Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியின் பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாகவே உள்ளது. சிறந்த முடிவுகளுக்கு, உங்கள் உலாவியின் புதிய பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைலிங் அல்லது ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காட்டுகிறோம்.
ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறு போன்ற நரம்பியல் வளர்ச்சிக் கோளாறுகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் பங்கை ஆய்வு செய்ய புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) பயன்படுத்தப்படுகிறது. PPA மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியல் உருவாக்கம், வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் விற்றுமுதல் ஆகியவற்றை சீர்குலைப்பதாக அறியப்படுகிறது. இருப்பினும், இந்த வழிமுறைகளின் சிக்கலான தற்காலிக தன்மை காரணமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல், பிளவு மற்றும் இணைவு ஆகியவற்றில் PPA இன் விளைவுகள் சிக்கலாகவே உள்ளன. இங்கே, நியூரான் போன்ற SH-SY5Y செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சர், உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலை PPA எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பதை ஆராய நிரப்பு அளவு இமேஜிங் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்துகிறோம். PPA (5 mM) மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியில் (p < 0.01), ஃபெரெட் விட்டம் மற்றும் சுற்றளவு (p < 0.05), மற்றும் பகுதி 2 (p < 0.01) ஆகியவற்றில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தியது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு இருப்பிட பகுப்பாய்வு பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் காட்டியது (p < 0.05). இதன் மூலம் மன அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கின் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்கிறது. கூடுதலாக, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) மற்றும் OPA1 (p < 0.05) ஆகியவற்றின் mRNA வெளிப்பாடு கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது. இது மன அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் செயல்பாட்டைப் பராமரிக்க மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றின் மறுவடிவமைப்பை விளக்குகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் PPA இன் விளைவுகள் பற்றிய புதிய நுண்ணறிவை எங்கள் தரவு வழங்குகிறது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்த பதில்களில் உள்ள சிக்கலான ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளைப் படிப்பதற்கான இமேஜிங் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை எடுத்துக்காட்டுகிறது.
மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் ஆற்றல் உற்பத்தி மற்றும் உயிரியக்கத் தொகுப்பில் அவற்றின் வழக்கமான பாத்திரங்களுக்கு அப்பால் பல்வேறு செல்லுலார் செயல்பாடுகளில் ஒருங்கிணைந்த பங்கேற்பாளர்களாக உள்ளன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் கால்சியம் சமிக்ஞை, வளர்சிதை மாற்ற மற்றும் ரெடாக்ஸ் ஹோமியோஸ்டாஸிஸ், அழற்சி சமிக்ஞை, எபிஜெனெடிக் மாற்றங்கள், செல் பெருக்கம், வேறுபாடு மற்றும் திட்டமிடப்பட்ட செல் இறப்பு ஆகியவற்றின் முக்கிய சீராக்கி ஆகும். குறிப்பாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் நரம்பியல் வளர்ச்சி, உயிர்வாழ்வு மற்றும் செயல்பாட்டிற்கு மிகவும் முக்கியமானது மற்றும் நரம்பியல் நோயியலின் பல்வேறு வெளிப்பாடுகளில் பரவலாக உட்படுத்தப்படுகிறது2,3,4.
கடந்த தசாப்தத்தில், வளர்சிதை மாற்ற நிலை நியூரோஜெனிசிஸ், வேறுபாடு, முதிர்வு மற்றும் பிளாஸ்டிசிட்டி ஆகியவற்றின் மைய சீராக்கியாக வெளிப்பட்டுள்ளது5,6. சமீபத்தில், மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியல் மைட்டோசிஸின் குறிப்பாக முக்கியமான கூறுகளாக மாறியுள்ளன, இது செல்களுக்குள் ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் தொகுப்பைப் பராமரிக்கும் ஒரு மாறும் செயல்முறையாகும். மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனிசிஸ் மற்றும் பயோஎனெர்ஜெடிக்ஸ் முதல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு, இணைவு, போக்குவரத்து மற்றும் அனுமதி வரையிலான சிக்கலான ஒன்றுக்கொன்று சார்ந்த பாதைகளால் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது7,8. இந்த ஒருங்கிணைந்த வழிமுறைகளில் ஏதேனும் ஒன்றை சீர்குலைப்பது ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளின் பராமரிப்பை பாதிக்கிறது மற்றும் நரம்பியல் வளர்ச்சிக்கு ஆழமான செயல்பாட்டு விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது9,10. உண்மையில், மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலின் ஒழுங்குமுறை மீறல் ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறுகள் (ASD)11,12 உட்பட பல மனநல, நரம்பியல் சிதைவு மற்றும் நரம்பியல் வளர்ச்சி கோளாறுகளில் காணப்படுகிறது.
ASD என்பது சிக்கலான மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் கட்டமைப்பைக் கொண்ட ஒரு பன்முகத்தன்மை கொண்ட நரம்பியல் வளர்ச்சிக் கோளாறு ஆகும். ASD இன் பரம்பரைத்தன்மை மறுக்க முடியாதது, ஆனால் அடிப்படை மூலக்கூறு காரணவியல் இன்னும் சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. முன் மருத்துவ மாதிரிகள், மருத்துவ ஆய்வுகள் மற்றும் மல்டி-ஓமிக்ஸ் மூலக்கூறு தரவுத்தொகுப்புகளிலிருந்து தரவைச் சேகரிப்பது ASD13,14 இல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கான அதிகரித்து வரும் சான்றுகளை வழங்குகிறது. ASD உள்ள நோயாளிகளின் குழுவில் மரபணு அளவிலான DNA மெத்திலேஷன் திரையை நாங்கள் முன்பு செய்தோம், மேலும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளில் தொகுக்கப்பட்ட வேறுபட்ட மெத்திலேட்டட் மரபணுக்களை அடையாளம் கண்டோம். பின்னர் ASD16 இல் அதிகரித்த mtDNA நகல் எண் மற்றும் மாற்றப்பட்ட சிறுநீர் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரத்துடன் தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனீசிஸ் மற்றும் டைனமிக்ஸின் மைய கட்டுப்பாட்டாளர்களின் வேறுபட்ட மெத்திலேஷனை நாங்கள் தெரிவித்தோம். ASD இன் நோயியல் இயற்பியலில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மற்றும் ஹோமியோஸ்டாஸிஸ் ஒரு முக்கிய பங்கை வகிக்கின்றன என்பதற்கான அதிகரித்து வரும் ஆதாரங்களை எங்கள் தரவு வழங்குகிறது. எனவே, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல், உருவவியல் மற்றும் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவின் இயந்திர புரிதலை மேம்படுத்துவது இரண்டாம் நிலை மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு வகைப்படுத்தப்படும் நரம்பியல் நோய்கள் குறித்த தொடர்ச்சியான ஆராய்ச்சியின் முக்கிய இலக்காகும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்த பதில்களில் குறிப்பிட்ட மரபணுக்களின் பங்கை ஆய்வு செய்ய மூலக்கூறு நுட்பங்கள் பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், மைட்டோடிக் கட்டுப்பாட்டு வழிமுறைகளின் பன்முகத்தன்மை மற்றும் தற்காலிக தன்மையால் இந்த அணுகுமுறை மட்டுப்படுத்தப்படலாம். மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்களின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு என்பது செயல்பாட்டு மாற்றங்களின் மறைமுக குறிகாட்டியாகும், குறிப்பாக குறைந்த எண்ணிக்கையிலான மரபணுக்கள் மட்டுமே பொதுவாக பகுப்பாய்வு செய்யப்படுவதால். எனவே, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மற்றும் பயோஎனெர்ஜிக்ஸ் ஆகியவற்றைப் படிப்பதற்கான நேரடி முறைகள் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவம், இணைப்பு மற்றும் அமைப்பு ஆற்றல் உற்பத்தி மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் செல் உயிர்வாழ்விற்கு முக்கியமானவை5,18. மேலும், மைட்டோசிஸின் பல்வேறு கூறுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களில் கவனம் செலுத்துகின்றன, அவை மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் பயனுள்ள இறுதிப் புள்ளிகளாகச் செயல்படக்கூடும் மற்றும் அடுத்தடுத்த இயந்திர ஆய்வுகளுக்கு ஒரு அடிப்படையை வழங்கக்கூடும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பை டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) பயன்படுத்தி நேரடியாகக் காணலாம், இது செல்லுலார் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சர் பற்றிய விரிவான ஆய்வை அனுமதிக்கிறது. செல் மக்கள்தொகையில் மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், புரத வெளிப்பாடு அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டு அளவுருக்களை மட்டுமே நம்புவதற்குப் பதிலாக, தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியலின் தெளிவுத்திறனில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கிறிஸ்டேயின் உருவவியல், வடிவம் மற்றும் கட்டமைப்பை TEM நேரடியாகக் காட்சிப்படுத்துகிறது. கூடுதலாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மற்றும் ஹோமியோஸ்டாசிஸில் முக்கிய பங்கு வகிக்கும் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் மற்றும் ஆட்டோபாகோசோம்கள் போன்ற மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் பிற உறுப்புகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகளை ஆய்வு செய்ய TEM உதவுகிறது. எனவே, குறிப்பிட்ட பாதைகள் அல்லது மரபணுக்களில் கவனம் செலுத்துவதற்கு முன்பு மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பைப் படிப்பதற்கு இது TEM ஐ ஒரு நல்ல தொடக்க புள்ளியாக ஆக்குகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு நரம்பியல் நோயியலுக்கு பெருகிய முறையில் பொருத்தமானதாக மாறும்போது, ​​இன் விட்ரோ நியூரானல் மாதிரிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலை நேரடியாகவும் அளவு ரீதியாகவும் படிக்க முடியும் என்பது தெளிவான தேவை.
