தற்போது *தற்போதைய முகவரி: கொலோன் 50931, ஜெர்மனி, முதுமை தொடர்பான நோய்களில் செல்லுலார் அழுத்த மறுமொழி குறித்த கொலோன் எக்ஸலன்ஸ் கிளஸ்டர் ஆராய்ச்சி (CECAD).
நியூரான்களின் வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மை குறைவாக இருப்பதால் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களின் நியூரோடிஜெனரேஷன் மீளமுடியாததாகக் கருதப்படுகிறது, ஆனால் உடலில் உள்ள நியூரான் வளர்சிதை மாற்றத்தின் செல் சுயாட்சியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் விளைவு சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. இங்கு, சீர்குலைந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு இயக்கவியலால் ஏற்படும் முற்போக்கான OXPHOS குறைபாட்டுடன் கூடிய புர்கின்ஜே நியூரான்களின் செல்-குறிப்பிட்ட புரோட்டியோமை அறிமுகப்படுத்துகிறோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு புரோட்டியோமிக்ஸ் துறையில் ஒரு ஆழமான மாற்றத்தைத் தூண்டியது என்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது இறுதியில் செல் இறப்புக்கு முன் துல்லியமான வளர்சிதை மாற்ற நிரல்களின் தொடர்ச்சியான செயல்படுத்தலுக்கு வழிவகுத்தது. எதிர்பாராத விதமாக, பைருவேட் கார்பாக்சிலேஸ் (PCx) மற்றும் TCA சுழற்சியின் இடைநிலைகளை நிரப்பும் பிற வயதான எதிர்ப்பு நொதிகளின் வெளிப்படையான தூண்டலை நாங்கள் தீர்மானித்தோம். PCx இன் தடுப்பு ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தையும் நியூரோடிஜெனரேஷனையும் அதிகரிக்கிறது, இது OXPHOS இல்லாத நியூரான்களில் பெருந்தமனி தடிப்பு ஒரு பாதுகாப்பு விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது. இறுதியில் சிதைந்த நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவை மீட்டெடுப்பது இந்த வளர்சிதை மாற்ற பண்புகளை முற்றிலுமாக மாற்றியமைக்கிறது, இதன் மூலம் செல் இறப்பைத் தடுக்கிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கு மீள்தன்மையை வழங்கும் முன்னர் அறியப்படாத பாதைகளை எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் அடையாளம் கண்டுகொள்கின்றன, மேலும் நோயின் பிற்பகுதியில் கூட நியூரோடிஜெனரேஷன் தலைகீழாக மாற்றப்படலாம் என்பதைக் காட்டுகின்றன.
மனித மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களுடன் தொடர்புடைய விரிவான நரம்பியல் அறிகுறிகளால் நரம்பு ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்தை பராமரிப்பதில் மைட்டோகாண்ட்ரியலின் மையப் பங்கு வலியுறுத்தப்படுகிறது. இந்த நோய்களில் பெரும்பாலானவை மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு வெளிப்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்தும் மரபணு மாற்றங்கள் (1, 2) அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுடன் தொடர்புடைய மரபணு அழிவு ஆகியவற்றால் ஏற்படுகின்றன, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏவின் (mtDNA) நிலைத்தன்மையை மறைமுகமாக பாதிக்கிறது (3, 4). சுற்றியுள்ள திசுக்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, பழமைவாத வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளை (5-7) செயல்படுத்த முடியும் என்பதை விலங்கு மாதிரிகளில் மேற்கொள்ளப்பட்ட பணிகள் காட்டுகின்றன, இது இந்த சிக்கலான நோய்களின் நோய்க்கிருமி உருவாக்கம் பற்றிய ஆழமான புரிதலுக்கு முக்கியமான தகவல்களை வழங்குகிறது. இதற்கு நேர்மாறாக, மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியல் அடினோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (ATP) உற்பத்தியின் பொதுவான தோல்வியால் ஏற்படும் குறிப்பிட்ட செல் வகைகளின் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களைப் பற்றிய நமது புரிதல் அடிப்படையானது (8), நோயைத் தடுக்க அல்லது தடுக்கப் பயன்படுத்தக்கூடிய சிகிச்சை இலக்குகளை அடையாளம் காண வேண்டியதன் அவசியத்தை வலியுறுத்துகிறது. நியூரோடிஜெனரேஷனைத் தடுக்கவும் (9). தகவலின் பற்றாக்குறை என்னவென்றால், சுற்றியுள்ள திசுக்களின் செல் வகைகளுடன் ஒப்பிடும்போது நரம்பு செல்கள் மிகவும் குறைந்த வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதாக பரவலாகக் கருதப்படுகிறது (10). இந்த செல்கள், சினாப்டிக் பரிமாற்றத்தை ஊக்குவிக்கவும், காயம் மற்றும் நோய் நிலைமைகளுக்கு பதிலளிக்கவும் நியூரான்களுக்கு வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் விநியோகத்தை ஒருங்கிணைப்பதில் முக்கிய பங்கு வகிப்பதால், மூளை திசுக்களின் சவாலான நிலைமைகளுக்கு செல் வளர்சிதை மாற்றத்தை மாற்றியமைக்கும் திறன் கிட்டத்தட்ட கிளைல் செல்களுக்கு மட்டுமே (11-14). கூடுதலாக, மூளை திசுக்களின் உள்ளார்ந்த செல்லுலார் பன்முகத்தன்மை குறிப்பிட்ட நரம்பியல் துணைக்குழுக்களில் ஏற்படும் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களைப் பற்றிய ஆய்வை பெரும்பாலும் தடுக்கிறது. இதன் விளைவாக, நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் சரியான செல்லுலார் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகள் பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகளைப் புரிந்து கொள்வதற்காக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வெளிப்புற சவ்வு இணைவு (Mfn2) அழிவால் ஏற்படும் நியூரோடிஜெனரேஷனின் வெவ்வேறு நிலைகளில் புர்கின்ஜே நியூரான்களை (PNகள்) தனிமைப்படுத்தினோம். மனிதர்களில் Mfn2 பிறழ்வுகள் சார்கோட்-மேரி-டூத் வகை 2A (15) எனப்படும் பரம்பரை மோட்டார் உணர்வு நரம்பியல் வடிவத்துடன் தொடர்புடையவை என்றாலும், எலிகளில் Mfn2 இன் நிபந்தனை அழிவு என்பது ஆக்சிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷன் (OXPHOS) செயலிழப்பு முறையாகும். பல்வேறு நரம்பியல் துணை வகைகள் (16-19) மற்றும் அதன் விளைவாக வரும் நியூரோடிஜெனரேட்டிவ் பினோடைப் ஆகியவை இயக்கக் கோளாறுகள் (18, 19) அல்லது சிறுமூளை அட்டாக்ஸியா (16) போன்ற முற்போக்கான நரம்பியல் அறிகுறிகளுடன் உள்ளன. லேபிள் இல்லாத அளவு (LFQ) புரோட்டியோமிக்ஸ், வளர்சிதை மாற்றவியல், இமேஜிங் மற்றும் வைராலஜிக்கல் முறைகளின் கலவையைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், முற்போக்கான நியூரோடிஜெனரேஷனை பைருவேட் கார்பாக்சிலேஸ் (PCx) மற்றும் PNகளின் தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியில் ஈடுபடும் பிற காரணிகள் வலுவாகத் தூண்டுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறோம். இந்தக் கண்டுபிடிப்பின் பொருத்தத்தை சரிபார்க்க, Mfn2-குறைபாடுள்ள PN-களில் PCx இன் வெளிப்பாட்டை நாங்கள் குறிப்பாகக் குறைத்து ஒழுங்குபடுத்தினோம், மேலும் இந்த செயல்பாடு ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தை அதிகரிக்கிறது மற்றும் நியூரோடிஜெனரேஷனை துரிதப்படுத்துகிறது என்பதைக் கண்டறிந்தோம், இதனால் அசோஸ்பெர்மியா செல் இறப்பை வளர்சிதை மாற்ற தகவமைப்புத் தன்மையை வழங்குகிறது என்பதை நிரூபித்தது. MFN2 இன் கடுமையான வெளிப்பாடு கடுமையான OXPHOS குறைபாடு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏவின் பாரிய நுகர்வு மற்றும் வெளிப்படையாக உடைந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க் ஆகியவற்றுடன் முனையச் சிதைவு PN ஐ முழுமையாக மீட்டெடுக்க முடியும், இது இந்த வகையான நியூரோடிஜெனரேஷனை செல் இறப்பதற்கு முன் நோயின் மேம்பட்ட கட்டத்தில் கூட மீட்டெடுக்க முடியும் என்பதை மேலும் வலியுறுத்துகிறது.
Mfn2 நாக் அவுட் PN-களில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் காட்சிப்படுத்த, Cre-சார்ந்த மைட்டோகாண்ட்ரியா மஞ்சள் ஃப்ளோரசன்ட் புரதத்தை (YFP) (mtYFP) (20) Cre வெளிப்பாட்டை இலக்காகக் கொள்ள அனுமதிக்கும் ஒரு எலி திரிபைப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பை உயிரியல் ரீதியாக சரிபார்த்தோம். PN-களில் Mfn2 மரபணுவின் அழிவு மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கின் படிப்படியான பிரிவுக்கு வழிவகுக்கும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S1A), மேலும் ஆரம்பகால மாற்றம் 3 வார வயதில் கண்டறியப்பட்டது. இதற்கு நேர்மாறாக, கால்பிண்டின் இம்யூனோஸ்டைனிங் இழப்பால் சான்றளிக்கப்பட்ட PN செல் அடுக்கின் கணிசமான சிதைவு 12 வார வயது வரை தொடங்கவில்லை (படம் 1, A மற்றும் B). மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பில் ஆரம்பகால மாற்றங்களுக்கும் நியூரான்களின் மரணத்தின் புலப்படும் தொடக்கத்திற்கும் இடையிலான நேரப் பொருத்தமின்மை, செல் இறப்புக்கு முன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பால் தூண்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களை ஆராய எங்களைத் தூண்டியது. YFP (YFP+)-வெளிப்படுத்தும் PN (படம் 1C)-ஐ தனிமைப்படுத்தவும், கட்டுப்பாட்டு எலிகளில் (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)-ஐ தனிமைப்படுத்தவும், இனி CTRL (படம் S1B) என குறிப்பிடப்படும் ஒரு ஃப்ளோரசன்ஸ்-செயல்படுத்தப்பட்ட செல் வரிசையாக்கம் (FACS)-அடிப்படையிலான உத்தியை நாங்கள் உருவாக்கினோம். YFP சிக்னலின் ஒப்பீட்டு தீவிரத்தின் அடிப்படையில் கேட்டிங் உத்தியை மேம்படுத்துவது, PN-களின் YFP+ உடலை (YFPhigh) PN அல்லாத (YFPneg) (படம் S1B) அல்லது கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்ட புளூரசன்ட் ஆக்சன்/டென்ட்ரிடிக் துண்டுகளிலிருந்து (YFPlow; படம் S1D, இடது) சுத்திகரிக்க அனுமதிக்கிறது (படம் S1D, வலது). வகைப்படுத்தப்பட்ட மக்கள்தொகையின் அடையாளத்தைச் சரிபார்க்க, நாங்கள் LFQ புரோட்டியோமிக்ஸ் மற்றும் பின்னர் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வை மேற்கொண்டோம், மேலும் YFPhigh மற்றும் YFPneg செல்களுக்கு இடையே தெளிவான பிரிப்பு இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S1C). YFPhigh செல்கள் அறியப்பட்ட PNகள் குறிப்பான்களின் நிகர செறிவூட்டலைக் காட்டின (அதாவது Calb1, Pcp2, Grid2 மற்றும் Itpr3) (21, 22), ஆனால் நியூரான்கள் அல்லது பிற செல் வகைகளில் பொதுவாக வெளிப்படுத்தப்படும் புரதங்களின் செறிவூட்டல் இல்லை (படம் 1D). சுயாதீன சோதனைகளில் சேகரிக்கப்பட்ட வகைப்படுத்தப்பட்ட YFPhigh செல்களில் உள்ள மாதிரிகளுக்கு இடையிலான ஒப்பீடு, உயிரியல் பிரதிகளுக்கு இடையில் நல்ல இனப்பெருக்கத்தை நிரூபிக்கும் ஒரு தொடர்பு குணகம் 0.9 ஐக் காட்டியது (படம் S1E). சுருக்கமாக, இந்தத் தரவு சாத்தியமான PN இன் கடுமையான மற்றும் குறிப்பிட்ட தனிமைப்படுத்தலுக்கான எங்கள் திட்டத்தை உறுதிப்படுத்தியது. பயன்படுத்தப்படும் L7-cre இயக்கி அமைப்பு பிரசவத்திற்குப் பிறகு முதல் வாரத்தில் மொசைக் மறுசீரமைப்பைத் தூண்டுவதால் (23), CTRL மற்றும் நிபந்தனையிலிருந்து எலிகளை நாங்கள் அழிக்கத் தொடங்கினோம் (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) நியூரான்களைச் சேகரிக்கவும். மறுசீரமைப்பு முடிந்ததும், அது 4 வார வயதில் Mfn2cKO என்று அழைக்கப்படுகிறது. இறுதிப் புள்ளியாக, வெளிப்படையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் துண்டு துண்டாக இருந்தபோதிலும் PN அடுக்கு அப்படியே இருந்த 8 வார வயதை நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம் (படம் 1B மற்றும் படம் S1A). மொத்தத்தில், மொத்தம் 3013 புரதங்களை நாங்கள் அளவிட்டோம், அவற்றில் சுமார் 22% மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரோட்டியோமை மைட்டோகாண்ட்ரியாவாக அடிப்படையாகக் கொண்ட மிட்டோகார்ட்டா 2.0 குறிப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை (படம் 1E) (படம் 1E) (24). 8வது வாரத்தில் நிகழ்த்தப்பட்ட வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, அனைத்து புரதங்களிலும் 10.5% மட்டுமே குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களைக் கொண்டிருந்ததைக் காட்டியது (படம் 1F மற்றும் படம் S1F), இதில் 195 புரதங்கள் கீழ்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன மற்றும் 120 புரதங்கள் மேல்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன (படம் 1F). இந்த தரவுத் தொகுப்பின் "புதுமையான பாதை பகுப்பாய்வு", வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் முக்கியமாக குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளின் வரையறுக்கப்பட்ட தொகுப்பைச் சேர்ந்தவை என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 1G). சுவாரஸ்யமாக, OXPHOS மற்றும் கால்சியம் சமிக்ஞை தொடர்பான பாதைகளின் குறைப்பு, இணைவு-குறைபாடுள்ள PNகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் தூண்டலை உறுதிப்படுத்தினாலும், முக்கியமாக அமினோ அமில வளர்சிதை மாற்றத்தை உள்ளடக்கிய பிற பிரிவுகள் கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்படுகின்றன, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் PNகளில் ஏற்படும் வளர்சிதை மாற்றத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. மறு வயரிங் சீரானது. செயலிழப்பு.
(A) CTRL மற்றும் Mfn2cKO எலிகளின் சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ கன்ஃபோகல் புகைப்படங்கள் PNகளின் முற்போக்கான இழப்பைக் காட்டுகின்றன (கால்பிண்டின், சாம்பல்); கருக்கள் DAPI உடன் எதிர் வண்ணம் பூசப்பட்டன. (B) (A) இன் அளவு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு, ***P<0.001; n = மூன்று எலிகளிலிருந்து 4 முதல் 6 வட்டங்கள்). (C) சோதனை பணிப்பாய்வு. (D) புர்கின்ஜே (மேல்) மற்றும் பிற செல் வகைகளுக்கு (நடுத்தரம்) குறிப்பிட்ட குறிப்பான்களின் வெப்ப வரைபட விநியோகம். (E) வகைப்படுத்தப்பட்ட PN இல் அடையாளம் காணப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களின் எண்ணிக்கையைக் காட்டும் வென் வரைபடம். (F) 8 வாரங்களில் Mfn2cKO நியூரான்களில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களின் எரிமலை சதி (முக்கியத்துவம் கட்-ஆஃப் மதிப்பு 1.3). (G) படைப்பாற்றல் பாதை பகுப்பாய்வு 8 வாரங்களாக வகைப்படுத்தப்பட்ட Mfn2cKO PN இல் ஐந்து மிக முக்கியமான மேல்-ஒழுங்குமுறை (சிவப்பு) மற்றும் கீழ்-ஒழுங்குமுறை (நீலம்) பாதைகளைக் காட்டுகிறது. கண்டறியப்பட்ட ஒவ்வொரு புரதத்தின் சராசரி வெளிப்பாடு நிலை காட்டப்பட்டுள்ளது. கிரேஸ்கேல் வெப்ப வரைபடம்: சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பு. ns, முக்கியமில்லை.
புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவு, I, III மற்றும் IV வளாகங்களின் புரத வெளிப்பாடு படிப்படியாகக் குறைந்து வருவதைக் காட்டியது. I, III மற்றும் IV வளாகங்கள் அனைத்தும் அத்தியாவசிய mtDNA-குறியிடப்பட்ட துணை அலகுகளைக் கொண்டிருந்தன, அதே நேரத்தில் அணு-குறியிடப்பட்ட சிக்கலான II, அடிப்படையில் பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 2A மற்றும் படம் S2A). . புரோட்டியோமிக்ஸ் முடிவுகளுக்கு இணங்க, சிறுமூளை திசு பிரிவுகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி, PN இல் உள்ள சிக்கலான IV இன் MTCO1 (மைட்டோகாண்ட்ரியல் சைட்டோக்ரோம் C ஆக்சிடேஸ் துணை அலகு 1) துணை அலகு அளவு படிப்படியாகக் குறைந்ததைக் காட்டியது (படம் 2B). mtDNA-குறியிடப்பட்ட துணை அலகு Mtatp8 கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது (படம் S2A), அதே நேரத்தில் அணு-குறியிடப்பட்ட ATP சின்தேஸ் துணை அலகின் நிலையான-நிலை நிலை மாறாமல் இருந்தது, இது mtDNA வெளிப்பாடு நிலையானதாக இருக்கும்போது அறியப்பட்ட நிலையான ATP சின்தேஸ் துணைஅசெம்பிளி F1 வளாகத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. உருவாக்கம் சீரானது. குறுக்கீடு (7). வரிசைப்படுத்தப்பட்ட Mfn2cKO PNகளில் mtDNA அளவை நிகழ்நேர பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (qPCR) மூலம் மதிப்பீடு செய்ததில், mtDNA நகல் எண்ணில் படிப்படியாகக் குறைவு உறுதி செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​8 வார வயதில், mtDNA மட்டத்தில் சுமார் 20% மட்டுமே தக்கவைக்கப்பட்டது (படம் 2C). இந்த முடிவுகளுக்கு இணங்க, Mfn2cKO PNகளின் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபி ஸ்டைனிங் டிஎன்ஏவைக் கண்டறியப் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நியூக்ளியோடைடுகளின் நேரத்தைச் சார்ந்த நுகர்வைக் காட்டுகிறது (படம் 2D). மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதச் சிதைவு மற்றும் மன அழுத்த பதிலில் ஈடுபட்டுள்ள சில வேட்பாளர்கள் மட்டுமே Lonp1, Afg3l2 மற்றும் Clpx மற்றும் OXPHOS சிக்கலான அசெம்பிளி காரணிகள் உட்பட, மேல்-கட்டுப்படுத்தப்பட்டதைக் கண்டறிந்தோம். அப்போப்டொசிஸில் ஈடுபடும் புரதங்களின் அளவுகளில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை (படம் S2B). இதேபோல், கால்சியம் போக்குவரத்தில் ஈடுபடும் மைட்டோகாண்ட்ரியா மற்றும் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் சேனல்கள் சிறிய மாற்றங்களை மட்டுமே கொண்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S2C). கூடுதலாக, ஆட்டோஃபேஜி தொடர்பான புரதங்களின் மதிப்பீட்டில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் காணப்படவில்லை, இது இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி மற்றும் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி மூலம் விவோவில் காணப்பட்ட ஆட்டோஃபேகோசோம்களின் புலப்படும் தூண்டலுடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் S3). இருப்பினும், PN களில் முற்போக்கான OXPHOS செயலிழப்பு வெளிப்படையான அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மாற்றங்களுடன் சேர்ந்துள்ளது. 5 மற்றும் 8 வார வயதுடைய Mfn2cKO PN களின் செல் உடல்கள் மற்றும் டென்ட்ரிடிக் மரங்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கொத்துகளைக் காணலாம், மேலும் உள் சவ்வு அமைப்பு ஆழமான மாற்றங்களுக்கு உட்பட்டுள்ளது (படம் S4, A மற்றும் B). இந்த அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரல் மாற்றங்கள் மற்றும் mtDNA இல் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு ஆகியவற்றுடன் இணங்க, டெட்ராமெதில்ரோடமைன் மெத்தில் எஸ்டர் (TMRM) உடன் கடுமையான பெருமூளை சிறுமூளை துண்டுகளின் பகுப்பாய்வு Mfn2cKO PN களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு திறன் கணிசமாகக் குறைந்துள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் S4C).
