி 880 nm M880F2 LED (ஒளி உமிழும் டையோடு) (தோர்லாப்ஸ் லிமிடெட், UK) இலிருந்து 90% தீவிரத்தில் ஃபைபர் ஆப்டிக் கேபிள் வழியாக DC2200 கட்டுப்படுத்தி (தோர்லாப்ஸ் லிமிடெட், UK) மூலம் வெளியேற்றப்படுகிறது மற்றும் 90° கோணத்தில் ஒளி மூலத்திற்கு வெளியேற்றப்படுகிறது. மாதிரியால் ஆரம்பத்தில் உறிஞ்சப்படாத எந்த ஒளியையும் திருப்பி அனுப்ப அளவிடும் கற்றை கண்ணாடிக்கு எதிராக உள்ளது. 50 வினாடிகளின் வெளிச்சத்திற்கு 10 வினாடிகளுக்கு முன்பு உறிஞ்சுதலைக் கண்காணிக்கவும். பின்னர் குயினோலால் சைட்டோக்ரோம் c23 + ஐ தன்னிச்சையாகக் குறைக்கும் அளவை மதிப்பிடுவதற்கு இருட்டில் 60 வினாடிகளுக்கு உறிஞ்சுதல் மேலும் கண்காணிக்கப்பட்டது (மூல தரவுகளுக்கு படம் S8 ஐப் பார்க்கவும்).
தரவு 0.5 முதல் 10 வினாடிகளுக்குள் (UQ2 செறிவைப் பொறுத்து) ஒரு நேரியல் ஆரம்ப விகிதத்தைப் பொருத்துவதன் மூலமும், ஒவ்வொரு UQ2 செறிவிலும் மூன்று மாதிரிகளின் விகிதங்களை சராசரியாகக் கொண்டும் செயலாக்கப்பட்டது. அந்தந்த அழிவு குணகத்தால் கணக்கிடப்பட்ட RC-LH1 செறிவு விகிதத்தை வினையூக்க செயல்திறனாக மாற்றப் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) இல் திட்டமிடப்பட்டது, மேலும் வெளிப்படையான Km மற்றும் Kcat மதிப்புகளைத் தீர்மானிக்க Michaelis-Menten மாதிரியில் பொருத்தப்பட்டது.
நிலையற்ற உறிஞ்சுதல் அளவீடுகளுக்கு, RC-LH1 மாதிரி 50 mM சோடியம் அஸ்கார்பேட் (மெர்க், அமெரிக்கா) மற்றும் 0.4 mM டெர்புடின் (மெர்க், அமெரிக்கா) ஆகியவற்றைக் கொண்ட IMAC இடையகத்தில் ~2μM ஆக நீர்த்தப்பட்டது. அஸ்கார்பிக் அமிலம் ஒரு தியாக எலக்ட்ரான் நன்கொடையாளராகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் டெர்ட்-பியூட்டாக்ளோஃபென் ஒரு QB தடுப்பானாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது முக்கிய RC நன்கொடையாளர் அளவீட்டு செயல்முறை முழுவதும் குறைக்கப்படுவதை உறுதி செய்கிறது (அதாவது, ஃபோட்டோஆக்ஸிஜனேற்றம் செய்யப்படவில்லை). லேசர் பாதையில் உள்ள மாதிரி தூண்டுதல் துடிப்புகளுக்கு இடையில் இருண்ட தழுவலுக்கு போதுமான நேரத்தைக் கொண்டிருப்பதை உறுதிசெய்ய, 2 மிமீ ஆப்டிகல் பாதை நீளத்துடன் கூடிய தனிப்பயன் சுழலும் கலத்தில் (சுமார் 0.1 மீ விட்டம், 350 RPM) தோராயமாக 3 மில்லி மாதிரி சேர்க்கப்படுகிறது. 1 kHz (NIR க்கு 20 nJ அல்லது Vis க்கு 100 nJ) மீண்டும் மீண்டும் விகிதத்தில் 880 nm இல் மாதிரியைத் தூண்ட Ti: Sapphire லேசர் அமைப்பை (ஸ்பெக்ட்ரா இயற்பியல், அமெரிக்கா) பெருக்க ~100-fs லேசர் துடிப்புகளைப் பயன்படுத்தவும். தரவைச் சேகரிப்பதற்கு முன், மாதிரியை சுமார் 30 நிமிடங்கள் தூண்டுதல் ஒளியில் வெளிப்படுத்தவும். வெளிப்பாடு QA செயலிழப்புக்கு வழிவகுக்கும் (ஒருவேளை QA ஐ ஒன்று அல்லது இரண்டு முறை குறைக்கலாம்). ஆனால் இந்த செயல்முறை மீளக்கூடியது என்பதை நினைவில் கொள்ளவும், ஏனெனில் நீண்ட கால இருண்ட தழுவலுக்குப் பிறகு, RC மெதுவாக QA செயல்பாட்டிற்குத் திரும்பும். -10 முதல் 7000 ps வரை தாமத நேரத்துடன் நிலையற்ற நிறமாலையை அளவிட ஒரு ஹீலியோஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் (அல்ட்ராஃபாஸ்ட் சிஸ்டம்ஸ், USA) பயன்படுத்தப்பட்டது. தரவுத் தொகுப்புகளை