இந்தக் கட்டுரையில், ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புக்கான நியூரான் மாதிரியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை ஆராய்வோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரோபியோனைல்-CoA கார்பாக்சிலேஸ் என்சைம் PCC இன் துணை அலகான ASD15 இல் புரோபியோனைல்-CoA கார்பாக்சிலேஸ் பீட்டா (PCCB) இன் வேறுபட்ட மெத்திலேஷனை நாங்கள் முன்பு அறிக்கை செய்தோம். PCC இன் ஒழுங்குமுறை மீறல், புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA)23,24,25 உட்பட புரோபியோனைல் வழித்தோன்றல்களின் நச்சுத் திரட்சியை ஏற்படுத்துவதாக அறியப்படுகிறது. PPA நியூரான் வளர்சிதை மாற்றத்தை சீர்குலைத்து, விவோவில் நடத்தையை மாற்றுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் ASD26,27,28 இல் உள்ள நரம்பியல் வளர்ச்சி வழிமுறைகளைப் படிப்பதற்கான ஒரு நிறுவப்பட்ட விலங்கு மாதிரியாகும். கூடுதலாக, PPA மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு திறன், உயிரியக்கவியல் மற்றும் சுவாசத்தை விட்ரோவில் சீர்குலைப்பதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது மற்றும் நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மாதிரியாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது29,30. இருப்பினும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலில் PPA- தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பின் தாக்கம் சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.
இந்த ஆய்வு, SH-SY5Y செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல், இயக்கவியல் மற்றும் செயல்பாட்டில் PPA இன் விளைவுகளை அளவிடுவதற்கு நிரப்பு இமேஜிங் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்துகிறது. முதலில், மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சர் 17,31,32 இல் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் காட்சிப்படுத்த ஒரு TEM முறையை உருவாக்கினோம். மைட்டோகாண்ட்ரியலின் மாறும் தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு33, பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியல் எண் மற்றும் PPA அழுத்தத்தின் கீழ் உள்ள அளவு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சமநிலையில் ஏற்படும் மாற்றங்களை அளவிட மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு உள்ளூர்மயமாக்கல் (MEL) பகுப்பாய்வையும் பயன்படுத்தினோம். இறுதியாக, உயிரியல் உருவாக்கம், பிளவு மற்றும் இணைவில் ஈடுபடும் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்களுடன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியல் தொடர்புடையதா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை ஒழுங்குபடுத்தும் வழிமுறைகளின் சிக்கலை தெளிவுபடுத்துவதில் உள்ள சவாலை எங்கள் தரவு விளக்குகிறது. SH-SY5Y செல்களில் மைட்டோசிஸின் அளவிடக்கூடிய குவிந்த இறுதிப் புள்ளியாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலைப் படிப்பதில் TEM இன் பயன்பாட்டை நாங்கள் எடுத்துக்காட்டுகிறோம். கூடுதலாக, வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக டைனமிக் நிகழ்வுகளைப் பிடிக்கும் இமேஜிங் நுட்பங்களுடன் இணைந்தால் TEM தரவு மிகச் சிறந்த தகவலை வழங்குகிறது என்பதை நாங்கள் எடுத்துக்காட்டுகிறோம். நியூரான் செல் மைட்டோசிஸை ஆதரிக்கும் மூலக்கூறு ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளின் மேலும் சிறப்பியல்பு, நரம்பு மண்டலத்தின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கூறு மற்றும் நியூரோடிஜெனரேட்டிவ் நோய்களைப் பற்றிய முக்கியமான நுண்ணறிவை வழங்கக்கூடும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்தைத் தூண்ட, SH-SY5Y செல்கள் 3 mM மற்றும் 5 mM சோடியம் புரோபியோனேட் (NaP) பயன்படுத்தி PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. TEM க்கு முன்பு, மாதிரிகள் உயர் அழுத்த உறைதல் மற்றும் உறைதல் (படம் 1a) பயன்படுத்தி கிரையோஜெனிக் மாதிரி தயாரிப்புக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மக்கள்தொகையின் எட்டு உருவவியல் அளவுருக்களை அளவிட ஒரு தானியங்கி மைட்டோகாண்ட்ரியல் பட பகுப்பாய்வு பைப்லைனை நாங்கள் உருவாக்கினோம். PPA சிகிச்சையானது நான்கு அளவுருக்களை கணிசமாக மாற்றியிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்: பகுதி 2, பரப்பளவு, சுற்றளவு மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் (படம் 1b–e). 3 mM மற்றும் 5 mM PPA சிகிச்சையுடன் பகுதி 2 கணிசமாகக் குறைந்தது (முறையே p = 0.0183 மற்றும் p = 0.002) (படம் 1b), அதே நேரத்தில் பரப்பளவு (p = 0.003), சுற்றளவு (p = 0.0106) மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் அனைத்தும் கணிசமாகக் குறைந்துள்ளன. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் (படம் 1c–e) ஒப்பிடும்போது 5 mM சிகிச்சை குழுவில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பு (p = 0.0172) இருந்தது. 5 mM PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்கள் சிறியதாகவும், அதிக வட்டமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் கொண்டிருந்தன என்றும், இந்த மைட்டோகாண்ட்ரியா கட்டுப்பாட்டு செல்களில் உள்ளவற்றை விட குறைவாக நீளமாக இருந்தன என்றும் பரப்பளவு மற்றும் சுற்றளவு ஆகியவற்றில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்புகளைக் காட்டியது. இது ஃபெரெட் விட்டத்தில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்புடன் ஒத்துப்போகிறது, இது துகள் விளிம்புகளுக்கு இடையிலான மிகப்பெரிய தூரத்தில் குறைவைக் குறிக்கும் ஒரு சுயாதீன அளவுரு. கிறிஸ்டேயின் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரில் மாற்றங்கள் காணப்பட்டன: கிறிஸ்டே PPA அழுத்தத்தின் செல்வாக்கின் கீழ் குறைவாக உச்சரிக்கப்பட்டது (படம் 1a, பேனல் B). இருப்பினும், அனைத்து படங்களும் கிறிஸ்டேயின் அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரை தெளிவாக பிரதிபலிக்கவில்லை, எனவே இந்த மாற்றங்களின் அளவு பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்படவில்லை. இந்த TEM தரவு மூன்று சாத்தியமான காட்சிகளைப் பிரதிபலிக்கக்கூடும்: (1) PPA பிளவுகளை அதிகரிக்கிறது அல்லது இணைவைத் தடுக்கிறது, இதனால் ஏற்கனவே உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியா அளவு சுருங்குகிறது; (2) மேம்படுத்தப்பட்ட உயிரியக்கவியல் புதிய, சிறிய மைட்டோகாண்ட்ரியாவை உருவாக்குகிறது அல்லது (3) இரண்டு வழிமுறைகளையும் ஒரே நேரத்தில் தூண்டுகிறது. இந்த நிலைமைகளை TEM ஆல் வேறுபடுத்த முடியாது என்றாலும், குறிப்பிடத்தக்க உருவ மாற்றங்கள் PPA அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஹோமியோஸ்டாஸிஸ் மற்றும் இயக்கவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் குறிக்கின்றன. இந்த இயக்கவியல் மற்றும் அவற்றின் அடிப்படையிலான சாத்தியமான வழிமுறைகளை மேலும் வகைப்படுத்த கூடுதல் அளவுருக்களை நாங்கள் பின்னர் ஆராய்ந்தோம்.
புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பை மறுவடிவமைக்கிறது. (a) மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு குறைந்து மைட்டோகாண்ட்ரியல் சிறியதாகவும் வட்டமாகவும் மாறுவதைக் காட்டும் பிரதிநிதித்துவ டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி (TEM) படங்கள், PPA சிகிச்சை அதிகரிப்பதன் மூலம்; முறையே 0 mM (சிகிச்சையளிக்கப்படாதது), 3 mM மற்றும் 5 mM. சிவப்பு அம்புகள் மைட்டோகாண்ட்ரியலைக் குறிக்கின்றன. (b–e) 24 மணிநேரத்திற்கு PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்கள் TEM க்காக தயாரிக்கப்பட்டு, முடிவுகள் Fiji/ImageJ ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. எட்டு அளவுருக்களில் நான்கு கட்டுப்பாடு (சிகிச்சையளிக்கப்படாதது, 0 mM PPA) மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட (3 mM மற்றும் 5 mM PPA) செல்களுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் காட்டின. (b) பகுதி 2, (c) பரப்பளவு, (d) சுற்றளவு, (e) ஃபெரெட் விட்டம். மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு (கட்டுப்பாடு vs. சிகிச்சை) மற்றும் டன்னட்டின் பல ஒப்பீட்டு சோதனை ஆகியவை குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன (p < 0.05). தரவு புள்ளிகள் ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட கலத்திற்கும் சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் மதிப்பைக் குறிக்கின்றன, மேலும் பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± SEM ஐக் குறிக்கின்றன. காட்டப்பட்டுள்ள தரவு n = 3 ஐக் குறிக்கிறது, ஒரு பிரதிக்கு குறைந்தது 24 செல்கள்; மொத்தம் 266 படங்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன; * p < 0.05 ஐக் குறிக்கிறது, ** p < 0.01 ஐக் குறிக்கிறது.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் PPA-க்கு எவ்வாறு பதிலளிக்கிறது என்பதை மேலும் வகைப்படுத்த, டெட்ராமெதில்ரோடமைன் எத்தில் எஸ்டர் (TMRE) மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியாவை வண்ணமயமாக்கினோம், மேலும் 3 மற்றும் 5 mM PPA-வில் 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு மைட்டோகாண்ட்ரியாவை உள்ளூர்மயமாக்கி அளவிட டைம்-லேப்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபி மற்றும் MEL பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தினோம். பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளின் சிகிச்சை. (படம் 2a). MEL பகுப்பாய்விற்குப் பிறகு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் எண்ணிக்கையையும் அவற்றின் சராசரி அளவையும் அளவிட மைட்டோகாண்ட்ரியா மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] இல் நிகழும் பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் ஒரு சிறிய ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பை நாங்கள் கண்டோம். பிளவு [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] மற்றும் இணைவு [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] மற்றும் இணைவு [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] நிகழ்வுகள் கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது 5 mM இல் கணிசமாக அதிகரித்தன (படம் 3b). மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] மற்றும் 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (படம் 3c) இரண்டிலும் கணிசமாக அதிகரித்தது, அதே நேரத்தில் ஒவ்வொரு மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்பின் சராசரி அளவு மாறாமல் இருந்தது (படம் 3c). 3d). ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை மறுவடிவமைப்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கின் ஒருமைப்பாட்டை வெற்றிகரமாகப் பராமரிக்கும் ஒரு ஈடுசெய்யும் பதிலாக செயல்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. 3 mM PPA இல் பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு ஓரளவு மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு காரணமாக இருப்பதாகக் கூறுகிறது, ஆனால் சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு அடிப்படையில் மாறாமல் இருப்பதால், உயிரியக்கவியல் கூடுதல் ஈடுசெய்யும் பதிலாக நிராகரிக்க முடியாது. இருப்பினும், இந்தத் தரவுகள் TEM ஆல் கவனிக்கப்பட்ட சிறிய, வட்டமான மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன, மேலும் PPA ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களையும் நிரூபிக்கின்றன.
புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) நெட்வொர்க் ஒருமைப்பாட்டை பராமரிக்க டைனமிக் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மறுவடிவமைப்பைத் தூண்டுகிறது. SH-SY5Y செல்கள் வளர்க்கப்பட்டு, 3 மற்றும் 5 mM PPA உடன் 24 மணிநேரம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டு, TMRE மற்றும் Hoechst 33342 உடன் வண்ணம் தீட்டப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து MEL பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. (a) ஒவ்வொரு நிலைக்கும் நேரம் 2 (t2) இல் நிறம் மற்றும் பைனரைஸ் செய்யப்பட்ட அதிகபட்ச தீவிர கணிப்புகளை சித்தரிக்கும் பிரதிநிதித்துவ நேர-இடைவெளி நுண்ணோக்கி படங்கள். ஒவ்வொரு பைனரி படத்திலும் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பகுதிகள் காலப்போக்கில் இயக்கவியலை விளக்க மூன்று வெவ்வேறு நேர பிரேம்களில் (t1-t3) 3D இல் மேம்படுத்தப்பட்டு காட்டப்படுகின்றன; இணைவு நிகழ்வுகள் பச்சை நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன; பிளவு நிகழ்வுகள் பச்சை நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன. சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்படும். (b) ஒரு நிலைக்கு டைனமிக் நிகழ்வுகளின் சராசரி எண்ணிக்கை. (c) ஒரு கலத்திற்கு மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் சராசரி எண்ணிக்கை. (d) ஒரு கலத்திற்கு ஒவ்வொரு மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்பின் சராசரி அளவு (µm3). காட்டப்பட்டுள்ள தரவு சிகிச்சை குழுவிற்கு n = 15 செல்களைக் குறிக்கிறது. காட்டப்பட்டுள்ள பிழை பார்கள் சராசரி ± SEM ஐக் குறிக்கின்றன, அளவுகோல் பட்டை = 10 μm, * p < 0.05.
புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒடுக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. SH-SY5Y செல்கள் 3 மற்றும் 5 mM PPA உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. RT-qPCR ஐப் பயன்படுத்தி சார்பு மரபணு அளவீடு செய்யப்பட்டது மற்றும் B2M ஆக இயல்பாக்கப்பட்டது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனிசிஸ் மரபணுக்கள் (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 மற்றும் (d) NFE2L2. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் பிளவு மரபணுக்கள் (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 மற்றும் (i) DRP1. குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் (p < 0.05) ஒரு வழி ANOVA (கட்டுப்பாடு vs. சிகிச்சை) மற்றும் டன்னெட்டின் பல ஒப்பீட்டு சோதனையைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டன: * p < 0.05 ஐக் குறிக்கிறது, ** p < 0.01 ஐக் குறிக்கிறது, மற்றும் **** p < 0.0001 ஐக் குறிக்கிறது. பார்கள் சராசரி வெளிப்பாட்டைக் குறிக்கின்றன ± SEM. காட்டப்பட்டுள்ள தரவு n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), மற்றும் n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) உயிரியல் பிரதிகளைக் குறிக்கிறது.
TEM மற்றும் MEL பகுப்பாய்வுகளின் தரவுகள், PPA மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் இயக்கவியலை மாற்றுகிறது என்பதைக் குறிக்கின்றன. இருப்பினும், இந்த இமேஜிங் நுட்பங்கள் இந்த செயல்முறைகளை இயக்கும் அடிப்படை வழிமுறைகள் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்கவில்லை. எனவே, PPA சிகிச்சைக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல், உயிரியல் உருவாக்கம் மற்றும் மைட்டோசிஸ் ஆகியவற்றின் ஒன்பது முக்கிய கட்டுப்பாட்டாளர்களின் mRNA வெளிப்பாட்டை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். 3 mM மற்றும் 5 mM PPA உடன் 24 மணிநேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு, செல் மைலோமா ஆன்கோஜீன் (cMYC), அணு சுவாச காரணி (NRF1), மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி 1 (TFAM), NFE2-போன்ற டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி BZIP (NFE2L2), காஸ்ட்ரின் போன்ற புரதம் 2 (STOML2), பார்வை நரம்பு அட்ராபி 1 (OPA1), மைட்டோஃபுசின் 1 (MFN1), மைட்டோஃபுசின் 2 (MFN2) மற்றும் டைனமின் தொடர்பான புரதம் 1 (DRP1) ஆகியவற்றை நாங்கள் அளவிட்டோம். நாங்கள் 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 மற்றும் p < 0.0001, முறையே) மற்றும் 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA சிகிச்சையைக் கவனித்தோம். (படம் 3a–c). mRNA வெளிப்பாட்டின் குறைவு அளவைச் சார்ந்தது: cMYC, NRF1 மற்றும் TFAM இன் வெளிப்பாடு முறையே 3 mM இல் 5.7, 2.6 மற்றும் 1.9 மடங்கும், 5 mM இல் 11.2, 3 மற்றும் 2.2 மடங்கும் குறைந்தது. இதற்கு நேர்மாறாக, மைய ரெடாக்ஸ் பயோஜெனிசிஸ் மரபணு NFE2L2 PPA இன் எந்த செறிவிலும் மாற்றப்படவில்லை, இருப்பினும் இதேபோன்ற டோஸ்-சார்ந்த வெளிப்பாட்டின் போக்கு குறைக்கப்பட்டது (படம் 3d).
பிளவு மற்றும் இணைவை ஒழுங்குபடுத்துவதில் ஈடுபட்டுள்ள கிளாசிக்கல் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டையும் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். STOML2 இணைவு, மைட்டோபேஜி மற்றும் உயிரியல் உருவாக்கத்தில் ஈடுபடுவதாகக் கருதப்படுகிறது, மேலும் அதன் வெளிப்பாடு 3 mM (2.4 மடங்கு மாற்றம்) மற்றும் 5 mM (2.8 மடங்கு மாற்றம்) PPA (படம் 1) ஆல் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது. 3d). இதேபோல், OPA1 இணைவு மரபணு வெளிப்பாடு 3 mM (1.6 மடங்கு மாற்றம்) மற்றும் 5 mM (1.9 மடங்கு மாற்றம்) PPA (முறையே p = 0.006 மற்றும் p = 0.0024) இல் குறைக்கப்பட்டது (படம் 3f). இருப்பினும், 24-h PPA அழுத்தத்தின் கீழ் இணைவு மரபணுக்கள் MFN1, MFN2 அல்லது பிளவு மரபணு DRP1 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை நாங்கள் காணவில்லை (படம் 3g–i). கூடுதலாக, நான்கு இணைவு மற்றும் பிளவு புரதங்களின் (OPA1, MFN1, MFN2 மற்றும் DRP1) அளவுகள் ஒரே நிலைமைகளின் கீழ் மாறவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 4a–d). இந்தத் தரவுகள் ஒரு ஒற்றைப் புள்ளியை பிரதிபலிக்கின்றன என்பதையும், PPA அழுத்தத்தின் ஆரம்ப கட்டங்களில் புரத வெளிப்பாடு அல்லது செயல்பாட்டு நிலைகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களைப் பிரதிபலிக்காமல் போகலாம் என்பதையும் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். இருப்பினும், cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்புகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றின் குறிப்பிடத்தக்க டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையைக் குறிக்கின்றன. கூடுதலாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் இறுதி-நிலை மாற்றங்களை நேரடியாக ஆய்வு செய்ய இமேஜிங் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை இந்தத் தரவு எடுத்துக்காட்டுகிறது.