(A) OXPHOS வளாகத்தின் வெளிப்பாடு நிலையின் நேரப் பாட பகுப்பாய்வு. 8 வாரங்களில் P<0.05 உள்ள புரதங்களை மட்டும் கருத்தில் கொள்ளுங்கள் (இருவழி ANOVA). புள்ளியிடப்பட்ட கோடு: CTRL உடன் ஒப்பிடும்போது சரிசெய்தல் இல்லை. (B) இடது: MTCO1 எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியுடன் பெயரிடப்பட்ட சிறுமூளைப் பிரிவின் எடுத்துக்காட்டு (அளவீட்டுப் பட்டை, 20 μm). புர்கின்ஜே செல் உடல்களால் ஆக்கிரமிக்கப்பட்ட பகுதி மஞ்சள் நிறத்தால் மூடப்பட்டுள்ளது. வலது: MTCO1 நிலைகளின் அளவீடு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு; n = மூன்று எலிகளிலிருந்து பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட 7 முதல் 20 செல்கள்). (C) வரிசைப்படுத்தப்பட்ட PN இல் mtDNA நகல் எண்ணின் qPCR பகுப்பாய்வு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு; n = 3 முதல் 7 எலிகள்). (D) இடது: DNA எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியுடன் பெயரிடப்பட்ட சிறுமூளைத் துண்டின் எடுத்துக்காட்டு (அளவீட்டுப் பட்டை, 20 μm). புர்கின்ஜே செல் உடல்களால் ஆக்கிரமிக்கப்பட்ட பகுதி மஞ்சள் நிறத்தால் மூடப்பட்டுள்ளது. வலது: mtDNA புண்களின் அளவீடு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு; n = மூன்று எலிகளிலிருந்து 5 முதல் 9 செல்கள்). (E) முழு செல் பேட்ச் கிளாம்ப் பதிவில் மைட்டோஒய்எஃப்பி + புர்கின்ஜே செல்கள் (அம்புக்குறி) காட்டும் ஒரு கடுமையான சிறுமூளைப் பிரிவின் எடுத்துக்காட்டு. (F) IV வளைவின் அளவீடு. (G) CTRL மற்றும் Mfn2cKO புர்கின்ஜே செல்களில் டிபோலரைசிங் மின்னோட்ட ஊசியின் பிரதிநிதித்துவ பதிவுகள். மேல் சுவடு: AP ஐத் தூண்டிய முதல் துடிப்பு. கீழ் சுவடு: அதிகபட்ச AP அதிர்வெண். (H) போஸ்ட்சினாப்டிக் தன்னிச்சையான உள்ளீடுகளின் (sPSPs) அளவீடு. பிரதிநிதி பதிவு சுவடு மற்றும் அதன் ஜூம் விகிதம் (I) இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது n = 5 முதல் 20 செல்கள் மூன்று எலிகளிலிருந்து. தரவு சராசரி ±SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) துளையிடப்பட்ட பேட்ச் கிளாம்ப் பயன்முறையைப் பயன்படுத்தி பதிவுசெய்யப்பட்ட தன்னிச்சையான AP இன் பிரதிநிதித்துவ தடயங்கள். மேல் சுவடு: அதிகபட்ச AP அதிர்வெண். கீழ் சுவடு: ஒற்றை AP இன் ஜூம். (K) (J) இன் படி சராசரி மற்றும் அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணை அளவிடவும். மான்-விட்னி சோதனை; n = 5 செல்கள் நான்கு எலிகளிலிருந்து பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. தரவு சராசரி ± SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது; முக்கியமில்லை.
8 வார வயதுடைய Mfn2cKO PN இல் வெளிப்படையான OXPHOS சேதம் கண்டறியப்பட்டது, இது நியூரான்களின் உடலியல் செயல்பாடு மிகவும் அசாதாரணமானது என்பதைக் குறிக்கிறது. எனவே, கடுமையான சிறுமூளை துண்டுகளில் முழு செல் பேட்ச் கிளாம்ப் பதிவுகளைச் செய்வதன் மூலம் 4 முதல் 5 வாரங்கள் மற்றும் 7 முதல் 8 வாரங்களில் OXPHOS-குறைபாடுள்ள நியூரான்களின் செயலற்ற மின் பண்புகளை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 2E). எதிர்பாராத விதமாக, Mfn2cKO நியூரான்களின் சராசரி ஓய்வு சவ்வு திறன் மற்றும் உள்ளீட்டு எதிர்ப்பு கட்டுப்பாட்டுக்கு ஒத்ததாக இருந்தது, இருப்பினும் செல்களுக்கு இடையே நுட்பமான வேறுபாடுகள் இருந்தன (அட்டவணை 1). இதேபோல், 4 முதல் 5 வார வயதில், மின்னோட்ட-மின்னழுத்த உறவில் (IV வளைவு) குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்கள் எதுவும் காணப்படவில்லை (படம் 2F). இருப்பினும், 7 முதல் 8 வார வயதுடைய எந்த Mfn2cKO நியூரான்களும் IV விதிமுறையிலிருந்து (ஹைப்பர்போலரைசேஷன் படி) தப்பிப்பிழைத்தன, இது இந்த தாமதமான கட்டத்தில் ஹைப்பர்போலரைசேஷன் திறனுக்கு தெளிவான உணர்திறன் இருப்பதைக் குறிக்கிறது. இதற்கு நேர்மாறாக, Mfn2cKO நியூரான்களில், மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் செயல் திறன் (AP) வெளியேற்றங்களை ஏற்படுத்தும் டிபோலரைசிங் நீரோட்டங்கள் நன்கு பொறுத்துக்கொள்ளப்படுகின்றன, இது அவற்றின் ஒட்டுமொத்த வெளியேற்ற முறைகள் 8 வார வயதுடைய கட்டுப்பாட்டு நியூரான்களிலிருந்து கணிசமாக வேறுபடவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது (அட்டவணை 1 மற்றும் படம் 2G). இதேபோல், தன்னிச்சையான போஸ்ட்சினாப்டிக் மின்னோட்டங்களின் (sPSCs) அதிர்வெண் மற்றும் வீச்சு கட்டுப்பாட்டுக் குழுவின்வற்றுடன் ஒப்பிடத்தக்கது, மேலும் நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண் 4 வாரங்களிலிருந்து 5 வாரங்களிலிருந்து 7 வாரங்களிலிருந்து 8 வாரங்கள் வரை இதேபோன்ற அதிகரிப்புடன் அதிகரித்தது (படம் 2, H மற்றும் I). PNகளில் சினாப்டிக் முதிர்ச்சியின் காலம் (25). துளையிடப்பட்ட PNs திட்டுகளுக்குப் பிறகு இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன. முழு செல் பேட்ச் கிளாம்ப் பதிவில் நிகழக்கூடியது போல, இந்த உள்ளமைவு செல்லுலார் ATP குறைபாடுகளின் சாத்தியமான இழப்பீட்டைத் தடுக்கிறது. குறிப்பாக, Mfn2cKO நியூரான்களின் ஓய்வு சவ்வு திறன் மற்றும் தன்னிச்சையான துப்பாக்கி சூடு அதிர்வெண் பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 2, J மற்றும் K). சுருக்கமாக, இந்த முடிவுகள் வெளிப்படையான OXPHOS செயலிழப்பு கொண்ட PNகள் உயர் அதிர்வெண் வெளியேற்ற முறைகளை நன்கு சமாளிக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கின்றன, இது இயல்பான மின் இயற்பியல் பதில்களைப் பராமரிக்க அனுமதிக்கும் ஒரு இழப்பீட்டு வழிமுறை இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
தரவு சராசரி ± SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு, ஹோல்ம்-சிடாக்கின் பல ஒப்பீட்டு சோதனை; *P<0.05). அலகு எண் அடைப்புக்குறிகளால் குறிக்கப்படுகிறது.
புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்பில் (படம் 1G) ஏதேனும் ஒரு வகை கடுமையான OXPHOS குறைபாட்டை எதிர்க்கும் பாதைகளை உள்ளடக்கியதா என்பதை ஆராய நாங்கள் புறப்பட்டோம், இதன் மூலம் பாதிக்கப்பட்ட PN ஏன் கிட்டத்தட்ட இயல்பான மின் இயற்பியலை பராமரிக்க முடியும் என்பதை விளக்குகிறது (படம் 2, E முதல் K வரை). . கிளைத்த சங்கிலி அமினோ அமிலங்களின் (BCAA) வினையூக்கத்தில் ஈடுபடும் நொதிகள் கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டுள்ளன என்பதை புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வு காட்டுகிறது (படம் 3A மற்றும் படம் S5A), மேலும் இறுதி தயாரிப்பு அசிடைல்-CoA (CoA) அல்லது சக்சினைல் CoA, ஆர்டெரியோஸ்கிளிரோசிஸ் அமிலம் (TCA) சுழற்சியில் ட்ரைகார்பாக்சிலேட்டுகளை நிரப்ப முடியும். BCAA டிரான்ஸ்மினேஸ் 1 (BCAT1) மற்றும் BCAT2 இரண்டின் உள்ளடக்கமும் அதிகரித்திருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். அவை α-கெட்டோகுளுடரேட்டிலிருந்து குளுட்டமேட்டை உருவாக்குவதன் மூலம் BCAA வினையூக்கத்தின் முதல் படியை வினையூக்குகின்றன (26). கிளைத்த சங்கிலி கீட்டோ அமில டீஹைட்ரோஜினேஸ் (BCKD) வளாகத்தை உருவாக்கும் அனைத்து துணை அலகுகளும் மேல்-ஒழுங்குபடுத்தப்படுகின்றன (இந்த வளாகம் விளைந்த BCAA கார்பன் எலும்புக்கூட்டின் அடுத்தடுத்த மற்றும் மீளமுடியாத டிகார்பாக்சிலேஷனை வினையூக்குகிறது) (படம் 3A மற்றும் படம் S5A). இருப்பினும், வரிசைப்படுத்தப்பட்ட PN இல் BCAA இல் எந்த வெளிப்படையான மாற்றங்களும் காணப்படவில்லை, இது இந்த அத்தியாவசிய அமினோ அமிலங்களின் அதிகரித்த செல்லுலார் உறிஞ்சுதல் அல்லது TCA சுழற்சியை நிரப்ப பிற மூலங்களை (குளுக்கோஸ் அல்லது லாக்டிக் அமிலம்) பயன்படுத்துவதன் காரணமாக இருக்கலாம் (படம் S5B). OXPHOS இல்லாத PNகள் 8 வார வயதில் அதிகரித்த குளுட்டமைன் சிதைவு மற்றும் டிரான்ஸ்மினேஷன் செயல்பாடுகளையும் காட்டின, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நொதிகளான குளுட்டமைனேஸ் (GLS) மற்றும் குளுட்டமைன் பைருவேட் டிரான்ஸ்மினேஸ் 2 (GPT2) ஆகியவற்றின் மேல்-ஒழுங்குமுறை மூலம் பிரதிபலிக்க முடியும் (படம் 3, A மற்றும் C). GLS இன் அப்-ரெகுலேஷன் பிளவுபட்ட ஐசோஃபார்ம் குளுட்டமினேஸ் C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL இன் மாற்றம் தோராயமாக 4.5 மடங்கு, P = 0.05) க்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது, மேலும் புற்றுநோய் திசுக்களில் அதன் குறிப்பிட்ட அப்-ரெகுலேஷன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஎனர்ஜியை ஆதரிக்க முடியும். (27).
(A) 8 வாரங்களில் குறிப்பிட்ட பாதைக்கான புரத மட்டத்தில் ஏற்படும் மடிப்பு மாற்றத்தை வெப்ப வரைபடம் காட்டுகிறது. (B) ஆன்டி-பிசிஎக்ஸ் ஆன்டிபாடி (அளவுகோல், 20 μm) என பெயரிடப்பட்ட சிறுமூளை துண்டின் எடுத்துக்காட்டு. மஞ்சள் அம்புக்குறி புர்கின்ஜே செல் உடலை சுட்டிக்காட்டுகிறது. (C) பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சிக்கு ஒரு முக்கியமான வேட்பாளராக அடையாளம் காணப்பட்ட நேரப் படிப்பு புரத வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு (பல டி-சோதனை, *FDR <5%; n = 3-5 எலிகள்). (D) மேலே: [1-13C]பைருவேட் ட்ரேசரில் (அதாவது, PDH அல்லது டிரான்ஸ்-தமனி பாதை வழியாக) உள்ள லேபிளிடப்பட்ட கார்பனை உள்ளிடுவதற்கான வெவ்வேறு வழிகளைக் காட்டும் திட்ட வரைபடம். கீழே: [1-13C]பைருவேட் (ஜோடி டி-சோதனை; ** P <0.01) உடன் கடுமையான சிறுமூளை துண்டுகளை லேபிளிட்ட பிறகு அஸ்பார்டிக் அமிலம், சிட்ரிக் அமிலம் மற்றும் மாலிக் அமிலமாக மாற்றப்பட்ட ஒற்றை-லேபிளிடப்பட்ட கார்பனின் (M1) சதவீதத்தை வயலின் விளக்கப்படம் காட்டுகிறது. (E) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட பாதையின் விரிவான நேர வரலாற்று பகுப்பாய்வு. 8 வாரங்களில் P<0.05 உள்ள புரதங்களை மட்டும் கருத்தில் கொள்ளுங்கள்​​. கோடு கோடு: சரிசெய்தல் மதிப்பு இல்லை (மாறுபாட்டின் இருவழி பகுப்பாய்வு; * P <0.05; *** P <0.001). தரவு சராசரி±SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.
எங்கள் பகுப்பாய்வில், BCAA கேடபாலிசம் முக்கிய அப்-ரெகுலேஷன் பாதைகளில் ஒன்றாக மாறியுள்ளது. OXPHOS இல்லாத PN இல் TCA சுழற்சியில் நுழையும் காற்றோட்ட அளவு மாற்றப்படலாம் என்பதை இந்த உண்மை வலுவாகக் குறிக்கிறது. இது நியூரான்களின் வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்பின் ஒரு முக்கிய வடிவத்தைக் குறிக்கலாம், இது கடுமையான OXPHOS செயலிழப்பைப் பராமரிக்கும் போது நியூரான்களின் உடலியல் மற்றும் உயிர்வாழ்வில் நேரடி தாக்கத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும். இந்தக் கருதுகோளுக்கு இணங்க, பிரதான ஆன்டி-ஆதெரோஸ்க்ளெரோடிக் நொதி PCx மேல்-ரெகுலேஷன் செய்யப்பட்டுள்ளது என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (Mfn2cKO/CTRL தோராயமாக 1.5 மடங்கு மாறுகிறது; படம் 3A), இது பைருவேட்டை ஆக்சலோஅசெட்டேட்டாக மாற்றுவதை ஊக்குவிக்கிறது (28), இது மூளை திசுக்களில் இருப்பதாக நம்பப்படுகிறது. in வெளிப்பாடு ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளுக்கு மட்டுமே (29, 30). புரோட்டியோமிக்ஸ் முடிவுகளுக்கு இணங்க, கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபி, OXPHOS-குறைபாடுள்ள PNகளில் PCx வெளிப்பாடு குறிப்பாகவும் கணிசமாகவும் அதிகரித்திருப்பதைக் காட்டியது, அதே நேரத்தில் PCx வினைத்திறன் முக்கியமாக கட்டுப்பாட்டின் அருகிலுள்ள பெர்க்மேன் கிளைல் செல்களுக்கு மட்டுமே (படம் 3B). PCx இன் கவனிக்கப்பட்ட மேல் ஒழுங்குமுறையை செயல்பாட்டு ரீதியாக சோதிக்க, நாங்கள் கடுமையான சிறுமூளை துண்டுகளை [1-13C] பைருவேட் டிரேசருடன் சிகிச்சையளித்தோம். பைருவேட் பைருவேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (PDH) மூலம் ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்டபோது, ​​அதன் ஐசோடோப்பு லேபிள் மறைந்துவிட்டது, ஆனால் பைருவேட் வாஸ்குலர் எதிர்வினைகளால் வளர்சிதைமாற்றம் செய்யப்படும்போது TCA சுழற்சி இடைநிலைகளில் இணைக்கப்படுகிறது (படம் 3D). எங்கள் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவை ஆதரிக்கும் வகையில், Mfn2cKO துண்டுகளின் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தில் இந்த டிரேசரிலிருந்து அதிக எண்ணிக்கையிலான குறிப்பான்களைக் கவனித்தோம், அதே நேரத்தில் சிட்ரிக் அமிலம் மற்றும் மாலிக் அமிலமும் மிதமான போக்கைக் கொண்டிருந்தன, இருப்பினும் குறிப்பிடத்தக்கவை அல்ல (படம் 3D).
டோபமைன் நியூரான்கள் குறிப்பாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி A மரபணுவை (Tfam) அழிக்கும் டோபமைன் நியூரான்களால் ஏற்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு கொண்ட மிட்டோபார்க் எலிகளின் டோபமைன் நியூரான்களில் (படம் S6B), PCx வெளிப்பாடும் கணிசமாக உயர்ந்தது (31), இது அசிட்டோன் அமில தமனி இரத்தக் குழாய் அடைப்பு உடலில் உள்ள நியூரானல் OXPHOS இன் செயலிழப்பின் போது நோயின் நிகழ்வு கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. ஆர்ட்டரியோஸ்கிளிரோசிஸுடன் தொடர்புடைய நியூரான்களில் வெளிப்படுத்தப்படக்கூடிய தனித்துவமான நொதிகள் (32-34) புரோபியோனைல்-CoA கார்பாக்சிலேஸ் (PCC-A) போன்ற OXPHOS இல்லாத PNகளில் கணிசமாக உயர்ந்துள்ளன என்பது கண்டறியப்பட்டுள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது, மலோனைல்-CoA புரோபியோனைல்-CoA ஐ சக்சினைல்-CoA ஆக மாற்றுகிறது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மாலிக் என்சைம் 3 (ME3), இதன் முக்கிய பங்கு மாலேட்டிலிருந்து பைருவேட்டை மீட்டெடுப்பதாகும் (படம் 3, A மற்றும் C) (33, 35). கூடுதலாக, Pdk3 நொதியில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் கண்டறிந்தோம், இது பாஸ்போரிலேட் செய்து PDH ஐ செயலிழக்கச் செய்கிறது (36), அதே நேரத்தில் PDH அல்லது PDH நொதி வளாகத்தையே செயல்படுத்தும் Pdp1 நொதியில் எந்த மாற்றங்களும் கண்டறியப்படவில்லை (படம் 3A). தொடர்ந்து, Mern2cKO PNகளில், Ser293 இல் உள்ள PDH வளாகத்தின் பைருவேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் E1 கூறுகளின் α1 துணை அலகு α (PDHE1α) துணை அலகின் பாஸ்போரிலேஷன் (PDH இன் நொதி செயல்பாட்டைத் தடுப்பதாக அறியப்படுகிறது) மேம்படுத்தப்பட்டது (படம் S6C) (படம் S6C). பைருவேட்டுக்கு வாஸ்குலர் அணுகல் இல்லை.