பிரிக்க, பின்னர் ஒன்றிணைத்து தரப்படுத்த சர்ஃபேஸ் எக்ஸ்ப்ளோரர் மென்பொருளை (அல்ட்ராஃபாஸ்ட் சிஸ்டம்ஸ், USA) பயன்படுத்தவும். சிதைவுடன் தொடர்புடைய வேறுபட்ட நிறமாலையைப் பெற ஒருங்கிணைந்த தரவுத் தொகுப்பைப் பயன்படுத்த கார்பெட்வியூ மென்பொருள் தொகுப்பை (லைட் கன்வெர்ஷன் லிமிடெட், லிதுவேனியா) பயன்படுத்தவும், அல்லது ஆரிஜினில் (ஆரிஜின்லேப், USA) ஒற்றை-அலைநீள நிறமாலை பரிணாமத்திற்கு பொருந்தும் வகையில் கருவி பதிலுடன் பல அடுக்குகளை இணைக்கும் செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்தவும்.
மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி (53), RC மற்றும் புற LH2 ஆண்டெனா இரண்டும் இல்லாத LH1 வளாகத்தைக் கொண்ட ஒரு ஒளிச்சேர்க்கை படம் தயாரிக்கப்பட்டது. சவ்வு 20 mM ட்ரிஸில் (pH 8.0) நீர்த்தப்பட்டு, பின்னர் 2 மிமீ ஆப்டிகல் பாதையுடன் ஒரு குவார்ட்ஸ் குவெட்டில் ஏற்றப்பட்டது. -10 முதல் 7000 ps தாமத நேரத்துடன் 540 nm இல் மாதிரியைத் தூண்டுவதற்கு 30nJ லேசர் துடிப்பு பயன்படுத்தப்பட்டது. Rps. pal மாதிரிக்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தரவுத் தொகுப்பைச் செயலாக்கவும்.
4°C வெப்பநிலையில் 150,000 RCF வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் மையவிலக்கு மூலம் சவ்வு துளையிடப்பட்டது, பின்னர் 880 nm வெப்பநிலையில் அதன் உறிஞ்சுதல் 20 mM tris-HCl (pH 8.0) மற்றும் 200 mM NaCl இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது. 4°C வெப்பநிலையில் இருட்டில் 1 மணி நேரம் 2% (w/v) β-DDM ஐ மெதுவாகக் கிளறி மென்படலத்தைக் கரைக்கவும். மாதிரி 100 mM ட்ரைஎதிலமோனியம் கார்பனேட் (pH 8.0) (TEAB; மெர்க், UK) இல் 2.5 mg ml-1 புரதச் செறிவுக்கு நீர்த்தப்பட்டது (பயோ-ராட் பகுப்பாய்வு). முன்னர் வெளியிடப்பட்ட முறையிலிருந்து (54) மேலும் செயலாக்கம் மேற்கொள்ளப்பட்டது, 50 μg புரதத்தை 1% (w/v) சோடியம் லாரேட் கொண்ட மொத்தம் 50 μl TEAB இல் நீர்த்துப்போகச் செய்வதில் தொடங்கி (100 mM) சோடியம் லாரேட் (மெர்க், UK). 60 வினாடிகளுக்கு சோனிகேஷனுக்குப் பிறகு, 37°C வெப்பநிலையில் 5 mM டிரிஸ்(2-கார்பாக்சிஎதில்)பாஸ்பைன் (மெர்க், UK) உடன் 30 நிமிடங்களுக்கு குறைக்கப்பட்டது. S-அல்கைலேஷனுக்கு, மாதிரியை 10 mM மெத்தில் S-மெத்தில்தியோமெத்தேன்சல்போனேட்டுடன் (மெர்க், UK) அடைகாத்து, அறை வெப்பநிலையில் 200 mM ஐசோபுரோபனால் ஸ்டாக் கரைசலில் இருந்து 10 நிமிடங்களுக்கு சேர்க்கவும். 2 μg டிரிப்சின்/எண்டோபுரோட்டீனேஸ் லைஸ்-சி கலவையை (ப்ரோமேகா UK) சேர்ப்பதன் மூலம் புரோட்டியோலிடிக் செரிமானம் மேற்கொள்ளப்பட்டது மற்றும் 37°C இல் 3 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. 50 μl எத்தில் அசிடேட் மற்றும் 10 μl 10% (v/v) LC கிரேடு ட்ரைஃப்ளூரோஅசெடிக் அமிலம் (TFA; தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) சேர்த்து 60 வினாடிகளுக்கு சுழல்மயமாக்குவதன் மூலம் லாரேட் சர்பாக்டான்ட் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. 