புரோபியோனிக் அமிலம் (PPA) சிகிச்சைக்குப் பிறகு இணைவு மற்றும் பிளவு காரணி புரத அளவுகள் மாறவில்லை. SH-SY5Y செல்கள் 3 மற்றும் 5 mM PPA உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. வெஸ்டர்ன் பிளட் பகுப்பாய்வு மூலம் புரத அளவுகள் அளவிடப்பட்டன, மேலும் வெளிப்பாடு அளவுகள் மொத்த புரதத்திற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. சராசரி புரத வெளிப்பாடு மற்றும் இலக்கு மற்றும் மொத்த புரதத்தின் பிரதிநிதித்துவ மேற்கத்திய பிளட்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. பார்கள் சராசரி ± SEM ஐக் குறிக்கின்றன, மேலும் காட்டப்பட்டுள்ள தரவு n = 3 உயிரியல் பிரதிகளின் பிரதிநிதியாகும். மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு மற்றும் டன்னெட்டின் சோதனையைப் பயன்படுத்தி பல ஒப்பீடுகள் (p < 0.05) செய்யப்பட்டன. அசல் ஜெல் மற்றும் பிளட் படம் S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு வளர்சிதை மாற்ற, இருதய மற்றும் தசை நோய்கள் முதல் நரம்பியல் நோய்கள் வரை பல அமைப்பு நோய்களுடன் தொடர்புடையது1,10. பல நரம்புச் சிதைவு மற்றும் நரம்புச் சிதைவு நோய்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடையவை, மூளையின் ஆயுட்காலம் முழுவதும் இந்த உறுப்புகளின் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகின்றன. இந்த நோய்களில் பார்கின்சன் நோய், அல்சைமர் நோய் மற்றும் ASD3,4,18 ஆகியவை அடங்கும். இருப்பினும், இந்த நோய்களைப் படிக்க மூளை திசுக்களை அணுகுவது கடினம், குறிப்பாக இயந்திர மட்டத்தில், செல்லுலார் மாதிரி அமைப்புகளை அவசியமான மாற்றாக மாற்றுகிறது. இந்த ஆய்வில், நரம்பியல் நோய்களில், குறிப்பாக ஆட்டிசம் ஸ்பெக்ட்ரம் கோளாறுகளில் காணப்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மீண்டும் கணக்கிட PPA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்களைப் பயன்படுத்தி ஒரு செல்லுலார் மாதிரி அமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறோம். நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலைப் படிக்க இந்த PPA மாதிரியைப் பயன்படுத்துவது ASD இன் காரணவியல் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்கக்கூடும்.
மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் காண TEM ஐப் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். அதன் செயல்திறனை அதிகரிக்க TEM சரியாகப் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். கிரையோ-மாதிரிகளைத் தயாரிப்பது, செல்லுலார் கூறுகளை ஒரே நேரத்தில் சரிசெய்து, கலைப்பொருட்கள் உருவாவதைக் குறைப்பதன் மூலம் நரம்பியல் கட்டமைப்புகளை சிறப்பாகப் பாதுகாக்க அனுமதிக்கிறது34. இதற்கு இணங்க, நியூரான் போன்ற SH-SY5Y செல்கள் அப்படியே துணை செல்லுலார் உறுப்புகள் மற்றும் நீளமான மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் கொண்டிருப்பதை நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 1a). நியூரானல் செல் மாதிரிகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பைப் படிப்பதற்கான கிரையோஜெனிக் தயாரிப்பு நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை இது எடுத்துக்காட்டுகிறது. TEM தரவின் புறநிலை பகுப்பாய்விற்கு அளவு அளவீடுகள் முக்கியமானவை என்றாலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ மாற்றங்களை உறுதிப்படுத்த எந்த குறிப்பிட்ட அளவுருக்கள் அளவிடப்பட வேண்டும் என்பதில் இன்னும் ஒருமித்த கருத்து இல்லை. மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பை அளவுரீதியாக ஆய்வு செய்த ஏராளமான ஆய்வுகளின் அடிப்படையில்17,31,32, எட்டு உருவவியல் அளவுருக்களை அளவிடும் ஒரு தானியங்கி மைட்டோகாண்ட்ரியல் பட பகுப்பாய்வு பைப்லைனை நாங்கள் உருவாக்கினோம்: பகுதி, பரப்பளவு2, விகித விகிதம், சுற்றளவு, வட்டத்தன்மை, பட்டம், ஃபெரெட் விட்டம். மற்றும் வட்டத்தன்மை.
அவற்றில், PPA பகுதி 2, பரப்பளவு, சுற்றளவு மற்றும் ஃபெரெட் விட்டம் ஆகியவற்றைக் கணிசமாகக் குறைத்தது (படம் 1b–e). மைட்டோகாண்ட்ரியா சிறியதாகவும் வட்டமாகவும் மாறியது என்பதை இது காட்டுகிறது, இது PPA30- தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்தை 72 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு மைட்டோகாண்ட்ரியல் பகுதியில் குறைவதைக் காட்டும் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது. இந்த உருவவியல் அம்சங்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு என்பதைக் குறிக்கலாம், இது மைட்டோபாகி35,36,37 மூலம் அவற்றின் சிதைவை ஊக்குவிக்க மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கிலிருந்து சேதமடைந்த கூறுகளைப் பிரிப்பதற்குத் தேவையான செயல்முறையாகும். மறுபுறம், சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு குறைவது அதிகரித்த உயிரியக்கவியலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம், இதன் விளைவாக சிறிய புதிய மைட்டோகாண்ட்ரியா உருவாகிறது. அதிகரித்த பிளவு அல்லது உயிரியக்கவியல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கு எதிராக மைட்டோசிஸைப் பராமரிக்க ஒரு ஈடுசெய்யும் பதிலைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்ச்சி குறைதல், பலவீனமான இணைவு அல்லது பிற நிலைமைகளை விலக்க முடியாது.
TEM ஆல் உருவாக்கப்பட்ட உயர் தெளிவுத்திறன் படங்கள் தனிப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் மட்டத்தில் உருவவியல் பண்புகளை தீர்மானிக்க அனுமதித்தாலும், இந்த முறை ஒரே நேரத்தில் இரு பரிமாண ஸ்னாப்ஷாட்களை உருவாக்குகிறது. வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு மாறும் பதில்களைப் படிக்க, நாங்கள் TMRE உடன் மைட்டோகாண்ட்ரியாவை வண்ணமயமாக்கினோம், மேலும் MEL பகுப்பாய்வுடன் நேர-இடைவெளி நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தினோம், இது காலப்போக்கில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கில் ஏற்படும் மாற்றங்களின் உயர்-செயல்திறன் 3D காட்சிப்படுத்தலை அனுமதிக்கிறது33,38. PPA அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் நுட்பமான ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 2). 3 mM இல், பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கை கணிசமாக அதிகரித்தது, அதே நேரத்தில் இணைவு நிகழ்வுகள் கட்டுப்பாட்டில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தன. பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு 5 mM PPA இல் காணப்பட்டது, ஆனால் இந்த மாற்றங்கள் தோராயமாக விகிதாசாரமாக இருந்தன, பிளவு மற்றும் இணைவு இயக்கவியல் அதிக செறிவுகளில் சமநிலையை அடைகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 2b). சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு 3 மற்றும் 5 mM PPA இரண்டிலும் மாறாமல் இருந்தது, இது மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கின் ஒருமைப்பாடு பாதுகாக்கப்பட்டதைக் குறிக்கிறது (படம் 2d). இது, நெட்வொர்க் துண்டு துண்டாகாமல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை திறம்பட பராமரிக்க, லேசான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் டைனமிக் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளின் திறனை பிரதிபலிக்கிறது. 3 mM PPA இல், பிளவு அதிகரிப்பு ஒரு புதிய சமநிலைக்கு மாறுவதை ஊக்குவிக்க போதுமானது, ஆனால் PPA இன் அதிக செறிவுகளால் தூண்டப்படும் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மிகவும் ஆழமான இயக்க மறுவடிவமைப்பு தேவைப்படுகிறது.
PPA அழுத்த செறிவுகள் இரண்டிலும் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் எண்ணிக்கை அதிகரித்தது, ஆனால் சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு கணிசமாக மாறவில்லை (படம் 2c). இது அதிகரித்த உயிரியல் உருவாக்கம் அல்லது அதிகரித்த பிரிவின் காரணமாக இருக்கலாம்; இருப்பினும், சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு இல்லாத நிலையில், உயிரியல் தொகுப்பு அதிகரிக்கும் வாய்ப்பு அதிகம். இருப்பினும், படம் 2 இல் உள்ள தரவு இரண்டு ஈடுசெய்யும் வழிமுறைகளின் இருப்பை ஆதரிக்கிறது: மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவுகளை அதிகப்படுத்துவதோடு ஒத்த பிளவு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனீசிஸுடன் ஒத்த நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு. இறுதியில், லேசான அழுத்தத்திற்கான டைனமிக் இழப்பீடு பிளவு, இணைவு, பயோஜெனீசிஸ் மற்றும் மைட்டோபேஜி ஆகியவற்றை உள்ளடக்கிய ஒரே நேரத்தில் செயல்முறைகளைக் கொண்டிருக்கலாம். PPA மைட்டோசிஸை மேம்படுத்துகிறது என்று முந்தைய ஆசிரியர்கள் காட்டினாலும்30,39 மற்றும் மைட்டோபேஜி29, PPA க்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு மற்றும் இணைவு இயக்கவியலை மறுவடிவமைப்பதற்கான ஆதாரங்களை நாங்கள் வழங்குகிறோம். இந்தத் தரவுகள் TEM ஆல் கவனிக்கப்பட்ட உருவவியல் மாற்றங்களை உறுதிப்படுத்துகின்றன மற்றும் PPA- தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடைய வழிமுறைகள் பற்றிய கூடுதல் நுண்ணறிவை வழங்குகின்றன.