இறுதியாக, செரின் மற்றும் கிளைசின் உயிரியல் தொகுப்பு, தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஃபோலேட் (1C) சுழற்சி மற்றும் புரோலின் உயிரியல் தொகுப்பு (படம் 1G மற்றும் படம் S5C) ஆகியவற்றின் சூப்பர் பாதை செயல்படுத்தும் செயல்பாட்டின் போது கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்படுவதைக் கண்டறிந்தோம். சுற்றியுள்ள திசுக்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் செயல்படுத்தப்படுகின்றன (5-7). இந்த புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவை ஆதரிக்கும் கன்ஃபோகல் பகுப்பாய்வு, OXPHOS இல்லாத PN இல், 8 வார வயதுடைய எலிகளின் சிறுமூளை துண்டுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஃபோலேட் சுழற்சியின் முக்கிய நொதியான செரின் ஹைட்ராக்ஸிமெதில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் 2 (SHMT2) க்கு உட்படுத்தப்பட்டதைக் காட்டியது. குறிப்பிடத்தக்க நோயெதிர்ப்பு பதில் (படம் S5D). 13 CU-குளுக்கோஸ்-இன்குபேட்டட் அக்யூட் சிறுமூளை துண்டுகளில், வளர்சிதை மாற்ற தடமறிதல் சோதனைகள் செரின் மற்றும் புரோலின் உயிரியல் தொகுப்புகளின் மேல்நோக்கி ஒழுங்குமுறையை மேலும் உறுதிப்படுத்தின, இது கார்பன் ஐசோஃபார்ம்களை செரின் மற்றும் புரோலினாக மாற்றுவதைக் குறிக்கிறது (படம் S5E). GLS மற்றும் GPT2 ஆல் ஊக்குவிக்கப்படும் எதிர்வினைகள் குளுட்டமைனில் இருந்து குளுட்டமேட்டின் தொகுப்புக்கும் குளுட்டமேட் மற்றும் α-கெட்டோகுளுடரேட்டுக்கு இடையிலான டிரான்ஸ்மினேஷனுக்கும் காரணமாக இருப்பதால், அவற்றின் மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தல் OXPHOS-குறைபாடுள்ள நியூரான்கள் குளுட்டமேட்டுக்கான அதிகரித்த தேவையைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது. இது புரோலின் அதிகரித்த உயிரியக்கத் தொகுப்பைப் பராமரிப்பதை நோக்கமாகக் கொண்டிருக்கலாம் (படம் S5C). இந்த மாற்றங்களுக்கு மாறாக, PN-குறிப்பிட்ட Mfn2cKO எலிகளிலிருந்து சிறுமூளை ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு இந்த பாதைகள் (அனைத்து ஆன்டிபெராக்ஸிடேஸ்கள் உட்பட) வெளிப்பாட்டில் கணிசமாக மாறவில்லை என்பதைக் காட்டியது, இதனால் இந்த வளர்சிதை மாற்ற திசைதிருப்பல் சிதைந்த PN க்கு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டதாகும் (படம் S6, D முதல் G வரை).
சுருக்கமாக, இந்த பகுப்பாய்வுகள் PN-களில் குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளின் தற்காலிக செயல்பாட்டின் குறிப்பிடத்தக்க மாறுபட்ட வடிவங்களை வெளிப்படுத்தின. அசாதாரண நியூரான் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு ஆரம்பகால பெருந்தமனி தடிப்பு மற்றும் 1C மறுவடிவமைப்புக்கு வழிவகுக்கும் (படம் 3E மற்றும் படம் S5C), மற்றும் I மற்றும் IV வளாகங்களின் வெளிப்பாட்டில் கணிக்கக்கூடிய மாற்றங்களுக்கு கூட வழிவகுக்கும் என்றாலும், செரின் டி நோவோ தொகுப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் மட்டுமே இது பிந்தைய கட்டங்களில் மட்டுமே தெளிவாகத் தெரிந்தது. OXPHOS செயலிழப்பு (படம் 3E மற்றும் படம் S5C). இந்த கண்டுபிடிப்புகள் ஒரு தொடர்ச்சியான செயல்முறையை வரையறுக்கின்றன, இதில் மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் (1C சுழற்சி) மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் (செரின் பயோசிந்தசிஸ்) ஆகியவை TCA சுழற்சியில் பெருந்தமனி தடிப்பு அதிகரிப்புடன் ஒருங்கிணைந்த முறையில் நரம்பியல் வளர்சிதை மாற்றத்தை மறுவடிவமைக்கின்றன.
8 வார வயதுடைய OXPHOS-குறைபாடுள்ள PNகள், உயர் அதிர்வெண் தூண்டுதல் செயல்பாட்டைப் பராமரிக்கலாம் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை ஈடுசெய்ய குறிப்பிடத்தக்க வளர்சிதை மாற்ற மறு இணைப்பிற்கு உட்படலாம். இந்தக் கண்டுபிடிப்பு, இந்த நேரத்தில் கூட, இந்த செல்கள் நியூரோடிஜெனரேஷனை தாமதப்படுத்த அல்லது தடுக்க சிகிச்சை தலையீட்டைப் பெறக்கூடும் என்ற சுவாரஸ்யமான சாத்தியத்தை எழுப்புகிறது. தாமதமாக. இரண்டு சுயாதீன தலையீடுகள் மூலம் இந்த சாத்தியத்தை நாங்கள் தீர்த்தோம். முதல் முறையில், Cre-சார்ந்த அடினோ-தொடர்புடைய வைரஸ் (AAV) திசையனை வடிவமைத்தோம், இதனால் MFN2 ஐ விவோவில் OXPHOS-குறைபாடுள்ள PNகளில் தேர்ந்தெடுத்து வெளிப்படுத்த முடியும் (படம் S7A). AAV குறியாக்கம் MFN2 மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் ரிப்போர்ட்டர் மரபணு mCherry (Mfn2-AAV) ஆகியவை விட்ரோவில் முதன்மை நியூரான் கலாச்சாரங்களில் சரிபார்க்கப்பட்டன, இது MFN2 ஐ Cre-சார்ந்த முறையில் வெளிப்படுத்த காரணமாக அமைந்தது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பை மீட்டது, இதன் மூலம் Mfn2cKO நியூரான்களில் நியூரோமாடேஷன் தடுக்கப்பட்டது (படம் S7, B, D மற்றும் E). அடுத்து, 8 வார வயதுடைய Mfn2-AAV ஐ Mfn2cKO இன் சிறுமூளைப் புறணிக்கு ஸ்டீரியோடாக்டிக்காக வழங்கவும் எலிகளைக் கட்டுப்படுத்தவும் நாங்கள் இன் விவோ பரிசோதனைகளை மேற்கொண்டோம், மேலும் 12 வார வயதுடைய எலிகளை பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 4A). சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட Mfn2cKO எலிகள் இறந்தன (படம் 1, A மற்றும் B) (16). விவோவில் வைரஸ் டிரான்ஸ்டக்ஷன் சில சிறுமூளை வட்டங்களில் PN இன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளிப்பாட்டை ஏற்படுத்தியது (படம் S7, G மற்றும் H). mCherry (Ctrl-AAV) ஐ மட்டுமே வெளிப்படுத்தும் கட்டுப்பாட்டு AAV இன் ஊசி Mfn2cKO விலங்குகளில் நியூரோடிஜெனரேஷனின் அளவில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவைக் கொண்டிருக்கவில்லை. இதற்கு நேர்மாறாக, Mfn2-AAV உடன் கடத்தப்பட்ட Mfn2cKO களின் பகுப்பாய்வு PN செல் அடுக்கின் குறிப்பிடத்தக்க பாதுகாப்பு விளைவைக் காட்டியது (படம் 4, B மற்றும் C). குறிப்பாக, நியூரான் அடர்த்தி கட்டுப்பாட்டு விலங்குகளிலிருந்து கிட்டத்தட்ட வேறுபடுத்த முடியாததாகத் தெரிகிறது (படம் 4, B மற்றும் C, மற்றும் படம் S7, H மற்றும் I). MFN2 அல்லாத MFN1 வெளிப்பாடு, நரம்பியல் இறப்பைக் காப்பாற்றுவதில் சமமாக பயனுள்ளதாக இருக்கிறது (படம் 4C மற்றும் படம் S7, C மற்றும் F), இது எக்டோபிக் MFN1 இன் வெளிப்பாடு MFN2 இன் பற்றாக்குறையை திறம்பட நிரப்ப முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. ஒற்றை PN மட்டத்தில் மேலும் பகுப்பாய்வு செய்ததில், Mfn2-AAV பெரும்பாலும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரைக் காப்பாற்றியது, mtDNA அளவுகளை இயல்பாக்கியது மற்றும் ஆன்டி-ஆஞ்சியோஜெனெசிஸ் மார்க்கர் PCx இன் உயர் வெளிப்பாட்டை மாற்றியது (படம் 4, C முதல் E வரை). மீட்கப்பட்ட Mfn2cKO எலிகளை ஓய்வெடுக்கும் நிலையில் காட்சி ஆய்வு செய்ததில், அவற்றின் தோரணை மற்றும் மோட்டார் அறிகுறிகள் (இயக்கம் S1 முதல் S3 வரை) மேம்படுத்தப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது. முடிவில், OXPHOS இல் கடுமையாகக் குறைபாடுள்ள PNகளில் MFN2 ஐ மீண்டும் அறிமுகப்படுத்துவது தாமதமானது mtDNA நுகர்வை மாற்றியமைக்கவும், பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியைத் தூண்டவும் போதுமானது, இதன் மூலம் ஆக்சான் சிதைவு மற்றும் நியூரான் இறப்பை உயிருள்ள நிலையில் தடுக்கிறது என்பதை இந்த சோதனைகள் காட்டுகின்றன.
(A) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்ற பாதை செயல்படுத்தப்படும்போது AAV குறியாக்கம் MFN2 ஐ செலுத்துவதற்கான சோதனை அட்டவணையைக் காட்டும் ஒரு திட்டம். (B) Mfn2cKO எலிகளில் 8 வாரங்களில் கடத்தப்பட்ட மற்றும் கால்பிண்டின் எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியுடன் பெயரிடப்பட்ட 12 வார வயதுடைய சிறுமூளைத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவ கன்ஃபோகல் படங்கள். வலது: ஆக்சன் இழைகளின் அளவிடுதல். ஆக்சன் ஜூமின் அளவு 450 மற்றும் 75 μm ஆகும். (C) இடது: AAV டிரான்ஸ்டக்ஷன் லூப்பில் (AAV+) புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தியின் அளவீடு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு; n = 3 எலிகள்). வலது: 12 வது வாரத்தில் கடத்தப்பட்ட PN இல் mtDNA ஃபோகஸ் பகுப்பாய்வு (இணைக்கப்படாத t-சோதனை; n = மூன்று எலிகளிலிருந்து 6 செல்கள்). * P <0.05; ** P <0.01. (D) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட வைரஸ் வெக்டர்களுடன் கடத்தப்பட்ட Mfn2cKO சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் PNகளின் பிரதிநிதித்துவ டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள். இளஞ்சிவப்பு முகமூடி டென்ட்ரைட்டுகளால் ஆக்கிரமிக்கப்பட்ட பகுதியைக் காட்டுகிறது, மஞ்சள் புள்ளியிடப்பட்ட சதுரம் வலதுபுறத்தில் வழங்கப்பட்ட ஜூமைக் காட்டுகிறது; n கருவைக் குறிக்கிறது. அளவுகோல் பட்டை, 1μm. (E) 12 வாரங்களில் டிரான்ஸ்டியூஸ் செய்யப்பட்ட PN இல் PCx கறை படிதலின் உதாரணத்தைக் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை, 20μm. OE, அதிகப்படியான வெளிப்பாடு; FC, மடிப்பு மாற்றம்.
இறுதியாக, OXPHOS செயலிழப்பை அனுபவித்த PNகளில் பெராக்ஸிடேஸ் தூண்டப்பட்ட செல் உயிர்வாழ்வின் முக்கியத்துவத்தை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். குறிப்பாக மவுஸ் PCx mRNA (AAV-shPCx) ஐ இலக்காகக் கொண்டு mCherry குறியாக்க AAV-shRNA (குறுகிய ஹேர்பின் RNA) ஐ உருவாக்கினோம், மேலும் வைரஸ் அல்லது அதன் ஸ்க்ராம்பிள்டு கட்டுப்பாட்டை (AAV-scr) Mfn2cKO எலிகளின் சிறுமூளைக்குள் செலுத்தினோம். PCx வெளிப்பாடு அதிகரித்த (படம் 3C) மற்றும் PN செல் அடுக்கு இன்னும் அப்படியே இருந்த காலகட்டத்தில் (படம் 1A) பயனுள்ள PCx நாக் டவுனை அடைய நான்காவது வார வயதில் (படம் 5A) ஊசி போடப்பட்டது. PCx ஐ நாக் டவுனில் வைப்பது (படம் S8A) PN இறப்பின் குறிப்பிடத்தக்க முடுக்கத்திற்கு வழிவகுக்கிறது என்பது கவனிக்கத்தக்கது, இது பாதிக்கப்பட்ட வளையத்திற்கு மட்டுமே (படம் 5, B மற்றும் C) வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. PCx அப்-ரெகுலேஷன் மூலம் தூண்டப்படும் வளர்சிதை மாற்ற விளைவுகளின் பொறிமுறையைப் புரிந்து கொள்வதற்காக, PCx நாக் டவுன் மற்றும் AAV-மத்தியஸ்த ஆப்டிகல் பயோசென்சர் Grx1-roGFP2 ஆகியவை ஒரே நேரத்தில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட பிறகு PNகளின் ரெடாக்ஸ் நிலையை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம் (படம் S8, B முதல் D வரை) குளுதாதயோனை மதிப்பிட பெப்டைட் ரெடாக்ஸ் ஆற்றலின் ஒப்பீட்டு மாற்றம் (38). பின்னர், FLIM நிலைமைகளைச் சரிபார்த்த பிறகு சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரெடாக்ஸ் நிலையில் சாத்தியமான மாற்றங்களைக் கண்டறிய 7 வார வயதுடைய Mfn2cKO அல்லது கட்டுப்பாட்டு லிட்டர்மேட்களின் கடுமையான மூளைத் துண்டுகளில் இரண்டு-ஃபோட்டான் ஃப்ளோரசன்ஸ் வாழ்நாள் இமேஜிங் நுண்ணோக்கி (FLIM) செய்தோம் (படம் S8, E முதல் G வரை). PCx வெளிப்பாடு இல்லாத ஒற்றை Mfn2cKO PNகளின் ஆக்சிஜனேற்ற நிலையில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பை பகுப்பாய்வு காட்டியது, இது கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள் அல்லது ஸ்க்ராம்பிள்டு shRNAவை மட்டுமே வெளிப்படுத்தும் Mfn2cKO PNகளிலிருந்து வேறுபட்டது (படம் 5, D மற்றும் E). PCx வெளிப்பாடு குறைக்கப்பட்டபோது, ​​அதிக ஆக்ஸிஜனேற்ற நிலையைக் காட்டும் Mfn2cKO PNகளின் சதவீதம் மூன்று மடங்குக்கும் அதிகமாக அதிகரித்தது (படம் 5E), PCx மேல்-ஒழுங்குமுறை சிதைந்த நியூரான்களின் ரெடாக்ஸ் திறனைப் பராமரித்தது என்பதைக் குறிக்கிறது.
(A) குறிப்பிடப்பட்ட வளர்சிதை மாற்ற பாதை செயல்படுத்தப்படும்போது AAV குறியாக்கம் shPCx ஐ செலுத்துவதற்கான சோதனை அட்டவணையைக் காட்டும் ஒரு திட்டம். (B) 4 வாரங்களில் கடத்தப்பட்டு ஆன்டி-கால்சினியூரின் ஆன்டிபாடியுடன் பெயரிடப்பட்ட Mfn2cKO எலிகளில் 8 வார வயதுடைய சிறுமூளைப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ கன்ஃபோகல் புகைப்படங்கள். அளவுகோல் பட்டை, 450μm. (C) AAV-கடத்தப்பட்ட சுழல்களில் புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தியின் அளவீடு (மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு; n = 3 முதல் 4 எலிகள்). தரவு சராசரி ± SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது; ***P<0.001. (D) பிரதிநிதி FLIM படம் குறிப்பிட்ட சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் குளுதாதயோன் ரெடாக்ஸ் சென்சார் Grx1-roGFP2 ஐ வெளிப்படுத்தும் 7 வார வயதுடைய PN இன் சராசரி ஆயுட்காலத்தைக் காட்டுகிறது. LUT (பார்வை அட்டவணை) விகிதம்: உயிர்வாழும் நேர இடைவெளி (பைக்கோ வினாடிகளில்). அளவுகோல் பட்டை, 25μm. (E) ஒவ்வொரு நிபந்தனையின் கீழும் இரண்டு எலிகளில் (D) (n=158 செல்கள் முதல் 368 செல்கள் வரை) Grx1-roGFP2 வாழ்நாள் மதிப்புகளின் பரவலை ஹிஸ்டோகிராம் காட்டுகிறது. ஒவ்வொரு ஹிஸ்டோகிராமிற்கும் மேலே உள்ள பை விளக்கப்படம்: CTRL-AAV-scr இல் சராசரி ஆயுட்கால மதிப்பின் 1 SD ஐ விட அதிகமாக இருக்கும் கணிசமாக நீண்ட (சிவப்பு, ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட) அல்லது குறுகிய (நீலம், குறைக்கப்பட்ட) ஆயுட்கால மதிப்புகளைக் கொண்ட செல்களின் எண்ணிக்கையைக் காட்டுகிறது. (F) முன்மொழியப்பட்ட மாதிரி நியூரானல் PCx இன் மேல்நோக்கிய ஒழுங்குமுறையின் பாதுகாப்பு விளைவைக் காட்டுகிறது.
மொத்தத்தில், நாங்கள் இங்கு வழங்கும் தரவு, MFN2 இன் மறு வெளிப்பாடு கடுமையான OXPHOS குறைபாடு, கடுமையான mtDNA குறைபாடு மற்றும் மிகவும் அசாதாரணமான ista போன்ற உருவவியல் ஆகியவற்றுடன் மேம்பட்ட PN ஐ முழுமையாக மீட்டெடுக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறது, இதன் மூலம் மேம்பட்ட நோய்களிலும் கூட தொடர்ச்சியான முன்னேற்றத்தை வழங்குகிறது. நியூரோடிஜெனரேஷன் செல் இறப்புக்கு முந்தைய நிலையின் மீளக்கூடிய சான்றுகளை வழங்குகிறது. இந்த அளவிலான வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்வுத்தன்மை, நியூரான்களின் பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியைத் தூண்டும் திறனால் மேலும் வலியுறுத்தப்படுகிறது (TCA சுழற்சியின் மறுசீரமைப்பு), இது OXPHOS இல்லாத PNகளில் PCx வெளிப்பாட்டைத் தடுக்கிறது மற்றும் செல் இறப்பை அதிகரிக்கிறது, இதன் மூலம் ஒரு பாதுகாப்புப் பாத்திரத்தை வகிக்கிறது (படம் 5F).