15,700 RCF இல் 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் கட்டப் பிரிப்பு ஊக்குவிக்கப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, பெப்டைடைக் கொண்ட கீழ் கட்டத்தை கவனமாக உறிஞ்சி உப்பு நீக்க ஒரு C18 சுழல் நெடுவரிசை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) பயன்படுத்தப்பட்டது. வெற்றிட மையவிலக்கு மூலம் உலர்த்திய பிறகு, மாதிரி 0.5% TFA மற்றும் 3% அசிட்டோனிட்ரைலில் கரைக்கப்பட்டது, மேலும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட அமைப்பு அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியுடன் இணைக்கப்பட்ட நானோஃப்ளோ RP குரோமடோகிராஃபி மூலம் 500 ng பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
Rps. palustris புரோட்டியோம் தரவுத்தளத்தைத் தேட புரத அடையாளம் மற்றும் அளவீட்டுக்கு MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ஐப் பயன்படுத்தவும் (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி புரோட்டியோம் தரவு PXD020402 என்ற தரவுத்தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியின் கீழ் PRIDE கூட்டாளர் களஞ்சியத்தின் (http://proteomecentral.proteomexchange.org) மூலம் புரோட்டியோம்எக்ஸ்சேஞ்ச் கூட்டணியில் டெபாசிட் செய்யப்பட்டுள்ளது.
எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியுடன் இணைந்து RPLC மூலம் பகுப்பாய்வு செய்ய, RC-LH1 வளாகம் காட்டு-வகை Rps இலிருந்து தயாரிக்கப்பட்டது. முன்னர் வெளியிடப்பட்ட முறையைப் பயன்படுத்தி (16), பலஸ்ட்ரிஸ் செல்களில் உற்பத்தி செய்யப்படும் புரத செறிவு 20 mM ஹெப்ஸில் 2 mg ml-1 (pH 7.8), 100 mM NaCl மற்றும் 0.03% (w/v) β- (பயோ-ராட் பகுப்பாய்வு) ) DDM ஆகும். உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, 2D சுத்திகரிப்பு கருவியை (GE ஹெல்த்கேர், USA) பயன்படுத்தி 10 μg புரதத்தை மழைப்பொழிவு முறை மூலம் பிரித்தெடுக்கவும், மேலும் 20 μl 60% (v/v) ஃபார்மிக் அமிலம் (FA), 20% (v/v) அசிட்டோனிட்ரைல் மற்றும் 20% (v/v) நீரில் வீழ்படிவைக் கரைக்கவும். ஐந்து மைக்ரோலிட்டர்கள் RPLC (Dionex RSLC) மூலம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (Maxis UHR-TOF, Bruker) உடன் இணைந்து பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. 60°C மற்றும் 100μlmin -1 இல் பிரித்தெடுக்க MabPac 1.2×100 மிமீ நெடுவரிசை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) ஐப் பயன்படுத்தவும், 85% (v / v) கரைப்பான் A [0.1% (v / v) FA மற்றும் 0.02% (V/v) TFA நீர் கரைசல்] சாய்வுடன் 85% (v/v) கரைப்பான் B [0.1%(v/v) FA மற்றும் 0.02%(v/v) 90%(v/v) அசிட்டோனிட்ரைல் TFA இல்]] நிலையான எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மூலத்தையும் 60 நிமிடங்களுக்கும் மேலாக இயல்புநிலை அளவுருக்களையும் பயன்படுத்தி, நிறை நிறமாலைமானி 100 முதல் 2750 மீ/z (நிறை-சார்ஜ் விகிதம்) பெறுகிறது. ExPASy பயோஇன்ஃபர்மேடிக்ஸ் வள போர்டல் FindPept கருவியின் (https://web.expasy.org/findpept/) உதவியுடன், நிறை நிறமாலையை வளாகத்தின் துணை அலகுகளுக்கு வரைபடமாக்குங்கள்.