TEM அல்லது MEL பகுப்பாய்வு எதுவும் கவனிக்கப்பட்ட உருவ மாற்றங்களுக்கு அடிப்படையான மரபணு ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளுக்கு நேரடி ஆதாரங்களை வழங்காததால், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், உயிரியக்கவியல் மற்றும் இயக்கவியலில் ஈடுபட்டுள்ள மரபணுக்களின் RNA வெளிப்பாட்டை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். cMYC புரோட்டோ-ஆன்கோஜீன் என்பது மைட்டோகாண்ட்ரியா, கிளைகோலிசிஸ், அமினோ அமிலம் மற்றும் கொழுப்பு அமில வளர்சிதை மாற்றத்தை ஒழுங்குபடுத்துவதில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணியாகும். கூடுதலாக, NRF1 மற்றும் TFAM41 உட்பட மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், மொழிபெயர்ப்பு மற்றும் சிக்கலான அசெம்பிளியில் ஈடுபட்டுள்ள கிட்டத்தட்ட 600 மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை cMYC ஒழுங்குபடுத்துவதாக அறியப்படுகிறது. NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவை மைட்டோசிஸின் இரண்டு மைய கட்டுப்பாட்டாளர்கள், mtDNA பிரதிபலிப்பை செயல்படுத்த PGC-1α இன் கீழ்நோக்கி செயல்படுகின்றன. இந்த பாதை cAMP மற்றும் AMPK சமிக்ஞைகளால் செயல்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் ஆற்றல் செலவு மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு உணர்திறன் கொண்டது. PPA இன் விளைவுகள் ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுமா என்பதை தீர்மானிக்க, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கவியலின் ரெடாக்ஸ் சீராக்கியான NFE2L2 ஐயும் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம்.
NFE2L2 வெளிப்பாடு மாறாமல் இருந்தபோதிலும், 3 mM மற்றும் 5 mM PPA உடன் 24 மணிநேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு cMYC, NRF1 மற்றும் TFAM ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் நிலையான டோஸ்-சார்பு குறைப்பைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3a–c). cMYC வெளிப்பாட்டைக் குறைப்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கு ஒரு பிரதிபலிப்பாக முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது, மேலும், cMYC வெளிப்பாட்டைக் குறைப்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம், நெட்வொர்க் இணைப்பு மற்றும் சவ்வு துருவமுனைப்பு ஆகியவற்றை மறுவடிவமைப்பதன் மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை ஏற்படுத்தும். சுவாரஸ்யமாக, cMYC மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு மற்றும் இணைவு 42,43 ஆகியவற்றை ஒழுங்குபடுத்துவதிலும் ஈடுபட்டுள்ளது, மேலும் செல் பிரிவின் போது DRP1 பாஸ்போரிலேஷன் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உள்ளூர்மயமாக்கலை அதிகரிப்பதாகவும், நரம்பியல் ஸ்டெம் செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ மறுவடிவமைப்பை மத்தியஸ்தம் செய்வதாகவும் அறியப்படுகிறது. உண்மையில், cMYC-குறைபாடுள்ள ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் PPA43 அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மாற்றங்களுடன் ஒத்துப்போகும் குறைக்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவைக் காட்டுகின்றன. இந்தத் தரவுகள் cMYC மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலுக்கு இடையே ஒரு சுவாரஸ்யமான ஆனால் இன்னும் தெளிவற்ற உறவை விளக்குகின்றன, இது PPA அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட மறுவடிவமைப்பின் எதிர்கால ஆய்வுகளுக்கு ஒரு சுவாரஸ்யமான இலக்கை வழங்குகிறது.
NRF1 மற்றும் TFAM இன் குறைப்பு, ஒரு முக்கியமான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஆக்டிவேட்டராக cMYC இன் பங்கிற்கு இசைவானது. இந்தத் தரவுகள் மனித பெருங்குடல் புற்றுநோய் செல்களில் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன, PPA 22 மணி நேரத்தில் NRF1 mRNA வெளிப்பாட்டைக் குறைத்தது, இது ATP குறைப்பு மற்றும் ROS46 அதிகரிப்புடன் தொடர்புடையது என்பதைக் காட்டுகிறது. இந்த ஆசிரியர்கள் TFAM வெளிப்பாடு 8.5 மணி நேரத்தில் அதிகரித்தது, ஆனால் 22 மணி நேரத்தில் அடிப்படை நிலைகளுக்குத் திரும்பியது என்றும் தெரிவித்தனர். இதற்கு நேர்மாறாக, கிம் மற்றும் பலர். (2019) SH-SY5Y செல்களில் 4 மணிநேர PPA அழுத்தத்திற்குப் பிறகு TFAM mRNA வெளிப்பாடு கணிசமாகக் குறைந்ததாகக் காட்டியது; இருப்பினும், 72 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, TFAM புரத வெளிப்பாடு கணிசமாக அதிகரித்தது மற்றும் mtDNA நகல் எண் கணிசமாக அதிகரித்தது. எனவே, 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு நாம் கவனித்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனீசிஸ் மரபணுக்களின் எண்ணிக்கையில் குறைவு, மைட்டோகாண்ட்ரியலின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு முந்தைய நேர புள்ளிகளில் பயோஜெனீசிஸை செயல்படுத்துவதோடு தொடர்புடையது என்ற சாத்தியத்தை விலக்கவில்லை. முந்தைய ஆய்வுகள், PPA, SH-SY5Y செல்களில் PGC-1α mRNA மற்றும் புரதத்தை 4 மணி 30 நிமிடங்களில் கணிசமாக அதிகப்படுத்துகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில் புரோபியோனிக் அமிலம் 12 மணி 39 நிமிடங்களில் PGC-1α வழியாக கன்று ஹெபடோசைட்டுகளில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உயிரியக்கத்தை மேம்படுத்துகிறது. சுவாரஸ்யமாக, PGC-1α என்பது NRF1 மற்றும் TFAM இன் நேரடி டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் சீராக்கி மட்டுமல்ல, பிளவு மற்றும் இணைவை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் MFN2 மற்றும் DRP1 இன் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது. ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், PPA ஆல் தூண்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஈடுசெய்யும் பதில்களை ஒழுங்குபடுத்தும் வழிமுறைகளின் நெருக்கமான இணைப்பை இது எடுத்துக்காட்டுகிறது. மேலும், PPA அழுத்தத்தின் கீழ் உயிரியக்கவியல் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றத்தின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையின் குறிப்பிடத்தக்க ஒழுங்குமுறையை எங்கள் தரவு பிரதிபலிக்கிறது.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 மற்றும் DRP1 மரபணுக்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு, இணைவு மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றின் மைய ஒழுங்குமுறைகளில் அடங்கும்37,48,49. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் இன்னும் பல மரபணுக்கள் ஈடுபட்டுள்ளன, இருப்பினும், STOML2, OPA1 மற்றும் MFN2 ஆகியவை ASD குழுவில் வேறுபட்ட மெத்திலேட்டட் செய்யப்பட்டதாகக் கண்டறியப்பட்டுள்ளன,16 மேலும் பல சுயாதீன ஆய்வுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக இந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளில் மாற்றங்களைப் பதிவு செய்துள்ளன50,51. 52. OPA1 மற்றும் STOML2 இரண்டின் வெளிப்பாடும் 3 mM மற்றும் 5 mM PPA சிகிச்சையால் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது (படம் 3e, f). OPA1 என்பது MFN1 மற்றும் 2 உடனான நேரடி தொடர்பு மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவின் கிளாசிக்கல் ஒழுங்குமுறைகளில் ஒன்றாகும், மேலும் கிறிஸ்டே மறுவடிவமைப்பு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலில் பங்கு வகிக்கிறது53. மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் STOML2 இன் துல்லியமான பங்கு தெளிவாக இல்லை, ஆனால் அது மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு, உயிரியல் உருவாக்கம் மற்றும் மைட்டோபாகி ஆகியவற்றில் ஒரு பங்கை வகிக்கிறது என்பதற்கான சான்றுகள் தெரிவிக்கின்றன.
STOML2 மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச இணைப்பு மற்றும் சுவாச சங்கிலி வளாகங்களை உருவாக்குவதை பராமரிப்பதில் ஈடுபட்டுள்ளது54,55 மேலும் புற்றுநோய் செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகளை ஆழமாக மாற்றுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது56. BAN மற்றும் கார்டியோலிபின் 55, 57, 58 உடனான தொடர்பு மூலம் STOML2 மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு திறன் மற்றும் உயிரியக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. கூடுதலாக, STOML2 மற்றும் PINK1 இடையேயான தொடர்பு மைட்டோபேஜியை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்று சுயாதீன ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன59,60. குறிப்பாக, STOML2 MFN2 உடன் நேரடியாக தொடர்பு கொண்டு நிலைப்படுத்துவதாகவும், OPA1 சிதைவுக்கு காரணமான புரோட்டீஸைத் தடுப்பதன் மூலம் நீண்ட OPA1 ஐசோஃபார்ம்களை நிலைப்படுத்துவதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்றும் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது53,61,62. PPA எதிர்வினைகளில் காணப்படும் STOML2 வெளிப்பாட்டில் ஏற்படும் குறைவு இந்த இணைவு புரதங்களை ubiquitin- மற்றும் புரோட்டீசோம் சார்ந்த பாதைகள் மூலம் சிதைவுக்கு ஆளாக்கக்கூடும்48. PPA-க்கான இயக்கவியல் பதிலில் STOML2 மற்றும் OPA1-ன் துல்லியமான பங்கு தெளிவாக இல்லை என்றாலும், இந்த இணைவு மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு குறைவது (படம் 3) பிளவு மற்றும் இணைவுக்கு இடையிலான சமநிலையை சீர்குலைத்து மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு குறைவதற்கு வழிவகுக்கும் (படம் 3). 1).