இந்த ஆய்வில், OXPHOS செயலிழப்புக்கு PN களின் பதில், வளர்சிதை மாற்ற நிரல்களால் செயல்படுத்தப்படும் வேறுபட்ட செயல்படுத்தும் பாதை வழியாக படிப்படியாக TCA சுழற்சி பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சிக்கு மாறுவதாகும் என்பதற்கான ஆதாரங்களை நாங்கள் வழங்கினோம். பல நிரப்பு முறைகளுடன் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் கடுமையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு சவால் செய்யும்போது, ​​நியூரான்கள் முன்னர் அறியப்படாத வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்ச்சித்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன என்பதை வெளிப்படுத்தினோம். எங்களுக்கு ஆச்சரியமாக, முழு ரீவயரிங் செயல்முறையும் படிப்படியாகவும் மீளமுடியாததாகவும் நியூரோடிஜெனரேஷனுடன் வரும் முனைய வளர்சிதை மாற்ற நிலையைக் குறிக்க வேண்டிய அவசியமில்லை, ஆனால் செல் இறப்புக்கு முந்தைய கட்டத்தில் கூட அது ஒரு பராமரிப்பு நியூரானை உருவாக்கக்கூடும் என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது. செயல்பாட்டு இழப்பீட்டு பொறிமுறை. நியூரான்கள் உடலில் கணிசமான அளவு வளர்சிதை மாற்ற நெகிழ்ச்சித்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன என்பதை இந்த கண்டுபிடிப்பு குறிக்கிறது. MFN2 இன் பிற்கால மறு அறிமுகம் முக்கிய வளர்சிதை மாற்ற குறிப்பான்களின் வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைக்கும் மற்றும் PN சிதைவைத் தடுக்கும் என்பதை இந்த உண்மை நிரூபிக்கிறது. மாறாக, இது பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியைத் தடுக்கிறது மற்றும் நரம்புகளை துரிதப்படுத்துகிறது. திருநங்கை.
எங்கள் ஆராய்ச்சியில் மிகவும் சுவாரஸ்யமான கண்டுபிடிப்புகளில் ஒன்று, OXPHOS இல்லாத PNகள், குறிப்பாக தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியைத் தூண்டும் நொதிகளை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் TCA சுழற்சி வளர்சிதை மாற்றத்தை மாற்றியமைக்க முடியும். வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்பு என்பது புற்றுநோய் செல்களின் பொதுவான அம்சமாகும், அவற்றில் சில TCA சுழற்சி இடைநிலைகளை நிரப்ப குளுட்டமைனை நம்பியுள்ளன, அவை குறைக்கும் சமமானவற்றை உற்பத்தி செய்கின்றன, அவை சுவாசச் சங்கிலியை இயக்குகின்றன மற்றும் லிப்பிட் மற்றும் நியூக்ளியோடைடு உயிரியல் தொகுப்பு முன்னோடிகளின் உற்பத்தியைப் பராமரிக்கின்றன (39, 40). OXPHOS செயலிழப்பை அனுபவிக்கும் புற திசுக்களில், குளுட்டமைன்/குளுட்டமேட் வளர்சிதை மாற்றத்தின் மறு இணைப்பும் ஒரு முக்கிய அம்சமாகும் என்று ஒரு சமீபத்திய ஆய்வு காட்டுகிறது (5, 41), அங்கு TCA சுழற்சியில் குளுட்டமைன் நுழைவின் திசை OXPHOS காயத்தின் தீவிரத்தன்மை காரணமாக (41). இருப்பினும், உடலில் உள்ள நரம்பியல் வளர்சிதை மாற்ற பிளாஸ்டிசிட்டியின் எந்த ஒற்றுமைக்கும், நோய் சூழலில் அதன் சாத்தியமான பொருத்தத்திற்கும் தெளிவான சான்றுகள் இல்லை. சமீபத்திய இன் விட்ரோ ஆய்வில், முதன்மை கார்டிகல் நியூரான்கள் நரம்பியக்கடத்தலுக்கான குளுட்டமேட் குளங்களைத் திரட்டுவதாகக் காட்டப்பட்டது, இதன் மூலம் வளர்சிதை மாற்ற அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியை ஊக்குவிக்கிறது (42). TCA சுழற்சி நொதியான சக்சினேட் டீஹைட்ரோஜினேஸின் மருந்தியல் தடுப்பின் கீழ், பைருவேட் கார்பாக்சிலேஷன் வளர்ப்பு சிறுமூளை கிரானுல் நியூரான்களில் ஆக்சலோஅசிடேட்டின் தொகுப்பைப் பராமரிக்கும் என்று நம்பப்படுகிறது (34). இருப்பினும், மூளை திசுக்களுக்கு இந்த வழிமுறைகளின் உடலியல் பொருத்தம் (பெருந்தமனி தடிப்பு முக்கியமாக ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளுக்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டதாக நம்பப்படுகிறது) இன்னும் முக்கியமான உடலியல் முக்கியத்துவத்தைக் கொண்டுள்ளது (43). இந்த விஷயத்தில், உடலில் OXPHOS ஆல் சேதமடைந்த PN களை BCAA சிதைவு மற்றும் பைருவேட் கார்பாக்சிலேஷனுக்கு மாற்றலாம் என்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது, அவை TCA பூல் இடைநிலைகளின் கூடுதல் ஆதாரங்களாகும். நரம்பியல் ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்திற்கு BCAA கேடபாலிசத்தின் உத்தேச பங்களிப்பு முன்மொழியப்பட்டாலும், நரம்பியக்கடத்தலுக்கான குளுட்டமேட் மற்றும் GABA இன் பங்கிற்கு கூடுதலாக (44), உயிரியல் ரீதியாக இந்த வழிமுறைகளுக்கு இன்னும் எந்த ஆதாரமும் இல்லை. எனவே, செயலிழந்த PN கள் பெருந்தமனி தடிப்புத் தோல் அழற்சியை அதிகரிப்பதன் மூலம் ஒருங்கிணைப்பு செயல்முறையால் இயக்கப்படும் TCA இடைநிலைகளின் நுகர்வுக்கு தானாகவே ஈடுசெய்ய முடியும் என்று ஊகிக்க எளிதானது. குறிப்பாக, அஸ்பார்டிக் அமிலத்திற்கான அதிகரித்த தேவையை பராமரிக்க PCx இன் மேல் ஒழுங்குமுறை தேவைப்படலாம், இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் செல்களை பெருக்குவதில் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது (45). இருப்பினும், எங்கள் வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்வு Mfn2cKO PN களில் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தின் நிலையான-நிலை மட்டத்தில் எந்த குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களையும் வெளிப்படுத்தவில்லை (படம் S6A), இது பெருக்கமடைந்த செல்கள் மற்றும் பிந்தைய-மைட்டோடிக் நியூரான்களுக்கு இடையில் அஸ்பார்டிக் அமிலத்தின் வெவ்வேறு வளர்சிதை மாற்ற பயன்பாட்டை பிரதிபலிக்கிறது. விவோவில் செயல்படாத நியூரான்களில் PCx மேல் ஒழுங்குமுறையின் சரியான வழிமுறை இன்னும் வகைப்படுத்தப்பட வேண்டியிருந்தாலும், இந்த முன்கூட்டிய பதில் நியூரான்களின் ரெடாக்ஸ் நிலையை பராமரிப்பதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபித்தோம், இது சிறுமூளை துண்டுகள் மீதான FLIM சோதனைகளில் நிரூபிக்கப்பட்டது. குறிப்பாக, PCx ஐ மேல்-ஒழுங்குபடுத்துவதில் இருந்து PN களைத் தடுப்பது அதிக ஆக்ஸிஜனேற்ற நிலைக்கு வழிவகுக்கும் மற்றும் செல் இறப்பை துரிதப்படுத்தும். BCAA சிதைவை செயல்படுத்துவதும் பைருவேட்டின் கார்பாக்சிலேஷன்ம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் புற திசுக்களை வகைப்படுத்துவதற்கான வழிகள் அல்ல (7). ஆகையால், அவை OXPHOS- குறைபாடுள்ள நியூரான்களின் முன்னுரிமை அம்சமாகத் தெரிகிறது, அவை மட்டுமே அம்சமாக இல்லாவிட்டாலும், நரம்பணுச் சிதைவுக்கு முக்கியமானவை. .
சிறுமூளை நோய் என்பது ஒரு பன்முகத்தன்மை கொண்ட நரம்பு சிதைவு நோயாகும், இது பொதுவாக அட்டாக்ஸியாவாக வெளிப்படுகிறது மற்றும் பெரும்பாலும் PN களை சேதப்படுத்துகிறது (46). இந்த நியூரான் மக்கள் தொகை குறிப்பாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கு ஆளாகிறது, ஏனெனில் எலிகளில் அவற்றின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட சிதைவு மனித ஸ்பினோசெரிபெல்லர் அட்டாக்ஸியாவை வகைப்படுத்தும் பல மோட்டார் அறிகுறிகளை இனப்பெருக்கம் செய்ய போதுமானது (16, 47, 48). அறிக்கைகளின்படி, ஒரு பிறழ்ந்த மரபணுவுடன் கூடிய ஒரு டிரான்ஸ்ஜெனிக் எலி மாதிரி மனித ஸ்பினோசெரிபெல்லர் அட்டாக்ஸியாவுடன் தொடர்புடையது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு உள்ளது (49, 50), PNPH இல் OXPHOS குறைபாட்டின் விளைவுகளைப் படிப்பதன் முக்கியத்துவத்தை வலியுறுத்துகிறது. எனவே, இந்த தனித்துவமான நியூரான் மக்கள்தொகையை திறம்பட தனிமைப்படுத்தி ஆய்வு செய்வது மிகவும் பொருத்தமானது. இருப்பினும், PN கள் அழுத்தத்திற்கு மிகவும் உணர்திறன் கொண்டவை மற்றும் முழு சிறுமூளை செல் மக்கள்தொகையில் குறைந்த விகிதத்தைக் கொண்டிருப்பதால், பல ஓமிக்ஸ் அடிப்படையிலான ஆய்வுகளுக்கு, அவற்றை முழு செல்களாகத் தேர்ந்தெடுத்துப் பிரிப்பது இன்னும் ஒரு சவாலான அம்சமாகும். மற்ற செல் வகைகளின் (குறிப்பாக வயதுவந்த திசுக்களின்) முழுமையான மாசுபாட்டை அடைவது கிட்டத்தட்ட சாத்தியமற்றது என்றாலும், கீழ்நிலை புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்விற்கான போதுமான எண்ணிக்கையிலான சாத்தியமான நியூரான்களைப் பெற FACS உடன் ஒரு பயனுள்ள விலகல் படியை நாங்கள் இணைத்தோம், மேலும் முழு சிறுமூளையின் தற்போதைய தரவுத் தொகுப்போடு ஒப்பிடும்போது மிக அதிக புரதக் கவரேஜை (சுமார் 3000 புரதங்கள்) கொண்டுள்ளோம் (51). முழு செல்களின் நம்பகத்தன்மையைப் பாதுகாப்பதன் மூலம், நாங்கள் இங்கு வழங்கும் முறை மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களைச் சரிபார்க்க மட்டுமல்லாமல், அதன் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சகாக்களில் ஏற்படும் மாற்றங்களையும் சரிபார்க்க அனுமதிக்கிறது, இது செல் வகையை வளப்படுத்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு குறிச்சொற்களைப் பயன்படுத்துவதை நிறைவு செய்கிறது. சிக்கலான திசுக்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கைக்கான புதிய முறை (52, 53). நாங்கள் விவரிக்கும் முறை புர்கின்ஜே செல்களின் ஆய்வுடன் தொடர்புடையது மட்டுமல்லாமல், நோயுற்ற மூளையில் வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களை நிவர்த்தி செய்ய எந்த வகையான செல்லுக்கும் எளிதாகப் பயன்படுத்தலாம், இதில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கான பிற மாதிரிகள் அடங்கும்.
இறுதியாக, இந்த வளர்சிதை மாற்ற மறுசீரமைப்பு செயல்முறையின் போது செல்லுலார் அழுத்தத்தின் முக்கிய அறிகுறிகளை முற்றிலுமாக மாற்றியமைக்கக்கூடிய மற்றும் நரம்பியல் சிதைவைத் தடுக்கக்கூடிய ஒரு சிகிச்சை சாளரத்தை நாங்கள் அடையாளம் கண்டுள்ளோம். எனவே, இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ள மறுசீரமைப்பின் செயல்பாட்டு தாக்கங்களைப் புரிந்துகொள்வது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் போது நரம்பியல் நம்பகத்தன்மையைப் பராமரிப்பதற்கான சாத்தியமான சிகிச்சைகள் குறித்த அடிப்படை நுண்ணறிவுகளை வழங்கக்கூடும். பிற மூளை செல் வகைகளில் ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களைப் பிரிப்பதை நோக்கமாகக் கொண்ட எதிர்கால ஆராய்ச்சி, இந்த கொள்கையின் பொருந்தக்கூடிய தன்மையை மற்ற நரம்பியல் நோய்களுக்கு முழுமையாக வெளிப்படுத்தத் தேவை.
MitoPark எலிகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன (31). loxP பக்கவாட்டில் Mfn2 மரபணுக்களைக் கொண்ட C57BL/6N எலிகள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன (18) மற்றும் L7-Cre எலிகளுடன் கலப்பினம் செய்யப்பட்டுள்ளன (23). இதன் விளைவாக இரட்டை ஹெட்டோரோசைகஸ் சந்ததி பின்னர் ஹோமோசைகஸ் Mfn2loxP/Mfn2loxP எலிகளுடன் கலப்பினம் செய்யப்பட்டது, இதனால் Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) க்கான புர்கின்ஜே-குறிப்பிட்ட மரபணு நாக் அவுட்கள் உருவாக்கப்பட்டன. இனச்சேர்க்கையின் துணைக்குழுவில், Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP அல்லீல் (stop-mtYFP) கூடுதல் கலப்பினங்கள் மூலம் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது (20). அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் ஐரோப்பிய, தேசிய மற்றும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன மற்றும் ஜெர்மனியின் வடக்கு ரைன்-வெஸ்ட்பாலியாவின் உம்வெல்ட் மற்றும் வெர்ப்ராச்செர்சுட்ஸின் லேண்டேசம்ட்ஃபர்நேட்டரால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன. விலங்கு வேலை ஐரோப்பிய ஆய்வக விலங்கு அறிவியல் சங்கங்களின் கூட்டமைப்பின் வழிகாட்டுதலையும் பின்பற்றுகிறது.
கர்ப்பிணிப் பெண்ணின் கர்ப்பப்பை வாய் இடப்பெயர்ச்சிக்கு மயக்க மருந்து கொடுத்த பிறகு, எலி கரு தனிமைப்படுத்தப்படுகிறது (E13). 10 mM ஹெப்ஸுடன் கூடுதலாக ஹாங்க்ஸின் சமச்சீர் உப்பு கரைசலில் (HBSS) புறணிப் பகுதி பிரிக்கப்பட்டு, பப்பெய்ன் (20 U/ml) மற்றும் சிஸ்டைன் (1μg/ml) ஆகியவற்றைக் கொண்ட டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் மீடியத்தில் செலுத்தப்பட்டது. DMEM இல் திசுக்களை அடைகாத்து, நொதி செரிமானம் மூலம் பிரிக்கவும். Ml) 37°C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்கள், பின்னர் 10% கரு போவின் சீரம் உடன் கூடுதலாக DMEM இல் இயந்திரத்தனமாக அரைக்கப்பட்டது. பாலிசினுடன் பூசப்பட்ட கண்ணாடி கவர்ஸ்லிப்களில் செல்கள் விதைக்கப்பட்டன, 6 செ.மீ கலாச்சார உணவிற்கு 2×106 அடர்த்தியில் அல்லது இமேஜிங் பகுப்பாய்விற்காக 0.5×105 செல்கள்/cm2 அடர்த்தியில். 4 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, ஊடகம் 1% B27 சப்ளிமெண்ட் மற்றும் 0.5 mM குளுட்டாமேக்ஸ் கொண்ட நியூரோபாசல் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தால் மாற்றப்பட்டது. பின்னர் நியூரான்கள் சோதனை முழுவதும் 37°C மற்றும் 5% CO2 வெப்பநிலையில் பராமரிக்கப்பட்டு, வாரத்திற்கு ஒரு முறை உணவளிக்கப்பட்டன. இன் விட்ரோவில் மறுசேர்க்கையைத் தூண்டுவதற்காக, பின்வரும் AAV9 வைரஸ் திசையனின் 3μl (24-கிணறு வளர்ப்பு டிஷ்) அல்லது 0.5μl (24-கிணறு தட்டு) நியூரான்களுக்கு இன் விட்ரோவில் சிகிச்சையளிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, பட்டியல் எண் 105530-AAV9) மற்றும் AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, பட்டியல் எண் 105545-AAV9).
சுட்டி Mfn1 மற்றும் Mfn2 நிரப்பு DNA (முறையே Addgene பிளாஸ்மிட் #23212 மற்றும் #23213 இலிருந்து பெறப்பட்டது) C-டெர்மினஸில் V5 வரிசையுடன் (GKPIPNPLLGLDST) குறிக்கப்படுகின்றன, மேலும் T2A வரிசை மூலம் சட்டத்தில் mCherry உடன் இணைக்கப்படுகின்றன. Grx1-roGFP2 என்பது ஹைடெல்பெர்க் TP டிக் DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) இன் பரிசு. வழக்கமான குளோனிங் முறைகளைப் பயன்படுத்தி tdTomato கேசட்டை மாற்றுவதன் மூலம், கேசட் pAAV-CAG-FLEX-tdTomato முதுகெலும்பில் (Addgene குறிப்பு எண் 28306) துணைக் குளோன் செய்யப்பட்டு pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 மற்றும் pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 திசையன்களை உருவாக்கியது. pAAV-CAG-FLEX-mCherry கட்டுப்பாட்டு திசையனை உருவாக்க இதே போன்ற ஒரு உத்தி பயன்படுத்தப்பட்டது. AAV-shPCx கட்டமைப்பை உருவாக்க, ஒரு பிளாஸ்மிட் AAV திசையன் (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) தேவைப்படுகிறது, இது shRNA ஐ இலக்காகக் கொண்ட மவுஸ் PCx ஐ குறியாக்கம் செய்யும் DNA வரிசையைக் கொண்டுள்ளது (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 ஊக்குவிப்பாளரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ், mCherry CMV ஊக்குவிப்பாளரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் பயன்படுத்தப்படுகிறது. துணை AAV திசையன்களின் உற்பத்தி உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி (செல் பயோலாப்ஸ்) மேற்கொள்ளப்பட்டது. சுருக்கமாக, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ஆகியவற்றைக் கொண்ட பரிமாற்ற பிளாஸ்மிடை தற்காலிகமாகப் பயன்படுத்தவும். 293AAV செல்கள்-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) அல்லது Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) குறியீட்டு மரபணுவை மாற்றுதல், அத்துடன் AAV1 கேப்சிட் புரதம் மற்றும் துணை புரதத்தை குறியிடுதல் கால்சியம் பாஸ்பேட் முறையைப் பயன்படுத்தி பிளாஸ்மிட் பிளாஸ்மிட்டை பேக்கேஜிங் செய்தல். கச்சா வைரஸ் சூப்பர்நேட்டண்ட் உலர்ந்த பனி/எத்தனால் குளியல் மற்றும் பாஸ்பேட் பஃபர் செய்யப்பட்ட உப்புநீரில் (PBS) உறைதல்-உருகும் சுழற்சிகள் மூலம் பெறப்பட்டது. AAV திசையன் தொடர்ச்சியற்ற அயோடிக்சனால் சாய்வு அல்ட்ராசென்ட்ரிஃபிகேஷன் (32,000 rpm மற்றும் 4°C இல் 24 மணிநேரம்) மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டது மற்றும் அமிகான் அல்ட்ரா-15 மையவிலக்கு வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி செறிவூட்டப்பட்டது. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 மரபணு நகல் (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ஆகியவற்றின் மரபணு டைட்டர் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி இருந்தது (54), நிகழ்நேர அளவு PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) மற்றும் AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ஆகியவற்றால் அளவிடப்பட்டது.