செல்கள் 100 மில்லி NF-குறைந்த (10μMm-2 s-1), நடுத்தர (30μMm-2 s-1) அல்லது அதிக (300μMm-2 s-1) வெளிச்சத்தில் 72 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. 100 மில்லி திருகு-மேல் பாட்டிலில் (23) M22 நடுத்தர (அம்மோனியம் சல்பேட் தவிர்க்கப்பட்டு சோடியம் சசினேட் சோடியம் அசிடேட்டால் மாற்றப்படும் M22 ஊடகம்). ஐந்து 30-வி சுழற்சிகளில், செல்களை லைஸ் செய்ய 0.1 மைக்ரான் கண்ணாடி மணிகள் 1:1 என்ற தொகுதி விகிதத்தில் மணிகளால் ஆனவை மற்றும் 5 நிமிடங்கள் பனியில் குளிர்விக்கப்பட்டன. கரையாத பொருள், உடையாத செல்கள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகள் ஒரு பெஞ்ச்டாப் மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜில் 10 நிமிடங்களுக்கு 16,000 RCF இல் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. இந்த சவ்வு 20 mM tris-HCl (pH 8.0) இல் 100,000 RCF உடன் 40/15% (w/w) சுக்ரோஸ் சாய்வுடன் 10 மணி நேரம் Ti 70.1 ரோட்டரில் பிரிக்கப்பட்டது.
எங்கள் முந்தைய வேலையில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, PufW (16) இல் உள்ள அவரது குறிச்சொல்லின் நோயெதிர்ப்பு கண்டறிதல். சுருக்கமாக, 2x SDS ஏற்றுதல் இடையகத்தில் (மெர்க், UK) சுத்திகரிக்கப்பட்ட மைய வளாகம் (11.8 nM) அல்லது RC இன் அதே செறிவைக் கொண்ட சவ்வு (குறைக்கப்பட்ட வேறுபாடு நிறமாலையைக் கழிப்பதன் மூலம் ஆக்ஸிஜனேற்றம் மற்றும் கறை படிந்த ஜெல்லில் உள்ள சுமையை பொருத்துவதன் மூலம் தீர்மானிக்கப்படுகிறது) இரண்டு முறை நீர்த்தப்பட்டது. புரதங்கள் ஒரு பிரதி 12% பிஸ்-ட்ரிஸ் நுபேஜ் ஜெல்லில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) பிரிக்கப்பட்டன. RC-L துணை அலகை ஏற்றவும் காட்சிப்படுத்தவும் கூமாஸி பிரில்லியன்ட் ப்ளூ (பயோ-ராட், UK) உடன் ஒரு ஜெல் கறை படிந்தது. இரண்டாவது ஜெல்லில் உள்ள புரதம் நோயெதிர்ப்பு ஆய்வுக்காக மெத்தனால்-செயல்படுத்தப்பட்ட பாலிவினைலைடின் ஃப்ளோரைடு (PVDF) சவ்வுக்கு (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், UK) மாற்றப்பட்டது. PVDF சவ்வு 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 மற்றும் 5% (w / v) நீக்கப்பட்ட பால் பவுடரில் அடைக்கப்பட்டு, பின்னர் ஆன்டி-ஹிஸ் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (1:1000 A190-114A, பெத்தில் ஆய்வகங்கள், அமெரிக்கா) 4 மணி நேரம் நீர்த்த ஆன்டிபாடி பஃபரில் [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl மற்றும் 0.05% (v/v) Tween-20] உடன் அடைக்கப்பட்டது. ஆன்டிபாடி பஃபரில் 5 நிமிடங்கள் 3 முறை கழுவிய பிறகு, சவ்வு ஹார்ஸ்ராடிஷ் பெராக்ஸிடேஸ் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், யுகே) உடன் இணைக்கப்பட்டது. எலி எதிர்ப்பு இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடி (ஆன்டிபாடி பஃபரில் 1:10,000 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தப்பட்டது). கண்டறிதலை அனுமதிக்க (ஆன்டிபாடி பஃபரில் 3 கழுவுதல்களுக்குப் பிறகு 5 நிமிடங்கள்) WESTAR ETA C 2.0 கெமிலுமினசென்ஸ் அடி மூலக்கூறு (சயனஜென், இத்தாலி) மற்றும் அமர்ஷாம் இமேஜர் 600 (GE ஹெல்த்கேர், யுகே) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி அடைகாக்கப்பட்டது.