மறுபுறம், 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு OPA1 புரத வெளிப்பாடு மாறாமல் இருந்தது, அதே நேரத்தில் MFN1, MFN2 அல்லது DRP1 இன் mRNA மற்றும் புரத அளவுகள் PPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு கணிசமாக மாறவில்லை (படம் 3g-i, படம் 4). மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் பிளவு ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ள இந்த காரணிகளின் ஒழுங்குமுறையில் எந்த மாற்றங்களும் இல்லை என்பதை இது குறிக்கலாம். இருப்பினும், இந்த நான்கு மரபணுக்களும் புரதச் செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மாற்றங்களால் (PTMகள்) கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. OPA1 எட்டு மாற்று ஸ்ப்ளைஸ் வகைகளைக் கொண்டுள்ளது, அவை இரண்டு தனித்துவமான ஐசோஃபார்ம்களை உருவாக்க மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் புரோட்டியோலிட்டிகலாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன 63. நீண்ட மற்றும் குறுகிய ஐசோஃபார்ம்களுக்கு இடையிலான சமநிலை இறுதியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கின் பராமரிப்பில் OPA1 இன் பங்கை தீர்மானிக்கிறது64. DRP1 செயல்பாடு கால்சியம்/கால்மோடுலின் சார்ந்த புரத கைனேஸ் II (CaMKII) பாஸ்போரிலேஷன் மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் DRP1 சிதைவு எபிக்விடினேஷன் மற்றும் SUMOylation65 மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. இறுதியாக, DRP1 மற்றும் MFN1/2 இரண்டும் GTPases ஆகும், எனவே செயல்பாடு மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் GTP உற்பத்தி விகிதத்தால் பாதிக்கப்படலாம் 66. எனவே, இந்த புரதங்களின் வெளிப்பாடு மாறாமல் இருந்தாலும், இது மாறாத புரத செயல்பாடு அல்லது உள்ளூர்மயமாக்கலை பிரதிபலிக்காமல் போகலாம்67,68. உண்மையில், ஏற்கனவே உள்ள PTM புரதத் தொகுப்புகள் பெரும்பாலும் கடுமையான அழுத்த பதில்களை மத்தியஸ்தம் செய்வதற்குப் பொறுப்பான முதல் வரிசையாகச் செயல்படுகின்றன. எங்கள் மாதிரியில் மிதமான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்தின் முன்னிலையில், mRNA அல்லது புரத மட்டத்தில் இந்த மரபணுக்களின் கூடுதல் செயல்படுத்தல் தேவையில்லாமல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஒருமைப்பாட்டை போதுமான அளவு மீட்டெடுக்க PTM இணைவு மற்றும் பிளவு புரதங்களின் அதிகரித்த செயல்பாட்டை ஊக்குவிக்கும் என்று தெரிகிறது.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், மேலே உள்ள தரவுகள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலின் சிக்கலான மற்றும் நேரத்தைச் சார்ந்த ஒழுங்குமுறையையும் இந்த வழிமுறைகளை தெளிவுபடுத்துவதில் உள்ள சவால்களையும் எடுத்துக்காட்டுகின்றன. மரபணு வெளிப்பாட்டைப் படிக்க, பாதையில் குறிப்பிட்ட இலக்கு மரபணுக்களை அடையாளம் காண்பது முதலில் அவசியம். இருப்பினும், ஒரே பாதையில் உள்ள மரபணுக்கள் ஒரே மன அழுத்தத்திற்கு ஒரே மாதிரியாக பதிலளிப்பதில்லை என்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது. உண்மையில், முந்தைய ஆய்வுகள் ஒரே பாதையில் உள்ள வெவ்வேறு மரபணுக்கள் வெவ்வேறு தற்காலிக மறுமொழி சுயவிவரங்களைக் காட்டக்கூடும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. கூடுதலாக, டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் மரபணு செயல்பாட்டிற்கு இடையிலான உறவை சீர்குலைக்கும் சிக்கலான பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் வழிமுறைகள் உள்ளன. புரோட்டியோமிக் ஆய்வுகள் PTMகள் மற்றும் புரதச் செயல்பாட்டின் தாக்கம் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்க முடியும், ஆனால் அவை குறைந்த-செயல்திறன் முறைகள், அதிக சமிக்ஞை-இரைச்சல் விகிதங்கள் மற்றும் மோசமான தெளிவுத்திறன் உள்ளிட்ட சவால்களையும் முன்வைக்கின்றன.
இந்த சூழலில், TEM மற்றும் MEL ஐப் பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலைப் படிப்பது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மற்றும் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவு மற்றும் இது நோயை எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பது பற்றிய அடிப்படை கேள்விகளுக்கு தீர்வு காண பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டுள்ளது. மிக முக்கியமாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு மற்றும் இயக்கவியலின் ஒரு குவிந்த முனைப்புள்ளியாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியலை அளவிடுவதற்கான நேரடி முறையை TEM வழங்குகிறது. முப்பரிமாண செல்லுலார் சூழலில் பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளைக் காட்சிப்படுத்துவதற்கான நேரடி முறையை MEL வழங்குகிறது, இது மரபணு வெளிப்பாட்டில் மாற்றங்கள் இல்லாதபோதும் டைனமிக் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மறுவடிவமைப்பை அளவிட அனுமதிக்கிறது33. இரண்டாம் நிலை மைட்டோகாண்ட்ரியல் நோய்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இமேஜிங் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை இங்கே நாம் எடுத்துக்காட்டுகிறோம். இந்த நோய்கள் பொதுவாக கடுமையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் சேதத்தை விட மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளின் நுட்பமான மறுவடிவமைப்பால் வகைப்படுத்தப்படும் நாள்பட்ட லேசான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்தால் வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், நாள்பட்ட அழுத்தத்தின் கீழ் மைட்டோசிஸைப் பராமரிக்கத் தேவையான மைட்டோகாண்ட்ரியல் இழப்பீடு ஆழமான செயல்பாட்டு விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது. நரம்பியல் அறிவியலின் சூழலில், இந்த ஈடுசெய்யும் வழிமுறைகளைப் பற்றிய சிறந்த புரிதல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்புடன் தொடர்புடைய ப்ளியோட்ரோபிக் நரம்பியல் நோயியல் பற்றிய முக்கியமான தகவல்களை வழங்கக்கூடும்.
இறுதியாக, மரபணு வெளிப்பாடு, புரத மாற்றங்கள் மற்றும் நியூரான் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்தும் புரதச் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சிக்கலான தொடர்புகளின் செயல்பாட்டு விளைவுகளைப் புரிந்துகொள்வதற்கான இமேஜிங் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை எங்கள் தரவு எடுத்துக்காட்டுகிறது. ASD இன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் கூறு பற்றிய நுண்ணறிவைப் பெற, ஒரு நியூரான் செல் மாதிரியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பை மாதிரியாக்க PPA ஐப் பயன்படுத்தினோம். PPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SH-SY5Y செல்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பில் மாற்றங்களைக் காட்டின: மைட்டோகாண்ட்ரியா சிறியதாகவும் வட்டமாகவும் மாறியது, மேலும் TEM ஆல் கவனிக்கப்பட்டபோது கிறிஸ்டே மோசமாக வரையறுக்கப்பட்டது. லேசான வளர்சிதை மாற்ற அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்கைப் பராமரிக்க பிளவு மற்றும் இணைவு நிகழ்வுகளின் அதிகரிப்புடன் இந்த மாற்றங்கள் ஒரே நேரத்தில் நிகழ்கின்றன என்பதை MEL பகுப்பாய்வு காட்டுகிறது. மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் ஹோமியோஸ்டாசிஸின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையை PPA கணிசமாக சீர்குலைக்கிறது. PPA அழுத்தத்தால் சீர்குலைக்கப்பட்ட முக்கிய மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டுப்பாட்டாளர்களாக cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றை நாங்கள் அடையாளம் கண்டுள்ளோம், மேலும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் செயல்பாட்டில் PPA- தூண்டப்பட்ட மாற்றங்களை மத்தியஸ்தம் செய்வதில் பங்கு வகிக்கலாம். மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் புரத செயல்பாடு, உள்ளூர்மயமாக்கல் மற்றும் மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய மாற்றங்களில் PPA- தூண்டப்பட்ட தற்காலிக மாற்றங்களை சிறப்பாக வகைப்படுத்த எதிர்கால ஆய்வுகள் தேவை. எங்கள் தரவு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் அழுத்த பதிலை மத்தியஸ்தம் செய்யும் ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளின் சிக்கலான தன்மை மற்றும் ஒன்றுக்கொன்று சார்ந்திருப்பதை எடுத்துக்காட்டுகிறது மற்றும் அதிக இலக்கு வைக்கப்பட்ட இயந்திர ஆய்வுகளுக்கு TEM மற்றும் பிற இமேஜிங் நுட்பங்களின் பயன்பாட்டை நிரூபிக்கிறது.
SH-SY5Y செல் வரிசை (ECACC, 94030304-1VL) சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்சிலிருந்து வாங்கப்பட்டது. SH-SY5Y செல்கள் டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் மீடியம்/F-12 ஊட்டச்சத்து கலவையில் (DMEM/F-12) மற்றும் L-குளுட்டமைன் (SC09411, ScienCell) 25 செ.மீ2 பிளாஸ்க்குகளில் 20% கரு போவின் சீரம் (FBS) (10493106, தெர்மோஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 1% பென்சிலின்-ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (P4333-20ML, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) ஆகியவற்றுடன் 37 °C, 5% CO2 இல் வளர்க்கப்பட்டன. செல்கள் 0.05% டிரிப்சின்-EDTA (15400054, தெர்மோஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி 80% சங்கமத்திற்கு துணை வளர்ப்பு செய்யப்பட்டன, 300 கிராம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு தோராயமாக 7 × 105 செல்கள்/மிலி அடர்த்தியில் பூசப்பட்டன. அனைத்து சோதனைகளும் 19–22 பத்திகளுக்கு இடையில் வேறுபடுத்தப்படாத SH-SY5Y செல்களில் செய்யப்பட்டன. PPA NaP ஆக நிர்வகிக்கப்படுகிறது. NaP தூளை (CAS எண். 137-40-6, வேதியியல் சூத்திரம் C3H5NaO2, P5436-100G, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சூடான மில்லிக்யூ நீரில் 1 M செறிவுக்கு கரைத்து 4 °C இல் சேமிக்கவும். சிகிச்சையின் நாளில், இந்த கரைசலை 1 M PPA உடன் 3 mM மற்றும் 5 mM PPA உடன் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் (L-குளுட்டமைனுடன் DMEM/F-12) நீர்த்துப்போகச் செய்யுங்கள். அனைத்து பரிசோதனைகளுக்கும் சிகிச்சை செறிவுகள் PPA இல்லை (0 mM, கட்டுப்பாடு), 3 mM, மற்றும் 5 mM PPA. குறைந்தது மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் பரிசோதனைகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன.