முதன்மை நியூரான்கள் ஐஸ்-குளிர் 1x PBS இல் அகற்றப்பட்டு, துளையிடப்பட்டு, பின்னர் பாஸ்பேடேஸ் மற்றும் புரோட்டீஸ் தடுப்பானை (ரோச்) கொண்ட 0.5% ட்ரைட்டான் X-100 / 0.5% சோடியம் டீஆக்ஸிகோலேட்/பிபிஎஸ் லிசிஸ் பஃபரில் ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டன. பிசின்கோனினிக் அமில மதிப்பீட்டை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி புரத அளவீடு செய்யப்பட்டது. பின்னர் புரதங்கள் SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்பட்டன, பின்னர் ஒரு பாலிவினைலைடின் ஃப்ளோரைடு சவ்வு (GE ஹெல்த்கேர்) மீது துடைக்கப்பட்டன. குறிப்பிட்ட அல்லாத தளங்களைத் தடுத்து, TBST இல் 5% பாலில் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (விவரங்களுக்கு அட்டவணை S1 ஐப் பார்க்கவும்) அடைகாக்கவும் (ட்வீனுடன் ட்ரிஸ்-பஃபர் செய்யப்பட்ட உப்பு), TBST இன்குபேட்டில் சலவை படிகள் மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடி. +4°C இல் இரவு முழுவதும் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கவும். கழுவிய பின், அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்துங்கள். பின்னர், அதே ப்ளாட்டை ஆன்டி-β-ஆக்டின் ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாப்பதன் மூலம், அதே ஏற்றுதல் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. வேதியியல் ஒளிர்வுக்கு மாற்றுவதன் மூலமும் வேதியியல் ஒளிர்வை மேம்படுத்துவதன் மூலமும் கண்டறிதல் (GE ஹெல்த்கேர்).
கண்ணாடி உறைச் சுவடுகளில் முன்னர் விதைக்கப்பட்ட நியூரான்கள் அறை வெப்பநிலையில் குறிப்பிட்ட நேரப் புள்ளியில் 10 நிமிடங்களுக்கு 4% பாராஃபோர்மால்டிஹைடு (PFA)/PBS உடன் சரி செய்யப்பட்டன. உறைச் சுவடுகளில் முதலில் அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு 0.1% ட்ரைட்டான் X-100/PBS உடன் ஊடுருவி, பின்னர் தடுப்பு இடையகத்தில் [3% போவின் சீரம் அல்புமின் (BSA)/PBS] செலுத்தப்படுகின்றன. இரண்டாவது நாளில், உறைச் சுவடுகளில் தடுப்பு இடையகத்தைக் கழுவி, அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் பொருத்தமான ஃப்ளோரோஃபோர்-இணைந்த இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கப்பட்டது; இறுதியாக, மாதிரிகள் PBS இல் 4′,6-டயமிடினோ-2 -ஃபெனிலிண்டோல் (DAPI) உடன் நன்கு கழுவப்பட்டு, பின்னர் அக்வா-பாலி/மவுண்ட் மூலம் நுண்ணோக்கி ஸ்லைடில் சரி செய்யப்பட்டன.
ஆண் மற்றும் பெண் எலிகளுக்கு (ஆண்) கெட்டமைன் (130 மி.கி/கி.கி) மற்றும் சைலாசின் (10 மி.கி/கி.கி) இன்ட்ராபெரிட்டோனியல் ஊசி மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது, மேலும் கார்ப்ரோஃபென் வலி நிவாரணி (5 மி.கி/கி.கி) உடன் தோலடி முறையில் செலுத்தப்பட்டது, மேலும் ஒரு சூடான திண்டு பொருத்தப்பட்ட ஸ்டீரியோடாக்டிக் கருவியில் (கோப்ஃப்) வைக்கப்பட்டது. மண்டை ஓட்டை வெளிப்படுத்தி, மிஸ் எலும்புடன் தொடர்புடைய சிறுமூளைப் புறணியின் பகுதியை மெல்லியதாக மாற்ற பல் துலக்குதலைப் பயன்படுத்தவும் (லாம்ப்டாவிலிருந்து: வால் 1.8, பக்கவாட்டு 1, லோபுல்ஸ் IV மற்றும் V உடன் தொடர்புடையது). கீழே உள்ள வாஸ்குலேச்சரை சீர்குலைப்பதைத் தவிர்க்க மண்டை ஓட்டில் ஒரு சிறிய துளையை கவனமாக உருவாக்க வளைந்த சிரிஞ்ச் ஊசியைப் பயன்படுத்தவும். பின்னர் மெல்லிய வரையப்பட்ட கண்ணாடி நுண்குழாய் மெதுவாக நுண் துளைக்குள் (டூரா மேட்டரின் வென்ட்ரல் பக்கத்தில் -1.3 முதல் -1 வரை) செருகப்படுகிறது, மேலும் 200 முதல் 300 nl AAV நுண் ஊசியில் (நரிஷிகே) கையேடு சிரிஞ்ச்கள் (நரிஷிகே) மூலம் 10 முதல் 20 நிமிடங்கள் வரை குறைந்த அழுத்தத்தில் பல முறை செலுத்தப்படுகிறது. உட்செலுத்தலுக்குப் பிறகு, வைரஸ் முழுமையாக பரவ அனுமதிக்க நுண்குழாய்களை மேலும் 10 நிமிடங்கள் வைக்கவும். நுண்குழாய்கள் அகற்றப்பட்ட பிறகு, காயம் வீக்கத்தைக் குறைக்கவும், விலங்கு குணமடையவும் தோல் கவனமாக தைக்கப்படுகிறது. அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு பல நாட்களுக்கு விலங்குகளுக்கு வலி நிவாரணி மருந்துகள் (காஸ்போஃபென்) சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது, அந்த நேரத்தில் அவற்றின் உடல் நிலை கவனமாகக் கண்காணிக்கப்பட்டு, குறிப்பிட்ட நேரத்தில் அவை கருணைக்கொலை செய்யப்பட்டன. அனைத்து நடைமுறைகளும் ஐரோப்பிய, தேசிய மற்றும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களின்படி மேற்கொள்ளப்பட்டன, மேலும் ஜெர்மனியின் வடக்கு ரைன்-வெஸ்ட்பாலியாவில் உள்ள உம்வெல்ட் மற்றும் வெர்ப்ராச்செர்சுட்ஸின் லேண்டேசம்ட்ஃபர்நேட்டரால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன.
விலங்குகளுக்கு கெட்டமைன் (100 மி.கி/கி.கி) மற்றும் சைலாசின் (10 மி.கி/கி.கி) மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது, மேலும் இதயம் முதலில் 0.1 M PBS உடன், பின்னர் PBS இல் 4% PFA உடன் பெர்ஃப்யூஸ் செய்யப்பட்டது. திசு துண்டிக்கப்பட்டு 4% PFA/PBS இல் ஒரே இரவில் 4°C இல் சரி செய்யப்பட்டது. PBS இல் நிலையான மூளையிலிருந்து சாகிட்டல் பிரிவுகளை (50 μm தடிமன்) தயாரிக்க ஒரு அதிர்வுறும் கத்தி (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ் GmbH, வியன்னா, ஆஸ்திரியா) பயன்படுத்தப்பட்டது. வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி (13) அறை வெப்பநிலையிலும் கிளறலிலும் ஃப்ரீ-மிதக்கும் பிரிவுகளின் கறை படிதல் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, முதலில், பெறப்பட்ட துண்டுகள் அறை வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 0.5% ட்ரைடன் X-100/PBS உடன் ஊடுருவச் செய்யப்பட்டன; சில எபிடோப்களுக்கு (Pcx மற்றும் Shmt2), 80°C (PH 9) இல் டிரிஸ்-EDTA பஃபரில் துண்டுகளை 25 நிமிடங்கள் சூடாக்கவும். அடுத்து, பிரிவுகள் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (அட்டவணை S1 ஐப் பார்க்கவும்) பிளாக்கிங் பஃபரில் (3% BSA/PBS) 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் கிளறி, இன்குபேட்டட் செய்யப்பட்டன. அடுத்த நாள், பிரிவுகள் பிளாக்கிங் பஃபரால் கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் பொருத்தமான ஃப்ளோரோஃபோர்-இணைந்த இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் இன்குபேட்டட் செய்யப்பட்டன; இறுதியாக, பிரிவுகள் PBS இல் நன்கு கழுவப்பட்டு, DAPI உடன் எதிர்-கறை படிந்தன, பின்னர் ஒரு நுண்ணோக்கி ஸ்லைடில் AquaPolymount உடன் சரி செய்யப்பட்டன.
மாதிரியைப் படம்பிடிக்க, வெள்ளை ஒளி லேசர் மற்றும் 405 டையோடு புற ஊதா லேசர் பொருத்தப்பட்ட லேசர் ஸ்கேனிங் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப் (TCS SP8-X அல்லது TCS டிஜிட்டல் லைட் ஷீட், லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஃப்ளோரோஃபோரை உற்சாகப்படுத்தி, ஹைப்ரிட் டிடெக்டர் (HyDs) மூலம் சிக்னலைச் சேகரிப்பதன் மூலம், LAS-X மென்பொருள் Nyquist மாதிரிக்கு இணங்க அடுக்கப்பட்ட படங்களை வரிசைமுறை முறையில் சேகரிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது: அளவு அல்லாத பேனல்களுக்கு, இது மிகவும் டைனமிக் சிக்னல்கள் (எடுத்துக்காட்டாக, சோமாடிக் செல்கள் மற்றும் டென்ட்ரைட்டுகளில்) mtYFP) BrightR பயன்முறையில் PNகளின் எண்ணிக்கையைக் கண்டறிய HyD ஐப் பயன்படுத்தவும். பின்னணியைக் குறைக்க 0.3 முதல் 6 ns வரை கேட்டிங் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
வரிசைப்படுத்தப்பட்ட செல்களின் நிகழ்நேர இமேஜிங். 1% B27 சப்ளிமெண்ட் மற்றும் 0.5 mM GlutaMax கொண்ட நியூரோபாசல்-A ஊடகத்தில் வரிசைப்படுத்திய பிறகு, செல்கள் உடனடியாக பாலி-எல்-லைசின்-பூசப்பட்ட கண்ணாடி ஸ்லைடுகளில் (μ-Slide8 Well, Ibidi, பட்டியல் எண் 80826) விதைக்கப்பட்டன, பின்னர் செல்கள் நிலைபெற அனுமதிக்க 37°C மற்றும் 5% CO2 இல் 1 மணி நேரம் வைத்திருங்கள். வெள்ளை லேசர், HyD, 63×[1.4 எண் துளை (NA)] எண்ணெய் புறநிலை லென்ஸ் மற்றும் ஒரு வெப்பமூட்டும் நிலை பொருத்தப்பட்ட லைக்கா SP8 லேசர் ஸ்கேனிங் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப்பில் நிகழ்நேர இமேஜிங் செய்யப்பட்டது.
எலிக்கு கார்பன் டை ஆக்சைடு மூலம் விரைவாக மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டு தலை துண்டிக்கப்பட்டது, மூளை மண்டை ஓட்டிலிருந்து விரைவாக அகற்றப்பட்டு, 200μm தடிமன் (13C லேபிளிங் பரிசோதனைக்கு) அல்லது 275μm தடிமன் (இரண்டு ஃபோட்டான் பரிசோதனைகளுக்கு) சாகிட்டல் பிரிவில் பின்வரும் பொருட்களால் நிரப்பப்பட்டது. ஐஸ்கிரீம் (HM-650 V, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்டோர்ஃப், ஜெர்மனி) பின்வரும் பொருட்களால் நிரப்பப்பட்டுள்ளது: 125 mM பனி-குளிர், கார்பன்-நிறைவுற்ற (95% O2 மற்றும் 5% CO2) குறைந்த Ca2 + செயற்கை செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25 mM NaHCO3, 25 mM குளுக்கோஸ், 0.5 mM CaCl2 மற்றும் 3.5 mM MgCl2 (310 முதல் 330 mmol வரை ஆஸ்மோடிக் அழுத்தம்). பெறப்பட்ட மூளைத் துண்டுகளை அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 2.0 mM MgCl2) நடுத்தர) pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mmol) கொண்ட முன்-இன்குபேஷன் அறைக்கு மாற்றவும்.
இமேஜிங் செயல்பாட்டின் போது, ​​துண்டுகள் ஒரு பிரத்யேக இமேஜிங் அறைக்கு நகர்த்தப்பட்டன, மேலும் 32° முதல் 33°C வரை நிலையான வெப்பநிலையில் தொடர்ச்சியான ACSF பெர்ஃப்யூஷனின் கீழ் சோதனை செய்யப்பட்டது. லைக்கா 25x ஆப்ஜெக்டிவ் லென்ஸ் (NA 0.95, நீர்), Ti: சபையர் லேசர் (பச்சோந்தி விஷன் II, கோஹெரன்ட்) பொருத்தப்பட்ட ஒரு மல்டிஃபோட்டான் லேசர் ஸ்கேனிங் நுண்ணோக்கி (TCS SP8 MP-OPO, லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) ஸ்லைஸ் இமேஜிங்கிற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. FLIM தொகுதி (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 இன் FLIM. PN களின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரெடாக்ஸ் நிலையில் ஏற்படும் மாற்றங்கள், சாகிட்டல் மூளை துண்டுகளில் இரண்டு-ஃபோட்டான் FLIM மூலம் அளவிடப்பட்டன, அங்கு Grx1-roGFP2 பயோசென்சர் PN களை இலக்காகக் கொண்டது. PN அடுக்கில், சாத்தியமான PN (அதாவது, மணிகள் கொண்ட அமைப்பு இல்லாதது அல்லது டென்ட்ரைட்டுகளுடன் நரம்பியல் உருவ மாற்றங்கள்) மற்றும் இரட்டை நேர்மறை roGFP2 சென்சார் மற்றும் AAV குறியாக்கம் shRNA PCx அல்லது அதன் கட்டுப்பாட்டு வரிசை (ஒவ்வொன்றும் mCherry ஐ இணை வெளிப்படுத்துகிறது) இருப்பதை உறுதிசெய்ய, ஸ்லைஸ் மேற்பரப்பிலிருந்து சுமார் 50 முதல் 80 μm வரை கையகப்படுத்தல் புலம் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. 2x டிஜிட்டல் ஜூம் [உற்சாக அலைநீளம்: 890 nm; 512 nm 512 பிக்சல்கள்] கொண்ட ஒற்றை-அடுக்கு படங்களை சேகரிக்கவும். கண்டறிதல்: உள் HyD, ஃப்ளோரசெசின் ஐசோதியோசயனேட் (FITC) வடிகட்டி குழு] மற்றும் 2 முதல் 3 நிமிடங்களுக்குள் சராசரியாக எடுக்கப்பட்ட படம் ஆகியவை வளைவு பொருத்துதலுக்கு போதுமான ஃபோட்டான்கள் சேகரிக்கப்படுவதை உறுதிசெய்யப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன (மொத்தம் 1000 ஃபோட்டான்கள்). Grx1-roGFP2 ஆய்வின் உணர்திறன் மற்றும் FLIM நிலைமைகளின் சரிபார்ப்பு, பெர்ஃப்யூஷன் ACSF இல் வெளிப்புற 10 mM H2O2 ஐச் சேர்க்கும்போது roGFP2 இன் ஆயுட்கால மதிப்பைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் செய்யப்பட்டது (ஆக்சிஜனேற்றத்தை அதிகரிக்க, ஆயுட்காலம் அதிகரிக்கும்), பின்னர் 2 mM டைதியோத்ரைட்டோலைச் சேர்ப்பதன் மூலம் (குறைப்பின் அளவைக் குறைக்கிறது, ஆயுட்காலம் குறைகிறது) (படம் S8, D முதல் G வரை). பெறப்பட்ட முடிவுகளை பகுப்பாய்வு செய்ய FLIMfit 5.1.1 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும், முழு படத்தின் ஒற்றை அதிவேக சிதைவு வளைவை அளவிடப்பட்ட IRF (கருவி மறுமொழி செயல்பாடு) உடன் பொருத்தவும், மேலும் χ2 தோராயமாக 1 ஆகும். ஒரு ஒற்றை PN இன் வாழ்நாளைக் கணக்கிட, நரம்பு உடலைச் சுற்றியுள்ள முகமூடி கைமுறையாக வரையப்பட்டது, மேலும் ஒவ்வொரு முகமூடியிலும் சராசரி வாழ்நாள் அளவீட்டுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் சாத்தியமான பகுப்பாய்வு. கடுமையான பகுதி 100 nM TMRM உடன் நேரடியாக 30 நிமிடங்களுக்கு பெர்ஃப்யூஸ் செய்யப்பட்ட ACSF இல் சேர்க்கப்பட்ட பிறகு, PN களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சாத்தியமான மாற்றங்கள் இரண்டு-ஃபோட்டான் நுண்ணோக்கி மூலம் அளவிடப்பட்டன. TMRM இமேஜிங் 920 nm இல் ஆய்வை உற்சாகப்படுத்தி, உள் HyD (டெட்ராமெதில்ரோடமைன் ஐசோதியோசயனேட்: 585/40 nm) ஐப் பயன்படுத்தி சமிக்ஞைகளைச் சேகரிப்பதன் மூலம் செய்யப்பட்டது; அதே தூண்டுதல் அலைநீளத்தைப் பயன்படுத்தி ஆனால் mtYFP ஐ படமாக்க வேறு உள் HyD (FITC :525/50) ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம். ஒற்றை செல் மட்டத்தில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் திறனை மதிப்பிடுவதற்கு ImageJ இன் பட கால்குலேட்டர் செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தவும். சுருக்கமாக, செருகுநிரல் சமன்பாடு: சமிக்ஞை = நிமிடம் (mtYFP, TMRM) என்பது தொடர்புடைய சேனலின் ஒற்றை-அடுக்கு கன்ஃபோகல் படத்தில் புர்கின்ஜே சோமாலியில் TMRM சமிக்ஞையைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியை அடையாளம் காணப் பயன்படுகிறது. பின்னர் விளைந்த முகமூடியில் உள்ள பிக்சல் பகுதி அளவிடப்படுகிறது, பின்னர் மைட்டோகாண்ட்ரியல் திறனைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியைப் பெற mtYFP சேனலின் தொடர்புடைய வாசல் ஒற்றை-அடுக்கு படத்தில் இயல்பாக்கப்படுகிறது.