ImageJ (57) இல், ஒவ்வொரு கறை படிந்த ஜெல் அல்லது இம்யூனோஅஸ்ஸே பாதையின் தீவிர பரவலை வரைந்து, சிகரத்தின் கீழ் உள்ள பகுதியை ஒருங்கிணைத்து, RC-L (கறை படிந்த ஜெல்) மற்றும் புரதம்-W (இம்யூனோஅஸ்ஸே) ஆகியவற்றின் தீவிர விகிதத்தைக் கணக்கிடுவதன் மூலம் படத்தை செயலாக்கவும். தூய RC-LH114-W மாதிரியில் RC-L மற்றும் புரதம்-W விகிதம் 1:1 என்று கருதி, அதற்கேற்ப முழு தரவு தொகுப்பையும் இயல்பாக்குவதன் மூலம் இந்த விகிதங்கள் மோலார் விகிதங்களாக மாற்றப்பட்டன.
இந்தக் கட்டுரைக்கான துணைப் பொருட்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ஐப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன் உரிமத்தின் விதிமுறைகளின் கீழ் விநியோகிக்கப்படும் திறந்த அணுகல் கட்டுரை. அசல் படைப்பு முறையாக மேற்கோள் காட்டப்பட்டிருந்தால், எந்தவொரு ஊடகத்திலும் கட்டுப்பாடற்ற பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை இந்தக் கட்டுரை அனுமதிக்கிறது.
குறிப்பு: நீங்கள் பக்கத்திற்கு பரிந்துரைக்கும் நபர் மின்னஞ்சலைப் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் தெரிந்துகொள்ளும் வகையில் மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் உங்களிடம் கேட்கிறோம். எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் நாங்கள் கைப்பற்ற மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளரா என்பதை சோதிக்கவும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுக்கவும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
டேவிட் ஜே.கே. ஸ்வைன்ஸ்பரி, பார்க் கியான், பிலிப் ஜே. ஜாக்சன், கைட்லின் எம். ஃபாரிஸ், டேரியஸ் எம். நீட்ஸ்வீட்ஸ்கி, எலிசபெத் சி. மார்ட்டின், டேவிட் ஏ. ஃபார்மர், லோர்னா ஏ. மலோன், ரெபேக்கா எஃப். தாம்சன், நீல் ஏ. ரான்சன், டேனியல் பி. கன்னிஃப், மார்க் ஜே. டிக்மேன், டீவி ஹோல்டன், கிறிஸ்டின் கிர்மையர், ஆண்ட்ரூ ஹிட்ச்காக், சி. நீல் ஹண்டர்
எதிர்வினை மையத்தில் உள்ள ஒளிப் பொறி 1 வளாகத்தின் உயர் தெளிவுத்திறன் அமைப்பு, குயினோன் இயக்கவியலில் புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது.
டேவிட் ஜே.கே. ஸ்வைன்ஸ்பரி, பார்க் கியான், பிலிப் ஜே. ஜாக்சன், கைட்லின் எம். ஃபாரிஸ், டேரியஸ் எம். நீட்ஸ்வீட்ஸ்கி, எலிசபெத் சி. மார்ட்டின், டேவிட் ஏ. ஃபார்மர், லோர்னா ஏ. மலோன், ரெபேக்கா எஃப். தாம்சன், நீல் ஏ. ரான்சன், டேனியல் பி. கன்னிஃப், மார்க் ஜே. டிக்மேன், டீவி ஹோல்டன், கிறிஸ்டின் கிர்மையர், ஆண்ட்ரூ ஹிட்ச்காக், சி. நீல் ஹண்டர்
எதிர்வினை மையத்தில் உள்ள ஒளிப் பொறி 1 வளாகத்தின் உயர் தெளிவுத்திறன் அமைப்பு, குயினோன் இயக்கவியலில் புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது.
©2021 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS என்பது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.