SH-SY5Y செல்கள் 25 செ.மீ5 பிளாஸ்க்குகளாக 5.5 × 105 செல்கள்/மிலி என்ற விகிதத்தில் விதைக்கப்பட்டு 24 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன. PPA சிகிச்சை 24 மணிநேர அடைகாக்கும் முன் பிளாஸ்க்கில் சேர்க்கப்பட்டது. சாதாரண பாலூட்டி திசு துணை வளர்ப்பு நெறிமுறைகளைப் பின்பற்றி செல் துகள்களை சேகரிக்கவும் (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளது). செல் துகள்களை 100 µl 2.5% குளுடரால்டிஹைடு, 1× PBS இல் மீண்டும் சேர்த்து, செயலாக்கம் வரை 4 °C இல் சேமிக்கவும். SH-SY5Y செல்கள் சுருக்கமாக மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு செல்களைத் துகள்களாக மாற்றி 2.5% குளுடரால்டிஹைடு, 1× PBS கரைசலை அகற்றின. காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் தயாரிக்கப்பட்ட 4% அகரோஸ் ஜெல்லில் வண்டலை மீண்டும் சேர்த்து வைக்கவும் (அகரோஸின் விகிதம் மற்றும் வண்டல் அளவு 1:1). அகரோஸ் துண்டுகள் தட்டையான தட்டுகளில் கட்டங்களில் வைக்கப்பட்டு, உயர் அழுத்த உறைபனிக்கு முன் 1-ஹெக்ஸாடெசீனுடன் பூசப்பட்டன. மாதிரிகள் 100% உலர் அசிட்டோனில் -90°C இல் 24 மணி நேரம் உறைந்தன. பின்னர் வெப்பநிலை -80°C ஆக உயர்த்தப்பட்டு, 1% ஆஸ்மியம் டெட்ராக்சைடு மற்றும் 0.1% குளுடரால்டிஹைடு கரைசல் சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரிகள் -80°C இல் 24 மணி நேரம் சேமிக்கப்பட்டன. இதற்குப் பிறகு, வெப்பநிலை பல நாட்களில் படிப்படியாக அறை வெப்பநிலைக்கு அதிகரிக்கப்பட்டது: 24 மணி நேரத்திற்கு – 80°C இலிருந்து – 50°C ஆகவும், 24 மணி நேரத்திற்கு – 30°C ஆகவும், 24 மணி நேரத்திற்கு – 10°C ஆகவும், இறுதியாக அறை வெப்பநிலைக்கு அதிகரிக்கப்பட்டது. வெப்பநிலை.
கிரையோஜெனிக் தயாரிப்பிற்குப் பிறகு, மாதிரிகள் பிசினுடன் செறிவூட்டப்பட்டு, லைக்கா ரீச்சர்ட் அல்ட்ராகட்ஸ் அல்ட்ராமைக்ரோடோமை (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தி மிக மெல்லிய பிரிவுகள் (~100 nm) செய்யப்பட்டன. பிரிவுகள் 2% யுரேனைல் அசிடேட் மற்றும் ஈய சிட்ரேட்டால் கறை படிந்தன. 200 kV (Lab6 டிரான்ஸ்மிட்டர்) இல் இயங்கும் FEI Tecnai 20 டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி (தெர்மோஃபிஷர் (முன்னர் FEI), ஐன்ட்ஹோவன், நெதர்லாந்து) மற்றும் ட்ரைடியம் எனர்ஜி ஃபில்டருடன் பொருத்தப்பட்ட கட்டான் CCD கேமரா (கட்டான், UK) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மாதிரிகள் காணப்பட்டன.
ஒவ்வொரு தொழில்நுட்ப பிரதியிலும், மொத்தம் 266 படங்களுக்கு குறைந்தது 24 ஒற்றை செல் படங்கள் பெறப்பட்டன. அனைத்து படங்களும் ஆர்வமுள்ள பகுதி (ROI) மேக்ரோ மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியா மேக்ரோவைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மைட்டோகாண்ட்ரியல் மேக்ரோ வெளியிடப்பட்ட முறைகளை அடிப்படையாகக் கொண்டது 17,31,32 மேலும் பிஜி/இமேஜ்ஜே69 இல் TEM படங்களின் அரை தானியங்கி தொகுதி செயலாக்கத்தை அனுமதிக்கிறது. சுருக்கமாக: உருட்டல் பந்து பின்னணி கழித்தல் (60 பிக்சல் ஆரம்) மற்றும் ஒரு FFT பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டி (முறையே 60 மற்றும் 8 பிக்சல் மேல் மற்றும் கீழ் எல்லைகளைப் பயன்படுத்தி) மற்றும் 5% நோக்குநிலை சகிப்புத்தன்மையுடன் செங்குத்து கோடு ஒடுக்கம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி படம் தலைகீழாகவும் தலைகீழாகவும் மாற்றப்படுகிறது. பதப்படுத்தப்பட்ட படம் அதிகபட்ச என்ட்ரோபி வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி தானாகவே வரம்பில் உள்ளது மற்றும் ஒரு பைனரி முகமூடி உருவாக்கப்படுகிறது. மூல TEM படங்களில் கைமுறையாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ROIகளுடன் தொடர்புடைய படப் பகுதிகள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன, மைட்டோகாண்ட்ரியாவை வகைப்படுத்தி பிளாஸ்மா சவ்வு மற்றும் பிற உயர்-மாறுபாடு பகுதிகளைத் தவிர்த்துவிட்டன. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு ROIக்கும், 600 பிக்சல்களுக்கு மேல் உள்ள பைனரி துகள்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, மேலும் துகள் பரப்பளவு, சுற்றளவு, பெரிய மற்றும் சிறிய அச்சுகள், ஃபெரெட் விட்டம், வட்டத்தன்மை மற்றும் வட்டத்தன்மை ஆகியவை Fiji/ImageJ இன் உள்ளமைக்கப்பட்ட அளவீட்டு செயல்பாடுகளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன. Merrill, Flippo மற்றும் Strack (2017) ஐத் தொடர்ந்து, பகுதி 2, துகள் விகித விகிதம் (பெரிய மற்றும் சிறிய அச்சு விகிதம்) மற்றும் வடிவ காரணி (FF) ஆகியவை இந்தத் தரவுகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டன, இங்கு FF = சுற்றளவு 2/4pi x பரப்பளவு. அளவுரு சூத்திரத்தின் வரையறையை Merrill, Flippo மற்றும் Strack (2017) இல் காணலாம். குறிப்பிடப்பட்ட மேக்ரோக்கள் GitHub இல் கிடைக்கின்றன (தரவு கிடைக்கும் அறிக்கையைப் பார்க்கவும்). சராசரியாக, PPA சிகிச்சைக்கு தோராயமாக 5,600 துகள்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, மொத்தம் தோராயமாக 17,000 துகள்கள் (தரவு காட்டப்படவில்லை).
SH-SH5Y செல்கள் 8-அறை கலாச்சார உணவுகளில் (ThermoFisher, #155411) வைக்கப்பட்டு, இரவு முழுவதும் ஒட்டுதலை அனுமதிக்கும் வகையில் அமைக்கப்பட்டன, பின்னர் TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) மற்றும் Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ஆகியவற்றால் அடைகாக்கப்பட்டன. சாயமிடுதல். 10 நிமிட சூழலில் 405 nm மற்றும் 561 nm லேசர்களைப் பயன்படுத்தி படங்கள் பெறப்பட்டன, மேலும் 12 அடுத்தடுத்த நேரப் புள்ளிகளில் படச் சட்டங்களுக்கு இடையில் 0.2 μm az படியுடன் 10 பட மைக்ரோகிராஃப்களைக் கொண்ட z-அடுக்குகளாக மூலப் படங்கள் பெறப்பட்டன. LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 லென்ஸைப் பயன்படுத்தி கார்ல் ஜெய்ஸ் LSM780 ELYRA PS.1 சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் தளத்தைப் (கார்ல் ஜெய்ஸ், ஓபர்கோசென், ஜெர்மனி) பயன்படுத்தி படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன. இணைவு மற்றும் பிளவு நிகழ்வுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியல் கட்டமைப்புகளின் சராசரி எண்ணிக்கை மற்றும் ஒரு கலத்திற்கு சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவு ஆகியவற்றை அளவிட, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட பைப்லைன் மற்றும் ImageJ செருகுநிரலைப் பயன்படுத்தி ImageJ இல் படங்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன33. MEL மேக்ரோக்கள் GitHub இல் கிடைக்கின்றன (தரவு கிடைக்கும் அறிக்கையைப் பார்க்கவும்).