இந்தப் படம் Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி விரிவாக்கப்பட்டது. ஓடுகளின் ஸ்கேன் செய்யப்பட்ட படங்களுக்கு, LAS-X மென்பொருளால் வழங்கப்பட்ட தானியங்கி தையல் வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி ஒற்றை ஓடுகளின் மாண்டேஜ் செய்யப்படுகிறது. பட அளவுத்திருத்தத்திற்குப் பிறகு, படத்தை மேலும் செயலாக்க ImageJ மற்றும் Adobe Photoshop ஐப் பயன்படுத்தி பிரகாசம் மற்றும் மாறுபாட்டை சீராக சரிசெய்யவும். கிராஃபிக் தயாரிப்பிற்கு Adobe Illustrator ஐப் பயன்படுத்தவும்.
mtDNA குவிய பகுப்பாய்வு. கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் DNA க்கு எதிரான ஆன்டிபாடிகள் பெயரிடப்பட்ட சிறுமூளைப் பிரிவுகளில் mtDNA புண்களின் எண்ணிக்கை அளவிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு இலக்குப் பகுதியும் செல் உடல் மற்றும் ஒவ்வொரு செல்லின் கருவுக்கும் உருவாக்கப்பட்டது, மேலும் அந்தந்த பகுதி மல்டி மெஷர் பிளக்-இன் (ImageJ மென்பொருள்) ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது. சைட்டோபிளாஸ்மிக் பகுதியைப் பெற செல் உடல் பகுதியிலிருந்து அணுக்கரு பகுதியைக் கழிக்கவும். இறுதியாக, த்ரெஷோல்ட் படத்தில் mtDNA ஐக் குறிக்கும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் DNA புள்ளிகளை தானாகவே அளவிட Analyze Particles plug-in (ImageJ மென்பொருள்) பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் பெறப்பட்ட முடிவுகள் CTRL எலிகளின் PN சராசரிக்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. முடிவுகள் ஒரு செல்லுக்கு நியூக்ளியோசைடுகளின் சராசரி எண்ணிக்கையாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன.
புரத வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு. ஒற்றை செல் மட்டத்தில் PN இல் புரத வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடுவதற்கு ImageJ இன் இமேஜ் கால்குலேட்டர் செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தவும். சுருக்கமாக, தொடர்புடைய சேனலின் ஒற்றை-அடுக்கு கன்ஃபோகல் படத்தில், சமன்பாடு மூலம்: சிக்னல் = நிமிடம் (mtYFP, ஆன்டிபாடி), புர்கினாவில் ஒரு குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிக்கு நோயெதிர்ப்புத் திறனைக் காட்டும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதி அடையாளம் காணப்படுகிறது. பின்னர் விளைந்த முகமூடியில் உள்ள பிக்சல் பகுதி அளவிடப்படுகிறது, பின்னர் காட்டப்படும் புரதத்தின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியைப் பெற mtYFP சேனலின் தொடர்புடைய த்ரெஷோல்ட் ஒற்றை-ஸ்டாக் படத்தில் இயல்பாக்கப்படுகிறது.
புர்கின்ஜே செல் அடர்த்தி பகுப்பாய்வு. இமேஜ்ஜேவின் செல் கவுண்டர் செருகுநிரல், புர்கின்ஜே செல்களின் எண்ணிக்கையை எண்ணப்பட்ட செல்கள் ஆக்கிரமித்துள்ள சிறுமூளை வளையத்தின் நீளத்தால் வகுப்பதன் மூலம் புர்கின்ஜே அடர்த்தியை மதிப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மாதிரி தயாரிப்பு மற்றும் சேகரிப்பு. கட்டுப்பாட்டு குழு மற்றும் Mfn2cKO எலிகளின் மூளைகள் 0.1 M பாஸ்பேட் பஃபரில் (PB) 2% PFA/2.5% குளுடரால்டிஹைடில் சரி செய்யப்பட்டன, பின்னர் சிலியேட்டுகளைப் பயன்படுத்தி கொரோனல் பிரிவுகள் தயாரிக்கப்பட்டன (Leica Mikrosysteme GmbH, வியன்னா, ஆஸ்திரியா) (தடிமன் 50 முதல் 60 μm வரை) பின்னர் PB பஃபரில் 1% os டெட்ராக்சைடு மற்றும் 1.5% பொட்டாசியம் ஃபெரோசயனைடு ஆகியவற்றை அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் சரி செய்யப்பட்டது. பிரிவுகள் மூன்று முறை காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் கழுவப்பட்டு, பின்னர் 1% யுரேனைல் அசிடேட் கொண்ட 70% எத்தனால் கொண்டு 20 நிமிடங்கள் காய்ச்சி எடுக்கப்பட்டது. பின்னர் பிரிவுகள் தரப்படுத்தப்பட்ட ஆல்கஹாலில் நீரிழப்பு செய்யப்பட்டு, சிலிக்கான் பூசப்பட்ட கண்ணாடி ஸ்லைடுகளுக்கு இடையில் டர்குபன் ACM (அரால்டைட் காஸ்டிங் ரெசின் M) எபோக்சி ரெசினில் (எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி சயின்சஸ், பட்டியல் எண் 14040) பதிக்கப்பட்டன, இறுதியாக 60°C இல் 48 மணி நேரம் அடுப்பில் பாலிமரைஸ் செய்யப்பட்டன. சிறுமூளைப் புறணிப் பகுதி தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டு, லைக்கா அல்ட்ராகட்டில் (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம் ஜிஎம்பிஹெச், வியன்னா, ஆஸ்திரியா) 50 நானோமீட்டர் அல்ட்ராதின் பிரிவுகள் வெட்டப்பட்டு, பாலிஸ்டிரீன் படலத்தால் பூசப்பட்ட 2×1 மிமீ செப்பு பிளவு கட்டத்தின் மீது தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. பிரிவுகள் H2O இல் 4% யுரேனைல் அசிடேட் கரைசலில் 10 நிமிடங்கள் வரை கறை படிந்தன, H2O உடன் பல முறை கழுவப்பட்டன, பின்னர் H2O இல் ரெனால்ட்ஸ் லீட் சிட்ரேட்டை 10 நிமிடங்கள் பயன்படுத்தி கழுவப்பட்டன, பின்னர் H2O உடன் பல முறை கழுவப்பட்டன. மைக்ரோகிராஃப்கள் TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 டிஜிட்டல் கேமரா (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ஐப் பயன்படுத்தி Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) என்ற டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி மூலம் எடுக்கப்பட்டன. ஜெர்மனி).
AAV நோயால் பாதிக்கப்பட்ட எலிகளுக்கு, மூளை பிரிக்கப்பட்டு 1 மிமீ தடிமன் கொண்ட சாகிட்டல் பிரிவில் வெட்டப்பட்டது, மேலும் AAV-பாதிக்கப்பட்ட வளையத்தை (அதாவது, mCherry வெளிப்படுத்துதல்) அடையாளம் காண ஒரு ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி சிறுமூளை பரிசோதிக்கப்பட்டது. AAV ஊசி குறைந்தது இரண்டு தொடர்ச்சியான சிறுமூளை வளையங்களில் புர்கின்ஜே செல் அடுக்கின் (அதாவது கிட்டத்தட்ட முழு அடுக்கு) மிக உயர்ந்த கடத்தல் செயல்திறனை விளைவிக்கும் சோதனைகள் மட்டுமே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. AAV-டிரான்ஸ்டு செய்யப்பட்ட வளையம் ஒரே இரவில் பிந்தைய நிலைப்படுத்தலுக்காக மைக்ரோடிஸ்செக்ட் செய்யப்பட்டது (0.1 M கோகோட் பஃபரில் 4% PFA மற்றும் 2.5% குளுடரால்டிஹைடு) மேலும் செயலாக்கப்பட்டது. EPON உட்பொதிப்புக்கு, நிலையான திசு 0.1 M சோடியம் கோகோட் பஃபரில் (Applichem) கழுவப்பட்டு, 0.1 M சோடியம் கோகோட் பஃபரில் (Applichem) 4 மணி நேரத்தில் 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது, பின்னர் 2 மணி நேரம் கழுவப்பட்டது. 0.1 M கோகோமைடு பஃபருடன் 3 முறை செய்யவும். பின்னர், எத்தனால் ஏறுவரிசைத் தொடர்கள் ஒவ்வொரு எத்தனால் கரைசலையும் 4°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்கள் அடைகாத்து, திசுக்களை நீரிழப்பு செய்யப் பயன்படுத்தப்பட்டன. திசு புரோபிலீன் ஆக்சைடுக்கு மாற்றப்பட்டு, 4°C வெப்பநிலையில் EPON (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) இல் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டது. அறை வெப்பநிலையில் புதிய EPON இல் திசுக்களை 2 மணி நேரம் வைக்கவும், பின்னர் அதை 62°C வெப்பநிலையில் 72 மணி நேரம் பதிக்கவும். 70 nm அல்ட்ராதின் பிரிவுகளை வெட்ட அல்ட்ராமைக்ரோடோம் (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ், UC6) மற்றும் வைர கத்தி (டயட்டோம், பீல், சுவிட்சர்லாந்து) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தவும், மேலும் 37°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்கள் 1.5% யுரேனைல் அசிடேட்டுடன் கறைபடுத்தவும், 4 நிமிடங்கள் ஈய சிட்ரேட் கரைசலைக் கொண்டு கறைபடுத்தவும். கேமரா ஒன்வியூ 4K 16-பிட் (கேடன்) மற்றும் டிஜிட்டல் மைக்ரோகிராஃப் மென்பொருள் (கேடன்) பொருத்தப்பட்ட JEM-2100 பிளஸ் டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி (JEOL) ஐப் பயன்படுத்தி எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள் எடுக்கப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்காக, 5000× அல்லது 10,000× டிஜிட்டல் ஜூம் மூலம் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள் பெறப்பட்டன.
மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் உருவவியல் பகுப்பாய்வு. அனைத்து பகுப்பாய்வுகளுக்கும், தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் வரையறைகள் ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி டிஜிட்டல் படங்களில் கைமுறையாக கோடிட்டுக் காட்டப்பட்டன. வெவ்வேறு உருவவியல் அளவுருக்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகின்றன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் அடர்த்தி ஒவ்வொரு செல்லின் மொத்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியை சைட்டோபிளாசம் பகுதியால் (சைட்டோபிளாசம் பகுதி = செல் பகுதி-செல் கரு பகுதி) × 100 ஆல் வகுப்பதன் மூலம் பெறப்பட்ட சதவீதமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் வட்டத்தன்மை [4π (பரப்பளவு/சுற்றளவு 2)] சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் இஸ்டா உருவவியல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு அவற்றின் முக்கிய வடிவங்களின்படி இரண்டு வகைகளாக ("குழாய்" மற்றும் "கொப்புளம்") பிரிக்கப்பட்டது.
ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோம் எண் மற்றும் அடர்த்தி பகுப்பாய்வு. டிஜிட்டல் படத்தில் ஒவ்வொரு ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோமின் வரையறைகளை கைமுறையாக கோடிட்டுக் காட்ட ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும். ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோம் பகுதி, ஒவ்வொரு செல்லின் மொத்த ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோம் கட்டமைப்பு பகுதியை சைட்டோபிளாசம் பகுதியால் (சைட்டோபிளாசம் பகுதி=செல் பகுதி-கரு பகுதி)×100 ஆல் வகுப்பதன் மூலம் கணக்கிடப்படும் சதவீதமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோம்களின் அடர்த்தி, மொத்த எண்ணிக்கையை ஒரு செல்லுக்கு ஆட்டோபாகோசோம்/லைசோசோம் கட்டமைப்புகளின் எண்ணிக்கையால் (சைட்டோபிளாஸ்மிக் பகுதியின் அடிப்படையில்) வகுப்பதன் மூலம் கணக்கிடப்படுகிறது (சைட்டோபிளாஸ்மிக் பகுதி = செல் பகுதி-கரு பகுதி).
கடுமையான பிரித்தல் மற்றும் மாதிரி தயாரிப்புக்கான லேபிளிங். குளுக்கோஸ் லேபிளிங் தேவைப்படும் சோதனைகளுக்கு, கடுமையான மூளை துண்டுகளை முன்-இன்குபேஷன் அறைக்கு மாற்றவும், அதில் நிறைவுற்ற கார்பன் (95% O2 மற்றும் 5% CO2), அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl 2 மற்றும் 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mOsm வரை சரிசெய்யப்பட்டது), இதில் குளுக்கோஸ் 13 C 6- குளுக்கோஸ் மாற்று (யூரிசோடாப், பட்டியல் எண் CLM-1396). பைருவேட் லேபிளிங் தேவைப்படும் சோதனைகளுக்கு, அக்யூட் மூளை துண்டுகளை அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 2.0mM MgCl2 ஐச் சேர்த்து, pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320mOsm வரை சரிசெய்யவும், மேலும் 1mM 1-[1-13C] பைருவேட்டைச் சேர்க்கவும் (யூரிசோடாப், பட்டியல் எண் CLM-1082). பிரிவுகளை 37°C இல் 90 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். பரிசோதனையின் முடிவில், பிரிவுகள் 75 mM அம்மோனியம் கார்பனேட் கொண்ட நீர்வாழ் கரைசலில் (pH 7.4) விரைவாகக் கழுவப்பட்டு, பின்னர் 40:40:20 (v:v:v) அசிட்டோனிட்ரைல் (ACN): மெத்தனால்: தண்ணீரில் ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டன. இந்தப் பிரிவுகள் 30 நிமிடங்கள் பனிக்கட்டியில் அடைகாக்கப்பட்ட பிறகு, மாதிரிகள் 21,000 கிராம் வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 4°C வெப்பநிலையில் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, தெளிவான சூப்பர்நேட்டண்ட் ஒரு ஸ்பீட்வேக் செறிவூட்டியில் உலர்த்தப்பட்டது. இதன் விளைவாக உலர்ந்த வளர்சிதை மாற்றத் துகள் பகுப்பாய்வு வரை -80°C இல் சேமிக்கப்பட்டது.
13 C-லேபிளிடப்பட்ட அமினோ அமிலங்களின் திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி பகுப்பாய்வு. திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS) பகுப்பாய்விற்கு, வளர்சிதை மாற்றத் துகள் 75μl LC-MS தர நீரில் (ஹனிவெல்) மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது. 4°C இல் 5 நிமிடங்களுக்கு 21,000 கிராம் மையவிலக்குக்குப் பிறகு, தெளிவுபடுத்தப்பட்ட சூப்பர்நேட்டன்ட்டின் 20 μl அமினோ அமிலப் பாய்வு பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மீதமுள்ள சாறு உடனடியாக அயனி பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது (கீழே காண்க). முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட பென்சாயில் குளோரைடு வழித்தோன்றல் நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி அமினோ அமில பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (55, 56). முதல் கட்டத்தில், 10μl 100 mM சோடியம் கார்பனேட் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) 20μl மெட்டாபொலைட் சாற்றில் சேர்க்கப்பட்டது, பின்னர் 10μl 2% பென்சாயில் குளோரைடு (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) LC தர ACN இல் சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரி சுருக்கமாக சுழல் செய்யப்பட்டு, பின்னர் 20°C இல் 21,000 கிராம் வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. சுத்தம் செய்யப்பட்ட சூப்பர்நேட்டண்டை கூம்பு கண்ணாடி செருகலுடன் (200 μl அளவு) 2 மில்லி ஆட்டோசாம்ப்ளர் குப்பிக்கு மாற்றவும். மாதிரிகள் Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) உயர்-தெளிவுத்திறன் துல்லிய மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டருடன் (Thermo Fisher Scientific) இணைக்கப்பட்ட Acquity iClass அல்ட்ரா-ஹை பெர்ஃபார்மன்ஸ் LC அமைப்பு (Waters) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்காக, 2μl வழித்தோன்றல் மாதிரி 1.8μm துகள்களைக் கொண்ட 100×1.0 மிமீ உயர்-வலிமை கொண்ட சிலிக்கா T3 நெடுவரிசையில் (Waters) செலுத்தப்பட்டது. ஓட்ட விகிதம் 100μl/நிமிடம், மற்றும் இடையக அமைப்பு இடையக A (10 mM அம்மோனியம் ஃபார்மேட் மற்றும் தண்ணீரில் 0.15% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் இடையக B (ACN) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது. சாய்வு பின்வருமாறு: 0 நிமிடங்களில் 0%B; 0%B. 0 முதல் 0.1 நிமிடங்களில் 0 முதல் 15% B; 0.1 முதல் 0.5 நிமிடங்களில் 15 முதல் 17% B; 0.5 முதல் 14 நிமிடங்களில் 17 முதல் 55% B; 14 முதல் 14.5 நிமிடங்களில் 55 முதல் 70% B; 18 நிமிடங்களில் 14.5 முதல் 70 முதல் 100% B; 18 முதல் 19 நிமிடங்களில் 100% B; 19 முதல் 19.1 நிமிடங்களில் 100 முதல் 0% B; 19.1 முதல் 28 நிமிடங்களில் 0% B (55, 56). QE-HF நிறை நிறமாலை 50 முதல் 750 வரையிலான m/z (நிறை/மின்னூட்ட விகிதம்) நிறை வரம்பில் நேர்மறை அயனியாக்கம் முறையில் செயல்படுகிறது. பயன்படுத்தப்படும் தெளிவுத்திறன் 60,000, மற்றும் பெறப்பட்ட ஆதாயக் கட்டுப்பாடு (AGC) அயனி இலக்கு 3×106, மற்றும் அதிகபட்ச அயனி நேரம் 100 மில்லி விநாடிகள். சூடான எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் (ESI) மூலமானது 3.5 kV தெளிப்பு மின்னழுத்தத்திலும், 250°C தந்துகி வெப்பநிலையிலும், 60 AU (தன்னிச்சையான அலகுகள்) உறை காற்றோட்டத்திலும், 20 AU துணை காற்றோட்டத்திலும் இயங்குகிறது. 250°C. S லென்ஸ் 60 AU ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.
13C என பெயரிடப்பட்ட கரிம அமிலங்களின் அயன் குரோமடோகிராபி-MS பகுப்பாய்வு. மீதமுள்ள வளர்சிதை மாற்ற வீழ்படிவு (55μl) ஒரு QE-HF நிறை நிறமாலை அளவியுடன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) இணைக்கப்பட்ட டையோனெக்ஸ் அயன் குரோமடோகிராபி அமைப்பை (ICS 5000+, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, 5μl வளர்சிதை மாற்ற சாறு HPLC (2 மிமீ×250 மிமீ, துகள் அளவு 4μm, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பொருத்தப்பட்ட டையோனெக்ஸ் அயன் பேக் AS11-HC நெடுவரிசையில் 1 நிரப்புதல் விகிதத்துடன் புஷ்-இன் பகுதி லூப் பயன்முறையில் செலுத்தப்பட்டது. ) டையோனெக்ஸ் அயன் பேக் AG11-HC பாதுகாப்பு நெடுவரிசை (2 மிமீ x 50 மிமீ, 4μm, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்). நெடுவரிசை வெப்பநிலை 30°C இல் பராமரிக்கப்படுகிறது, மேலும் ஆட்டோசாம்ப்ளர் 6°C ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது. டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட தண்ணீருடன் வழங்கப்பட்ட பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடு கார்ட்ரிட்ஜைப் பயன்படுத்தி எலுவென்ட் ஜெனரேட்டர் மூலம் பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடு சாய்வை உருவாக்குகிறது. 380μl/நிமிட ஓட்ட விகிதத்தில் வளர்சிதை மாற்றங்களைப் பிரித்தல், பின்வரும் சாய்வைப் பயன்படுத்துகிறது: 0 முதல் 3 நிமிடங்கள், 10 mM KOH; 3 முதல் 12 நிமிடங்கள், 10 முதல் 50 mM KOH; 12 முதல் 19 நிமிடங்கள், 50 முதல் 100 mM KOH; 19 முதல் 21 நிமிடங்கள், 100 mM KOH; 21 முதல் 21.5 நிமிடங்கள், 100 முதல் 10 mM KOH. நெடுவரிசை 8.5 நிமிடங்களுக்கு 10 mM KOH இன் கீழ் மீண்டும் சமநிலைப்படுத்தப்பட்டது.
நீக்கப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்கள் நெடுவரிசைக்குப் பிறகு 150μl/நிமிடம் ஐசோபுரோபனால் துணை நீரோட்டத்துடன் இணைக்கப்பட்டு, பின்னர் எதிர்மறை அயனியாக்கம் பயன்முறையில் இயங்கும் உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிறை நிறமாலைக்கு அனுப்பப்படுகின்றன. MS, m/z 50 முதல் 750 வரையிலான நிறை வரம்பை 60,000 தெளிவுத்திறனுடன் கண்காணித்து வருகிறது. AGC 1×106 ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் அதிகபட்ச அயனி நேரம் 100 ms இல் வைக்கப்பட்டுள்ளது. சூடான ESI மூலமானது 3.5 kV இன் ஸ்ப்ரே மின்னழுத்தத்தில் இயக்கப்பட்டது. அயனி மூலத்தின் பிற அமைப்புகள் பின்வருமாறு: தந்துகி வெப்பநிலை 275°C; உறை வாயு ஓட்டம், 60 AU; துணை வாயு ஓட்டம், 300°C இல் 20 AU, மற்றும் S லென்ஸ் அமைப்பு 60 AU ஆக உள்ளது.
13C என பெயரிடப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களின் தரவு பகுப்பாய்வு. ஐசோடோப்பு விகிதத்தின் தரவு பகுப்பாய்விற்கு டிரேஸ்ஃபைண்டர் மென்பொருளை (பதிப்பு 4.2, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தவும். ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் அடையாளமும் நம்பகமான குறிப்பு சேர்மத்தால் சரிபார்க்கப்பட்டு சுயாதீனமாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஐசோடோப்பு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வைச் செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு 13C ஐசோடோப்பின் (Mn) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அயன் குரோமடோகிராமின் (XIC) பரப்பளவு [M + H] + இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டது, இங்கு n என்பது இலக்கு சேர்மத்தின் கார்பன் எண், அமினோ அமிலங்களை பகுப்பாய்வு செய்யப் பயன்படுகிறது அல்லது [MH] + அனான்களை பகுப்பாய்வு செய்யப் பயன்படுகிறது. XIC இன் நிறை துல்லியம் ஒரு மில்லியனுக்கு ஐந்து பகுதிகளுக்கும் குறைவாக உள்ளது, மேலும் RT இன் துல்லியம் 0.05 நிமிடங்கள் ஆகும். ஒவ்வொரு கண்டறியப்பட்ட ஐசோடோப்பின் விகிதத்தையும் தொடர்புடைய சேர்மத்தின் அனைத்து ஐசோடோப்புகளின் கூட்டுத்தொகையையும் கணக்கிடுவதன் மூலம் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. இந்த விகிதங்கள் ஒவ்வொரு ஐசோடோப்பிற்கும் சதவீத மதிப்புகளாக வழங்கப்படுகின்றன, மேலும் முடிவுகள் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி மோலார் சதவீத செறிவூட்டல் (MPE) ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன (42).
உறைந்த நியூரான் துகள் பனி-குளிர் 80% மெத்தனால் (v/v) இல் ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டு, சுழல் செய்யப்பட்டு, -20°C இல் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. மாதிரியை மீண்டும் சுழற்றி +4°C இல் 30 நிமிடங்கள் கிளறவும். மாதிரி 21,000 கிராம் அளவில் 4°C இல் 5 நிமிடங்கள் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது, பின்னர் விளைந்த சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டு 25°C இல் ஸ்பீட்வேக் செறிவூட்டியைப் பயன்படுத்தி அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்விற்காக உலர்த்தப்பட்டது. மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி, வரிசைப்படுத்தப்பட்ட செல்களின் அமினோ அமிலங்களில் LC-MS பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. டிரேஸ்ஃபைண்டரைப் பயன்படுத்தி (பதிப்பு 4.2, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்), ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் மோனோஐசோடோபிக் வெகுஜனத்தைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. முன் செயலாக்க கோர் மென்பொருள் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி வளர்சிதை மாற்றத் தரவின் அளவு இயல்பாக்கம் செய்யப்பட்டது (57).
துண்டு தயாரிப்பு. எலி விரைவாக கார்பன் டை ஆக்சைடுடன் மயக்க மருந்து செய்யப்பட்டு தலை துண்டிக்கப்பட்டது, மூளை விரைவாக மண்டை ஓட்டிலிருந்து அகற்றப்பட்டது, மேலும் பனி நிரப்பப்பட்ட அதிர்வுறும் கத்தி (HM-650 V, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்டோர்ஃப், ஜெர்மனி) அதை 300 முதல் 375 μm சாகிட்டல் பிரிவுகளாக வெட்ட பயன்படுத்தப்பட்டது. குளிர் கார்பன் வாயுவாக்கம் (95% O2 மற்றும் 5% CO2) குறைந்த Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 1.0 mM CaCl2 மற்றும் 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 330 mOsm வரை சரிசெய்யப்பட்டது. பெறப்பட்ட மூளைத் துண்டுகளை அதிக Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர், 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-குளுக்கோஸ், 4.0 mM CaCl2 மற்றும் mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 மற்றும் 310 முதல் 320 mOsm) கொண்ட அறைக்கு மாற்றவும். துண்டுகளை 20 முதல் 30 நிமிடங்கள் சேமித்து வைக்கவும், இதனால் பதிவு செய்வதற்கு முன்பு அவற்றை மீட்டெடுக்க முடியும்.
பதிவு செய்தல். அனைத்து பதிவுகளுக்கும் ஒரு நிலையான பதிவு அறை மற்றும் 20x நீர் மூழ்கும் புறநிலை லென்ஸ் (சயின்டிஃபிகா) பொருத்தப்பட்ட ஒரு நுண்ணோக்கி நிலை பயன்படுத்தப்பட்டது. புர்கின்ஜே செல்கள் (i) உடல் அளவு, (ii) சிறுமூளையின் உடற்கூறியல் இடம் மற்றும் (iii) ஃப்ளோரசன்ட் mtYFP ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவின் வெளிப்பாடு ஆகியவற்றால் அடையாளம் காணப்பட்டன. 5 முதல் 11 மெகாஹோம்கள் முனை எதிர்ப்பைக் கொண்ட பேட்ச் பைப்பெட் ஒரு போரோசிலிகேட் கண்ணாடி தந்துகி (GB150-10, 0.86 மிமீ×1.5 மிமீ×100 மிமீ, சயின்ஸ் ப்ராடக்ட்ஸ், ஹோஃப்ஹெய்ம், ஜெர்மனி) மற்றும் ஒரு கிடைமட்ட பைப்பெட் இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ் (P-1000, சுட்டர்), நோவாடோ, CA) மூலம் வெளியே இழுக்கப்படுகிறது. அனைத்து பதிவுகளும் ELC-03XS npi பேட்ச் கிளாம்ப் பெருக்கி (npi எலக்ட்ரானிக் GmbH, Tam, ஜெர்மனி) மூலம் செய்யப்பட்டன, இது மென்பொருள் சிக்னல் (பதிப்பு 6.0, கேம்பிரிட்ஜ் எலக்ட்ரானிக், கேம்பிரிட்ஜ், UK) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது. சோதனை 12.5 kHz மாதிரி விகிதத்தில் பதிவு செய்யப்பட்டது. இந்த சமிக்ஞை முறையே 1.3 மற்றும் 10 kHz கட்ஆஃப் அதிர்வெண்களைக் கொண்ட இரண்டு குறுகிய-பாஸ் பெசல் வடிப்பான்கள் மூலம் வடிகட்டப்படுகிறது. சவ்வு மற்றும் பைப்பட்டின் கொள்ளளவு பெருக்கியைப் பயன்படுத்தி இழப்பீட்டு சுற்று மூலம் ஈடுசெய்யப்படுகிறது. அனைத்து சோதனைகளும் ஓர்கா-ஃப்ளாஷ் 4.0 கேமராவின் (ஹமாமட்சு, கெர்டன், ஜெர்மனி) கட்டுப்பாட்டின் கீழ் செய்யப்பட்டன, இது ஹோகாவோ மென்பொருளால் (பதிப்பு 2.8, ஹமாமட்சு, கெர்டன், ஜெர்மனி) கட்டுப்படுத்தப்பட்டது.
வழக்கமான முழு செல் உள்ளமைவு மற்றும் பகுப்பாய்வு. பதிவு செய்வதற்கு உடனடியாக முன், பின்வரும் பொருட்களைக் கொண்ட உள் கரைசலுடன் பைப்பெட்டை நிரப்பவும்: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM பொட்டாசியம் குளுக்கோனேட், 10.0 mM ஹெப்ஸ், 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM குவானோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (GTP) (Na) மற்றும் 10.0 mM கிரியேட்டினின் பாஸ்பேட் ஆகியவை pH 7.25 ஆக சரிசெய்யப்பட்டன, மேலும் சவ்வூடுபரவல் அழுத்தம் 290 mOsm (சுக்ரோஸ்) ஆக இருந்தது. சவ்வை உடைக்க 0 pA விசையைப் பயன்படுத்திய உடனேயே, ஓய்வு சவ்வு திறன் அளவிடப்பட்டது. உள்ளீட்டு எதிர்ப்பு -40, -30, -20, மற்றும் -10 pA இன் ஹைப்பர்போலரைஸ் செய்யப்பட்ட மின்னோட்டங்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் அளவிடப்படுகிறது. மின்னழுத்த பதிலின் அளவை அளவிடவும், உள்ளீட்டு எதிர்ப்பைக் கணக்கிட ஓம் விதியைப் பயன்படுத்தவும். ஒரு மின்னழுத்த கிளாம்பில் 5 நிமிடங்களுக்கு தன்னிச்சையான செயல்பாடு பதிவு செய்யப்பட்டது, மேலும் sPSC ஐ இகோர் ப்ரோவில் (பதிப்பு 32 7.01, வேவ்மெட்ரிக்ஸ், லேக் ஓஸ்வேகோ, ஓரிகான், அமெரிக்கா) அரை தானியங்கி அங்கீகார ஸ்கிரிப்டைப் பயன்படுத்தி அடையாளம் கண்டு அளவிடப்பட்டது. IV வளைவு மற்றும் நிலையான-நிலை மின்னோட்டம் பேட்டரியை வெவ்வேறு ஆற்றல்களில் (-110 mV இலிருந்து தொடங்கி) இறுக்கி, 5 mV படிகளில் மின்னழுத்தத்தை அதிகரிப்பதன் மூலம் அளவிடப்படுகிறது. டிபோலரைசிங் மின்னோட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் AP இன் உற்பத்தி சோதிக்கப்பட்டது. டிபோலரைசிங் மின்னோட்ட துடிப்பைப் பயன்படுத்தும்போது -70 mV இல் செல்லை இறுக்கவும். ஒவ்வொரு பதிவு அலகின் படி அளவையும் தனித்தனியாக சரிசெய்யவும் (10 முதல் 60 pA வரை). அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணை ஏற்படுத்தும் பல்ஸ் ஸ்பைக்குகளை கைமுறையாக எண்ணுவதன் மூலம் அதிகபட்ச AP அதிர்வெண்ணைக் கணக்கிடுங்கள். ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட APகளை முதலில் தூண்டும் டிபோலரைசேஷன் பல்ஸின் இரண்டாவது வழித்தோன்றலைப் பயன்படுத்தி AP வரம்பு பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது.
துளையிடப்பட்ட பேட்ச் உள்ளமைவு மற்றும் பகுப்பாய்வு. நிலையான நெறிமுறைகளைப் பயன்படுத்தி துளையிடப்பட்ட பேட்ச் பதிவைச் செய்யுங்கள். பின்வரும் பொருட்கள் இல்லாத ATP- மற்றும் GTP இல்லாத பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்தவும்: 128 mM குளுக்கோனேட் K, 10 mM KCl, 10 mM ஹெப்ஸ், 0.1 mM EGTA மற்றும் 2 mM MgCl2, மற்றும் pH 7.2 க்கு சரிசெய்யவும் (KOH ஐப் பயன்படுத்தி). செல் சவ்வின் கட்டுப்பாடற்ற ஊடுருவலைத் தடுக்க ATP மற்றும் GTP ஆகியவை உள்செல்லுலார் கரைசலில் இருந்து விலக்கப்படுகின்றன. பஞ்ச் செய்யப்பட்ட பேட்ச் பதிவைப் பெற பேட்ச் பைப்பெட் ஒரு ஆம்போடெரிசின் கொண்ட உள் கரைசலால் (தோராயமாக 200 முதல் 250μg/ml; G4888, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) நிரப்பப்படுகிறது. ஆம்போடெரிசின் டைமெத்தில் சல்பாக்சைடில் கரைக்கப்பட்டது (இறுதி செறிவு: 0.1 முதல் 0.3%; DMSO; D8418, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்). பயன்படுத்தப்பட்ட DMSO இன் செறிவு ஆய்வு செய்யப்பட்ட நியூரான்களில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவை ஏற்படுத்தவில்லை. பஞ்சிங் செயல்பாட்டின் போது, ​​சேனல் எதிர்ப்பு (Ra) தொடர்ந்து கண்காணிக்கப்பட்டது, மேலும் Ra மற்றும் AP இன் வீச்சு நிலைப்படுத்தப்பட்ட பிறகு (20-40 நிமிடங்கள்) சோதனை தொடங்கப்பட்டது. தன்னிச்சையான செயல்பாடு ஒரு மின்னழுத்தம் மற்றும்/அல்லது மின்னோட்டக் கவ்வியில் 2 முதல் 5 நிமிடங்கள் வரை அளவிடப்படுகிறது. இகோர் ப்ரோ (பதிப்பு 7.05.2, வேவ்மெட்ரிக்ஸ், அமெரிக்கா), எக்செல் (பதிப்பு 2010, மைக்ரோசாஃப்ட் கார்ப்பரேஷன், ரெட்மண்ட், அமெரிக்கா) மற்றும் கிராப்பேட் பிரிசம் (பதிப்பு 8.1.2, கிராப்பேட் மென்பொருள் இன்க்., லா ஜொல்லா, CA) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. தன்னிச்சையான AP களை அடையாளம் காண, இகோர்ப்ரோவின் நியூரோமேடிக் v3.0c செருகுநிரல் பயன்படுத்தப்படுகிறது. கொடுக்கப்பட்ட வரம்பைப் பயன்படுத்தி AP களை தானாகவே அடையாளம் காணவும், இது ஒவ்வொரு பதிவுக்கும் தனித்தனியாக சரிசெய்யப்படுகிறது. ஸ்பைக் இடைவெளியைப் பயன்படுத்தி, அதிகபட்ச உடனடி ஸ்பைக் அதிர்வெண் மற்றும் சராசரி ஸ்பைக் அதிர்வெண் மூலம் ஸ்பைக் அதிர்வெண்ணைத் தீர்மானிக்கவும்.
PN தனிமைப்படுத்தல். முன்னர் வெளியிடப்பட்ட நெறிமுறைக்கு ஏற்ப, ஒரு குறிப்பிட்ட கட்டத்தில் (58) எலி சிறுமூளையிலிருந்து PNகள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, சிறுமூளைப் பிரிக்கப்பட்டு பனி-குளிர் விலகல் ஊடகத்தில் [HBSS Ca2+ மற்றும் Mg2+ இல்லாமல், 20 mM குளுக்கோஸ், பென்சிலின் (50 U/ml) மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 mg/ml) உடன் கூடுதலாக], பின்னர் பாப்பேன் [HBSS, 1-சிஸ்டைன்·HCl (1 mg/ml (1 mg/ml), பாப்பேன் (16 U/ml) மற்றும் டீஆக்ஸிரைபோனூக்லீஸ் I (DNase I; 0.1 mg/ml) உடன் கூடுதலாக] 30°C இல் 30 நிமிடங்கள் சிகிச்சையளிக்கவும். முதலில் திசுக்களை அறை வெப்பநிலையில் முட்டை சளி (10 மி.கி/மிலி), BSA (10 மி.கி/மிலி) மற்றும் DNase (0.1 மி.கி/மிலி) கொண்ட HBSS ஊடகத்தில் கழுவி நொதி செரிமானத்தைத் தடுக்கவும், பின்னர் 20 மி.மீ குளுக்கோஸ் கொண்ட HBSS ஊடகத்தில் HBSS இல் மெதுவாக அரைத்து, பென்சிலின் (50 U/மிலி), ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 மி.கி/மிலி) மற்றும் DNase (0.1 மி.கி/மிலி) ஆகியவை ஒற்றை செல்களை வெளியிடுகின்றன. இதன் விளைவாக வரும் செல் இடைநீக்கம் 70μm செல் வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டது, பின்னர் செல்கள் மையவிலக்கு (1110 rpm, 5 நிமிடங்கள், 4°C) மூலம் துளையிடப்பட்டு வரிசையாக்க ஊடகத்தில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டன [HBSS, 20 mM குளுக்கோஸ், 20% கரு போவின் உடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது) சீரம், பென்சிலின் (50 U/மிலி) மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (0.05 மி.கி/மிலி)]; ப்ராபிடியம் அயோடைடுடன் செல் நம்பகத்தன்மையை மதிப்பீடு செய்து செல் அடர்த்தியை 1×106 முதல் 2×106 செல்கள்/மிலி வரை சரிசெய்யவும். ஓட்ட சைட்டோமெட்ரிக்கு முன், இடைநீக்கம் 50 μm செல் வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டது.
ஓட்ட சைட்டோமீட்டர். FACSAria III இயந்திரம் (BD Biosciences) மற்றும் FACSDiva மென்பொருள் (BD Biosciences, பதிப்பு 8.0.1) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி செல் வரிசைப்படுத்தல் 4°C இல் செய்யப்பட்டது. செல் இடைநீக்கம் 100 μm முனையைப் பயன்படுத்தி 20 psi அழுத்தத்தின் கீழ் ~2800 நிகழ்வுகள்/வினாடி என்ற விகிதத்தில் வரிசைப்படுத்தப்பட்டது. பாரம்பரிய கேட்டிங் அளவுகோல்கள் (செல் அளவு, பைமோடல் பாகுபாடு மற்றும் சிதறல் பண்புகள்) மற்ற செல் வகைகளிலிருந்து PN இன் சரியான தனிமைப்படுத்தலை உறுதி செய்ய முடியாது என்பதால், கேட்டிங் உத்தி mitoYFP+ ​​மற்றும் கட்டுப்பாட்டு mitoYFP − எலிகளில் YFP தீவிரம் மற்றும் ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸின் நேரடி ஒப்பீட்டின் அடிப்படையில் அமைக்கப்படுகிறது. 488 nm லேசர் கோடுடன் மாதிரியை கதிர்வீச்சு செய்வதன் மூலம் YFP உற்சாகப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் 530/30 nm பேண்ட் பாஸ் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி சமிக்ஞை கண்டறியப்படுகிறது. mitoYFP+ ​​எலிகளில், Rosa26-mitoYFP ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவின் ஒப்பீட்டு வலிமையும் நரம்பியல் உடல் மற்றும் ஆக்சன் துண்டுகளை வேறுபடுத்துவதற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. 7-AAD ஆனது 561 nm மஞ்சள் லேசர் மூலம் தூண்டப்பட்டு, இறந்த செல்களை விலக்க 675/20 nm பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி மூலம் கண்டறியப்பட்டது. அதே நேரத்தில் ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளைப் பிரிக்க, செல் இடைநீக்கம் ACSA-2-APC உடன் சாயமிடப்பட்டது, பின்னர் மாதிரி 640 nm லேசர் கோடுடன் கதிர்வீச்சு செய்யப்பட்டது, மேலும் சிக்னலைக் கண்டறிய 660/20 nm பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி பயன்படுத்தப்பட்டது.