சிகிச்சைக்கு முன் 24 மணி நேரத்திற்கு 0.3 × 106 செல்கள்/மிலி அடர்த்தியில் ஆறு கிணறு தகடுகளில் SH-SY5Y செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன. சிறிய மாற்றங்களுடன் Quick-RNA™ Miniprep நெறிமுறையைப் (ZR R1055, Zymo Research) பயன்படுத்தி RNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டது: அகற்றுவதற்கு முன் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 300 μl RNA லிசிஸ் பஃபரைச் சேர்த்து, 30 μl DNase/RNase எலுஷனுடன் இறுதிப் படியாக ஒவ்வொரு மாதிரியையும் லைஸ் செய்யவும். -இலவச நீர். அனைத்து மாதிரிகளும் NanoDrop ND-1000 UV-Vis ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி அளவு மற்றும் தரத்திற்காக சரிபார்க்கப்பட்டன. செல் லைசேட்டுகளிலிருந்து மொத்த புரதம் 200 μl RIPA லிசிஸ் பஃபரைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்டது, மேலும் புரத செறிவு பிராட்ஃபோர்டு புரத மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது70.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, சில மாற்றங்களுடன் டெட்ரோ™ cDNA தொகுப்பு கருவியைப் (BIO-65043, மெரிடியன் பயோசயின்ஸ்) பயன்படுத்தி cDNA தொகுப்பு செய்யப்பட்டது. மொத்த RNA இன் 0.7 முதல் 1 μg வரை பயன்படுத்தி 20-μl எதிர்வினைகளில் cDNA ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. முன்னர் வெளியிடப்பட்ட ஆவணங்கள் 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (அட்டவணை S1) இலிருந்து ப்ரைமர்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, மேலும் அதனுடன் தொடர்புடைய ஆய்வுகள் ஒருங்கிணைந்த DNA தொழில்நுட்பங்களிலிருந்து பிரைமர்குவெஸ்ட் கருவியைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. ஆர்வமுள்ள அனைத்து மரபணுக்களும் அணு B2M மரபணுவிற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC மற்றும் OPA1 ஆகியவற்றின் மரபணு வெளிப்பாடு RT-qPCR ஆல் அளவிடப்பட்டது. மாஸ்டர் கலவையில் LUNA Taq பாலிமரேஸ் (M3003L, நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்), 10 μM முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் ப்ரைமர்கள், cDNA மற்றும் PCR-தர நீர் ஆகியவை அடங்கும், இதனால் ஒவ்வொரு வினைக்கும் 10 μL இறுதி அளவு கிடைக்கும். பிரிவு மற்றும் பிளவு மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு (DRP1, MFN1/2) TaqMan மல்டிபிளக்ஸ் மதிப்பீடுகளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. லூனா யுனிவர்சல் ப்ரோப் qPCR மாஸ்டர் மிக்ஸ் (M3004S, நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி சிறிய மாற்றங்களுடன் பயன்படுத்தப்பட்டது. மல்டிபிளக்ஸ் RT-qPCR மாஸ்டர் கலவையில் 1X LUNA Taq பாலிமரேஸ், 10 μM முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் ப்ரைமர்கள், 10 μM ப்ரோப், cDNA மற்றும் PCR-தர நீர் ஆகியவை அடங்கும், இதன் விளைவாக ஒவ்வொரு வினைக்கும் 20 μL இறுதி அளவு கிடைத்தது. RT-qPCR ரோட்டார்-ஜீன் Q 6-பிளெக்ஸ் (QIAGEN RG—தொடர் எண்: R0618110) ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. சைக்கிள் ஓட்டுதல் நிலைமைகள் அட்டவணை S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. அனைத்து cDNA மாதிரிகளும் மும்மடங்காகப் பெருக்கப்பட்டு, பத்து மடங்கு நீர்த்தல்களின் தொடரைப் பயன்படுத்தி ஒரு நிலையான வளைவு உருவாக்கப்பட்டது. தரவு மறுஉருவாக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக சுழற்சி வரம்பு நிலையான விலகல் (Ct) >0.5 கொண்ட மும்மடங்க மாதிரிகளில் உள்ள வெளிப்புறங்கள் பகுப்பாய்விலிருந்து அகற்றப்பட்டன30,72. தொடர்புடைய மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCt79 முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.
புரத மாதிரிகள் (60 μg) 2:1 விகிதத்தில் லேம்லி ஏற்றுதல் இடையகத்துடன் கலக்கப்பட்டு 12% நிறமற்ற புரத ஜெல்லில் (பயோ-ராட் #1610184) இயக்கப்பட்டன. டிரான்ஸ்-பிளாட் டர்போ அமைப்பைப் (#170-4155, பயோ-ராட்) பயன்படுத்தி புரதங்கள் PVDF (பாலிவினைலைடின் ஃப்ளோரைடு) சவ்வுக்கு (#170-84156, பயோ-ராட்) மாற்றப்பட்டன. சவ்வு தடுக்கப்பட்டு பொருத்தமான முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் (OPA1, MFN1, MFN2, மற்றும் DRP1) (1:1000 நீர்த்த) 48 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் (1:10,000) 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர் சவ்வுகள் கிளாரிட்டி வெஸ்டர்ன் ECL அடி மூலக்கூறு (#170-5061, பயோ-ராட்) பயன்படுத்தி படமாக்கப்பட்டன மற்றும் பயோ-ராட் கெமிடாக் MP அமைப்பைப் பயன்படுத்தி பதிவு செய்யப்பட்டன. இமேஜ்லேப் பதிப்பு 6.1 வெஸ்டர்ன் ப்ளாட் பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. அசல் ஜெல் மற்றும் ப்ளாட் படம் S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. ஆன்டிபாடி தகவல் அட்டவணை S2 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளது.
குறைந்தபட்சம் மூன்று சுயாதீன மாதிரிகளின் சராசரி (SEM) இன் சராசரி மற்றும் நிலையான பிழையாக தரவுத் தொகுப்புகள் வழங்கப்படுகின்றன. காஸியன் பரவல் மற்றும் சமமான நிலையான விலகல்களை அனுமானித்து பகுப்பாய்வுகளுடன் தொடர்வதற்கு முன், ஷாபிரோ-வில்க்ஸ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி தரவுத் தொகுப்புகள் இயல்பான தன்மைக்காக சோதிக்கப்பட்டன (வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால்). ஃபிஷரின் MEL LSD (p < 0.05), ஒரு வழி ANOVA (சிகிச்சை vs. கட்டுப்பாட்டு சராசரி) மற்றும் முக்கியத்துவத்தை தீர்மானிக்க டன்னெட்டின் பல ஒப்பீட்டு சோதனை (p < 0.05) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி தரவுத் தொகுப்பை பகுப்பாய்வு செய்வதோடு கூடுதலாக. குறிப்பிடத்தக்க p மதிப்புகள் வரைபடத்தில் *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 என காட்டப்பட்டுள்ளன. அனைத்து புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வுகளும் வரைபடங்களும் கிராப்பேட் பிரிசம் 9.4.0 ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டன.
TEM பட பகுப்பாய்விற்கான Fiji/ImageJ மேக்ரோக்கள் GitHub இல் பொதுவில் கிடைக்கின்றன: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நிகழ்வு இருப்பிடம் (MEL) மேக்ரோ GitHub இல் பொதுவில் கிடைக்கின்றன: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
மெய்லியானா ஏ., தேவி என்.எம் மற்றும் விஜயா ஏ. மைட்டோகாண்ட்ரியா: வளர்சிதை மாற்றம், ஹோமியோஸ்டாஸிஸ், மன அழுத்தம், வயதானது மற்றும் எபிஜெனெடிக்ஸ் ஆகியவற்றின் முதன்மை கட்டுப்பாட்டாளர்கள். இந்தோனேசியன். உயிரி மருத்துவ அறிவியல். ஜே. 13, 221–241 (2021).
பென்-ஷாச்சர், டி. ஸ்கிசோஃப்ரினியாவில் பன்முக மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, சாத்தியமான நோயியல் இலக்காக சிக்கலான I. ஸ்கிசோஃப்ரினியா. ஆதாரம். 187, 3–10 (2017).
போஸ், ஏ. மற்றும் பீல், எம்.எஃப். பார்கின்சன் நோயில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு. ஜே. நியூரோ கெமிஸ்ட்ரி. 139, 216–231 (2016).
சர்மா வி.கே., சிங் டி.ஜி. மற்றும் மேத்தா வி. அழுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியா: அல்சைமர் நோயில் படையெடுப்பின் இலக்குகள். மைட்டோகாண்ட்ரியா 59, 48–57 (2021).
பெலெங்குவர் பி., டுவார்டே ஜேஎம்என், ஷூக் பிஎஃப் மற்றும் ஃபெரீரா ஜிகே மைட்டோகாண்ட்ரியா மற்றும் மூளை: பயோஎனெர்ஜிடிக்ஸ் மற்றும் பல. நியூரோடாக்சின்கள். வளம். 36, 219–238 (2019).
ரங்கராஜு, வி. மற்றும் பலர். ப்ளியோட்ரோபிக் மைட்டோகாண்ட்ரியா: நரம்பியல் வளர்ச்சி மற்றும் நோயில் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் தாக்கம். ஜே. நியூரோ சயின்ஸ். 39, 8200–8208 (2019).
கார்டானோ-ராமோஸ், சி. மற்றும் மொரைஸ், வி.ஏ. நியூரான்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஜெனீசிஸ்: எப்படி, எங்கே. சர்வதேசியம். ஜே. மோர். அறிவியல். 22, 13059 (2021).
யூ, ஆர்., லென்டால், யு., நிஸ்டர், எம். மற்றும் ஜாவோ, ஜே. பாலூட்டி மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலின் ஒழுங்குமுறை: வாய்ப்புகள் மற்றும் சவால்கள். முன். நாளமில்லா சுரப்பி. (லாசேன்) 11, 374 (2020).
காச்சோ, எம். மற்றும் ஸ்லாக், ஆர்.எஸ். நியூரோஜெனீசிஸை ஒழுங்குபடுத்துவதில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டைனமிக்ஸ்: வளரும் மூளையிலிருந்து வயதுவந்தோர் மூளை வரை. வளர்ச்சி. டைனமிக். 247, 47–53 (2018).