சேகரிக்கப்பட்ட செல்கள் மையவிலக்கு முறை (1110 rpm, 5 நிமிடங்கள், 4°C) மூலம் துளையிடப்பட்டு, பயன்பாடு வரை -80°C இல் சேமிக்கப்பட்டன. Mfn2cKO எலிகளும் அவற்றின் குப்பை குட்டிகளும் நடைமுறை மாறுபாட்டைக் குறைக்க ஒரே நாளில் வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. ஃப்ளோஜோ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி FACS தரவு விளக்கக்காட்சி மற்றும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (ஃப்ளோஜோ எல்எல்சி, ஆஷ்லேண்ட், ஓரிகான், அமெரிக்கா).
மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி (59), வரிசைப்படுத்தப்பட்ட நியூரான்களிலிருந்து டிஎன்ஏவை அடுத்தடுத்த mtDNA அளவீட்டிற்காக தனிமைப்படுத்த நிகழ்நேர PCR பயன்படுத்தப்படுகிறது. வெவ்வேறு எண்ணிக்கையிலான செல்களில் qPCR ஐ இயக்குவதன் மூலம் நேரியல்பு மற்றும் வரம்பு உணர்திறன் ஆரம்பத்தில் சோதிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 மற்றும் புரோட்டினேஸ் K (200 ng/ml) ஆகியவற்றைக் கொண்ட லிசிஸ் பஃபரில் 300 PN ஐ சேகரித்து 55°C 120 நிமிடங்களில் அடைகாக்கவும். புரதனேஸ் K இன் முழுமையான செயலிழப்பு உறுதி செய்வதற்காக செல்கள் 95°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு மேலும் அடைகாக்கப்பட்டன. mt-Nd1 க்கு குறிப்பிட்ட TaqMan ஆய்வு (தெர்மோ ஃபிஷர்) ஐப் பயன்படுத்தி, mtDNA 7900HT நிகழ்நேர PCR அமைப்பில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) அரை-அளவு PCR மூலம் அளவிடப்பட்டது. அறிவியல், பட்டியல் எண் Mm04225274_s1), mt-Nd6 (தெர்மோ ஃபிஷர் அறிவியல், பட்டியல் எண் AIVI3E8) மற்றும் 18S (தெர்மோ ஃபிஷர் அறிவியல், பட்டியல் எண் Hs99999901_s1) மரபணுக்கள்.
புரோட்டியோம் மாதிரி தயாரிப்பு. கரைசலை 95°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்கள் சூடாக்கி, லிசிஸ் பஃபரில் [6 M குவானிடைன் குளோரைடு, 10 mM ட்ரிஸ்(2-கார்பாக்சிதைல்) பாஸ்பைன் ஹைட்ரோகுளோரைடு, 10 mM குளோரோஅசெட்டமைடு மற்றும் 100 mM ட்ரிஸ்-லைஸ் உறைந்த நியூரான் துகள்கள் HCl இல்]. பயோரப்டரில் (டயஜெனோட்) 10 நிமிடங்கள் (30 வினாடிகள் துடிப்பு / 30 வினாடிகள் இடைநிறுத்த காலம்). மாதிரி 20 mM ட்ரிஸ்-HCl (pH 8.0) இல் 1:10 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தப்பட்டு, 300 ng ட்ரிப்சின் தங்கத்துடன் (ப்ரோமேகா) கலக்கப்பட்டு, முழுமையான செரிமானத்தை அடைய 37°C இல் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டது. இரண்டாவது நாளில், மாதிரி 20,000 கிராம் அளவில் 20 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. சூப்பர்நேட்டண்ட் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்துடன் நீர்த்தப்பட்டது, மேலும் கரைசல் சுயமாக தயாரிக்கப்பட்ட ஸ்டேஜ்டிப்ஸுடன் உப்பு நீக்கப்பட்டது. மாதிரி 45°C வெப்பநிலையில் SpeedVac கருவியில் (Eppendorf concentrator plus 5305) உலர்த்தப்பட்டது, பின்னர் பெப்டைடு 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் தொங்கவிடப்பட்டது. அனைத்து மாதிரிகளும் ஒரே நேரத்தில் ஒரே நபரால் தயாரிக்கப்பட்டன. ஆஸ்ட்ரோசைட் மாதிரிகளை பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக, 4 μg உப்பு நீக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் 1:20 என்ற பெப்டைடு முதல் TMT வினையூக்கி விகிதத்துடன் டேன்டெம் மாஸ் டேக் (TMT10plex, பட்டியல் எண் 90110, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மூலம் லேபிளிடப்பட்டன. TMT லேபிளிங்கிற்கு, 70 μl நீரற்ற ACN இல் 0.8 மி.கி TMT வினையூக்கி மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது, மேலும் உலர்ந்த பெப்டைடு 0.1 M TEAB (ட்ரைஎதிலமோனியம் பைகார்பனேட்) இன் 9 μl ஆக மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது, இதில் ACN இல் 7 μl TMT வினையூக்கி சேர்க்கப்பட்டது. செறிவு 43.75% ஆகும். 60 நிமிடங்கள் அடைகாத்த பிறகு, வினை 2 μl 5% ஹைட்ராக்ஸிலமைன் மூலம் தணிக்கப்பட்டது. பெயரிடப்பட்ட பெப்டைடுகள் சேகரிக்கப்பட்டு, உலர்த்தப்பட்டு, 200μl 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் (FA) மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, இரண்டாகப் பிரிக்கப்பட்டு, பின்னர் சுயமாக தயாரிக்கப்பட்ட ஸ்டேஜ்டிப்ஸைப் பயன்படுத்தி உப்பு நீக்கப்பட்டது. அல்டிமேட் 3000 அல்ட்ரா உயர் செயல்திறன் திரவ குரோமடோகிராஃப் (அல்டிமேட் 3000 அல்ட்ரா உயர் செயல்திறன் திரவ குரோமடோகிராஃப்) ஐப் பயன்படுத்தி, இரண்டு பகுதிகளிலும் ஒன்று 1 மிமீ x 150 மிமீ அக்விட்டி குரோமடோகிராஃபிக் நெடுவரிசையில் 130Å1.7μm C18 துகள்களால் நிரப்பப்பட்டது (வாட்டர்ஸ், பட்டியல் எண். SKU: 186006935). தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்). 30μl/நிமிட ஓட்ட விகிதத்தில் பெப்டைடுகளைப் பிரிக்கவும், 1% முதல் 50% பஃபர் B வரை 85 நிமிடங்களுக்கு 96 நிமிடங்கள் படிநிலை சாய்வுடன், 50% முதல் 95% பஃபர் B வரை 3 நிமிடங்களுக்கு, பின்னர் 95% பஃபர் B க்கு 8 நிமிடங்களுக்கு; தாங்கல் A 5% ACN மற்றும் 10 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட் (ABC), மற்றும் தாங்கல் B 80% ACN மற்றும் 10 mM ABC ஆகும். ஒவ்வொரு 3 நிமிடங்களுக்கும் பின்னங்களைச் சேகரித்து அவற்றை இரண்டு குழுக்களாக (1 + 17, 2 + 18, முதலியன) இணைத்து ஒரு வெற்றிட மையவிலக்கில் உலர்த்தவும்.
LC-MS/MS பகுப்பாய்வு. நிறை நிறமாலை அளவீட்டிற்காக, பெப்டைடுகள் (எண் r119.aq) 25 செ.மீ., 75 μm உள் விட்டம் கொண்ட PicoFrit பகுப்பாய்வு நெடுவரிசையில் (புதிய புறநிலை லென்ஸ், பகுதி எண் PF7508250) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ஊடகம் (டாக்டர். மைஷ், மேட்), யூஸ் EASY-nLC 1200 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஜெர்மனி) பொருத்தப்பட்ட பிரிக்கப்பட்டன. நெடுவரிசை 50°C இல் பராமரிக்கப்பட்டது. A மற்றும் B இடையகங்கள் முறையே தண்ணீரில் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலமாகவும், 80% ACN இல் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலமாகவும் உள்ளன. பெப்டைடுகள் 65 நிமிடங்களுக்கு 6% முதல் 31% பஃபர் B வரையிலும், 200 nl/min சாய்வுடன் 5 நிமிடங்களுக்கு 31% முதல் 50% பஃபர் B வரையிலும் பிரிக்கப்பட்டன. நீக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் ஒரு ஆர்பிட்ராப் ஃப்யூஷன் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பெப்டைட் முன்னோடி m/z அளவீடு 350 முதல் 1500 மீ/z வரம்பில் 120,000 தெளிவுத்திறனுடன் செய்யப்படுகிறது. 27% இயல்பாக்கப்பட்ட மோதல் ஆற்றலைப் பயன்படுத்தி, 2 முதல் 6 வரை சார்ஜ் நிலை கொண்ட வலிமையான முன்னோடி உயர் ஆற்றல் C பொறி விலகல் (HCD) பிளவுக்காகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. சுழற்சி நேரம் 1 வினாடிக்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது. பெப்டைட் துண்டின் m/z மதிப்பு அயன் பொறியில் 5×104 என்ற மிகச்சிறிய AGC இலக்கையும் 86 எம்எஸ் அதிகபட்ச ஊசி நேரத்தையும் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. துண்டு துண்டாகப் பிரிக்கப்பட்ட பிறகு, முன்னோடி 45 வினாடிகளுக்கு டைனமிக் விலக்கு பட்டியலில் வைக்கப்பட்டது. TMT-லேபிளிடப்பட்ட பெப்டைடுகள் 50 செ.மீ., 75 μm Acclaim PepMap நெடுவரிசையில் (Thermo Fisher Scientific, பட்டியல் எண் 164942) பிரிக்கப்பட்டன, மேலும் இடம்பெயர்வு நிறமாலை உயர்-புல சமச்சீரற்ற அலைவடிவ அயனிகள் (FAIMS) உபகரணங்களுடன் பொருத்தப்பட்ட ஒரு Orbitrap Lumos Tribrid நிறை நிறமாலைமீட்டரில் (Thermo Fisher Scientific) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (Thermo Fisher Scientific) −50 மற்றும் −70 V இன் இரண்டு இழப்பீட்டு மின்னழுத்தங்களில் இயங்குகிறது. ஒத்திசைவு முன்னோடியின் அடிப்படையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட MS3 TMT அறிக்கை அயன் சிக்னல் அளவீட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. பெப்டைடு பிரிப்பு EASY-nLC 1200 இல் மேற்கொள்ளப்பட்டது, 90% நேரியல் சாய்வு நீக்கத்தைப் பயன்படுத்தி, 6% முதல் 31% வரை இடையக செறிவுடன்; இடையக A 0.1% FA ஆகவும், இடையக B 0.1% FA மற்றும் 80% ACN ஆகவும் இருந்தது. பகுப்பாய்வு நெடுவரிசை 50°C இல் இயக்கப்படுகிறது. FAIMS இழப்பீட்டு மின்னழுத்தத்தின்படி அசல் கோப்பைப் பிரிக்க FreeStyle (பதிப்பு 1.6, Thermo Fisher Scientific) ஐப் பயன்படுத்தவும்.
புரத அடையாளம் மற்றும் அளவீடு. ஒருங்கிணைந்த ஆண்ட்ரோமெடா தேடுபொறியைப் பயன்படுத்தி, அசல் தரவு MaxQuant பதிப்பு 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. Aequorea victoria இலிருந்து பெறப்பட்ட Cre recombinase மற்றும் YFP வரிசைகளுக்கு கூடுதலாக, பெப்டைட் துண்டு நிறமாலை மவுஸ் குறிப்பு புரோட்டியோமின் (Proteome ID UP000000589, மே 2017 இல் UniProt இலிருந்து பதிவிறக்கம் செய்யப்பட்டது) நியமன வரிசை மற்றும் ஐசோஃபார்ம் வரிசைக்காகத் தேடப்பட்டது. மெத்தியோனைன் ஆக்சிஜனேற்றம் மற்றும் புரத N-முனைய அசிடைலேஷன் மாறி மாற்றங்களாக அமைக்கப்பட்டன; சிஸ்டைன் கார்பமாயில் மெத்திலேஷன் நிலையான மாற்றங்களாக அமைக்கப்பட்டது. செரிமான அளவுருக்கள் "குறிப்பிட்ட தன்மை" மற்றும் "டிரிப்சின்/பி" என அமைக்கப்பட்டுள்ளன. புரத அடையாளம் காண பயன்படுத்தப்படும் பெப்டைடுகள் மற்றும் ரேஸர் பெப்டைட்களின் குறைந்தபட்ச எண்ணிக்கை 1; தனித்துவமான பெப்டைட்களின் குறைந்தபட்ச எண்ணிக்கை 0. பெப்டைட் வரைபட பொருத்தத்தின் நிபந்தனைகளின் கீழ், புரத அடையாள விகிதம் 0.01 ஆகும். "இரண்டாவது பெப்டைட்" விருப்பம் இயக்கப்பட்டது. வெவ்வேறு அசல் கோப்புகளுக்கு இடையில் வெற்றிகரமான அடையாளங்களை மாற்ற "ரன்களுக்கு இடையே பொருத்தம்" விருப்பத்தைப் பயன்படுத்தவும். லேபிள் இல்லாத அளவீட்டுக்கு (LFQ) LFQ குறைந்தபட்ச விகித எண்ணிக்கை 1 ஐப் பயன்படுத்தவும் (60). ஒவ்வொரு நேரப் புள்ளியிலும் குறைந்தபட்சம் ஒரு மரபணு வகை குழுவில் குறைந்தது இரண்டு செல்லுபடியாகும் மதிப்புகளுக்கு LFQ தீவிரம் வடிகட்டப்படுகிறது, மேலும் அகலம் கொண்ட ஒரு சாதாரண விநியோகத்திலிருந்து எக்ஸ்ட்ராபோலேட் செய்யப்படுகிறது. 0.3 மற்றும் கீழே நகர்த்தவும் 1.8. LFQ முடிவுகளை பகுப்பாய்வு செய்ய பெர்சியஸ் கம்ப்யூட்டிங் தளம் (https://maxquant.net/perseus/) மற்றும் R (https://r-project.org/) ஐப் பயன்படுத்தவும். லிம்மா மென்பொருள் தொகுப்பிலிருந்து இருவழி மிதமான t சோதனை வேறுபட்ட வெளிப்பாடு பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally மற்றும் pheatmap ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஆய்வுத் தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. TMT- அடிப்படையிலான புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவு MaxQuant பதிப்பு 1.6.10.43 ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. செப்டம்பர் 2018 இல் பதிவிறக்கம் செய்யப்பட்ட UniProt இன் மனித புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தளத்திலிருந்து மூல புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவைத் தேடுங்கள். பகுப்பாய்வில் உற்பத்தியாளரால் வழங்கப்பட்ட ஐசோடோப்பு தூய்மை திருத்தும் காரணி அடங்கும். வேறுபட்ட வெளிப்பாடு பகுப்பாய்விற்கு R இல் லிம்மாவைப் பயன்படுத்தவும். அசல் தரவு, தரவுத்தள தேடல் முடிவுகள் மற்றும் தரவு பகுப்பாய்வு பணிப்பாய்வு மற்றும் முடிவுகள் அனைத்தும் PRIDE கூட்டாளர் களஞ்சியத்தின் மூலம் PXD019690 என்ற தரவு தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியுடன் ProteomeXchange கூட்டணியில் சேமிக்கப்படுகின்றன.
செயல்பாட்டு குறிப்புகள் பகுப்பாய்வை வளப்படுத்துகின்றன. 8 வாரங்களில் தரவுத் தொகுப்பின் செயல்பாட்டு குறிப்பு விதிமுறைகளின் செழுமையைத் தீர்மானிக்க புத்திசாலித்தன பாதை பகுப்பாய்வு (QIAGEN) கருவி பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 1). சுருக்கமாக, LC-MS/MS (டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி) தரவு பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட அளவு புரதப் பட்டியல் பின்வரும் வடிகட்டி அளவுகோல்களுடன் பயன்படுத்தப்படுகிறது: மஸ் தசை இனங்கள் மற்றும் பின்னணியாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது, மேலும் வகை பெஞ்சாமினியால் 0.05 அல்லது அதற்கும் குறைவான செறிவூட்டலுக்காக சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பைக் காட்டுகிறது குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்படுகிறது. இந்த வரைபடத்திற்கு, சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பின் அடிப்படையில் ஒவ்வொரு கிளஸ்டரிலும் உள்ள முதல் ஐந்து அதிகப்படியான வகைகள் காட்டப்பட்டுள்ளன. பல t-சோதனையைப் பயன்படுத்தி, பெஞ்சாமினி, க்ரீகர் மற்றும் யெகுட்டியேலி (Q = 5%) ஆகியோரின் இரண்டு-நிலை நேரியல் பூஸ்ட் நிரலைப் பயன்படுத்தி, ஒவ்வொரு வகையிலும் அடையாளம் காணப்பட்ட முக்கியமான வேட்பாளர்களில் நேர-கோர்ஸ் புரத வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது, மேலும் ஒவ்வொரு வரிசையும் தனித்தனியாக பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. ஒரு நிலையான SD ஐ ஏற்றுக்கொள்ள வேண்டிய அவசியமில்லை.
வெளியிடப்பட்ட தரவுத்தளங்களுடன் இந்த ஆய்வின் முடிவுகளை ஒப்பிட்டு படம் 1 இல் உள்ள வென் வரைபடத்தை உருவாக்க, அளவு புரதப் பட்டியலை மிட்டோகார்ட்டா 2.0 குறிப்புகளுடன் (24) இணைத்தோம். வரைபடத்தை உருவாக்க, டிரா வென் வரைபடம் (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) என்ற ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தவும்.
புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படும் புள்ளிவிவர நடைமுறைகள் பற்றிய விரிவான தகவலுக்கு, தயவுசெய்து பொருட்கள் மற்றும் முறைகளின் தொடர்புடைய பகுதியைப் பார்க்கவும். மற்ற அனைத்து சோதனைகளுக்கும், விரிவான தகவல்களை தொடர்புடைய லெஜண்டில் காணலாம். வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், அனைத்து தரவுகளும் சராசரி ± SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் அனைத்து புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வுகளும் கிராப்பேட் பிரிசம் 8.1.2 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டன.
இந்தக் கட்டுரைக்கான துணைப் பொருட்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ஐப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-வணிகமற்ற உரிமத்தின் விதிமுறைகளின் கீழ் விநியோகிக்கப்படும் ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரையாகும், இது எந்தவொரு ஊடகத்திலும் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது, இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக அல்ல, மேலும் அசல் படைப்பு சரியானது என்பதே அடிப்படை. குறிப்பு.
குறிப்பு: நீங்கள் பக்கத்திற்கு பரிந்துரைக்கும் நபர் மின்னஞ்சலைப் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் தெரிந்துகொள்ளும் வகையில் மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் உங்களிடம் கேட்கிறோம். எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் நாங்கள் கைப்பற்ற மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளரா என்பதை சோதிக்கவும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுக்கவும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
இ. மோட்டோரி, ஐ. அடானாசோவ், எஸ்.எம்.வி. கோச்சன், கே. ஃபோல்ஸ்-டோனாஹூ, வி. சக்திவேலு, பி. கியாவலிஸ்கோ, என். டோனி, ஜே. புயல், என்.-ஜி. லார்சன்
செயலிழந்த நியூரான்களின் புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வு, நியூரோடிஜெனரேஷனை எதிர்க்க வளர்சிதை மாற்ற திட்டங்கள் செயல்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டியது.
இ. மோட்டோரி, ஐ. அடானாசோவ், எஸ்.எம்.வி. கோச்சன், கே. ஃபோல்ஸ்-டோனாஹூ, வி. சக்திவேலு, பி. கியாவலிஸ்கோ, என். டோனி, ஜே. புயல், என்.-ஜி. லார்சன்
செயலிழந்த நியூரான்களின் புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வு, நியூரோடிஜெனரேஷனை எதிர்க்க வளர்சிதை மாற்ற திட்டங்கள் செயல்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டியது.
©2020 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS என்பது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.