இந்தக் கட்டுரை "நோய்க்கிருமிகள் மற்றும் பூச்சிகளுக்கு பயறு வகைகளின் எதிர்ப்பை மேம்படுத்துதல்" என்ற ஆராய்ச்சி தலைப்பின் ஒரு பகுதியாகும், அனைத்து 5 கட்டுரைகளையும் காண்க.
பூஞ்சை தாவர நோய் நெக்ரோசிஸின் காரணகர்த்தாவான ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் (லிப்.) டி பாரி, பல்வேறு ஹோஸ்ட் தாவரங்களைப் பாதிக்க பல அடுக்கு உத்தியைப் பயன்படுத்துகிறார். சூடோமோனாஸ் ஸ்க்லெரோட்டியோரமால் ஏற்படும் வெள்ளை பூஞ்சைக்கு ஃபேசோலஸ் வல்காரிஸ் எல். இன் மூலக்கூறு, உடலியல் மற்றும் உயிர்வேதியியல் பதில்களை மேம்படுத்துவதற்கான மாற்று மேலாண்மை உத்தியாக, பிற அத்தியாவசிய அமினோ அமிலங்களின் தொகுப்பைத் தூண்டும் புரதம் அல்லாத அமினோ அமிலமான டைமின் எல்-ஆர்னிதினைப் பயன்படுத்த இந்த ஆய்வு முன்மொழிகிறது. இன் விட்ரோ சோதனைகளில், எல்-ஆர்னிதின், அளவைச் சார்ந்த முறையில் எஸ். பைரினாய்டோசாவின் மைசீலிய வளர்ச்சியைக் கணிசமாகத் தடுப்பதாகக் காட்டியது. மேலும், கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் வெள்ளை பூஞ்சையின் தீவிரத்தை இது கணிசமாகக் குறைக்கலாம். மேலும், எல்-ஆர்னிதின் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் வளர்ச்சியைத் தூண்டியது, இது எல்-ஆர்னிதினின் சோதிக்கப்பட்ட செறிவுகள் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களுக்கு பைட்டோடாக்ஸிக் அல்ல என்பதைக் குறிக்கிறது. கூடுதலாக, எல்-ஆர்னிதைன் நொதி அல்லாத ஆக்ஸிஜனேற்றிகள் (மொத்த கரையக்கூடிய பீனாலிக்ஸ் மற்றும் ஃபிளாவனாய்டுகள்) மற்றும் நொதி ஆக்ஸிஜனேற்றிகள் (கேடலேஸ் (CAT), பெராக்ஸிடேஸ் (POX), மற்றும் பாலிபீனால் ஆக்சிடேஸ் (PPO)) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டை மேம்படுத்தியது, மேலும் மூன்று ஆக்ஸிஜனேற்ற-தொடர்புடைய மரபணுக்களின் (PvCAT1, PvSOD, மற்றும் PvGR) வெளிப்பாட்டை அதிகரித்தது. மேலும், சிலிகோ பகுப்பாய்வில் S. ஸ்க்லரோட்டியோரம் மரபணுவில் ஒரு உத்வேக ஆக்சலோஅசெட்டேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (SsOAH) புரதம் இருப்பதை வெளிப்படுத்தியது, இது செயல்பாட்டு பகுப்பாய்வு, பாதுகாக்கப்பட்ட களங்கள் மற்றும் இடவியல் அடிப்படையில் ஆஸ்பெர்கிலஸ் ஃபிஜியென்சிஸ் (AfOAH) மற்றும் பென்சிலியம் sp. (PlOAH) ஆகியவற்றின் ஆக்சலோஅசெட்டேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (SsOAH) புரதங்களுடன் மிகவும் ஒத்திருந்தது. சுவாரஸ்யமாக, உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பு (PDB) ஊடகத்தில் L-ஆர்னிதைனைச் சேர்ப்பது S. ஸ்க்லரோட்டியோரம் மைசீலியாவில் SsOAH மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. இதேபோல், சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட பூஞ்சை மைசீலியாவில் L-ஆர்னிதைனின் வெளிப்புற பயன்பாடு SsOAH மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. இறுதியாக, PDB நடுத்தர மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட இலைகள் இரண்டிலும் L-ஆர்னிதைன் பயன்பாடு ஆக்ஸாலிக் அமில சுரப்பைக் கணிசமாகக் குறைத்தது. முடிவில், பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் ரெடாக்ஸ் நிலையைப் பராமரிப்பதிலும், பாதுகாப்பு மறுமொழியை மேம்படுத்துவதிலும் L-ஆர்னிதைன் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது. இந்த ஆய்வின் முடிவுகள் வெள்ளை பூஞ்சையைக் கட்டுப்படுத்தவும், பீன்ஸ் உற்பத்தி மற்றும் பிற பயிர்களில் அதன் தாக்கத்தைக் குறைக்கவும் புதுமையான, சுற்றுச்சூழலுக்கு உகந்த முறைகளை உருவாக்க உதவக்கூடும்.
ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் (லிப்.) டி பாரி என்ற நெக்ரோட்ரோபிக் பூஞ்சையால் ஏற்படும் வெள்ளை பூஞ்சை, ஒரு பேரழிவு தரும், மகசூலைக் குறைக்கும் நோயாகும், இது உலகளாவிய பீன்ஸ் (ஃபேசியோலஸ் வல்காரிஸ் எல்.) உற்பத்திக்கு கடுமையான அச்சுறுத்தலை ஏற்படுத்துகிறது (போல்டன் மற்றும் பலர்., 2006). ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் என்பது மண்ணில் பரவும் பூஞ்சை தாவர நோய்க்கிருமிகளில் ஒன்றாகும், இது 600 க்கும் மேற்பட்ட தாவர இனங்களின் பரந்த அளவிலான ஹோஸ்ட் வரம்பையும், குறிப்பிட்ட அல்லாத முறையில் ஹோஸ்ட் திசுக்களை விரைவாக மெருகேற்றும் திறனையும் கொண்டுள்ளது (லியாங் மற்றும் ரோலின்ஸ், 2018). சாதகமற்ற சூழ்நிலைகளில், இது அதன் வாழ்க்கைச் சுழற்சியின் ஒரு முக்கியமான கட்டத்திற்கு உட்படுகிறது, மண்ணில் 'ஸ்க்லெரோட்டியா' எனப்படும் கருப்பு, கடினமான, விதை போன்ற அமைப்புகளாக அல்லது பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் மைசீலியம் அல்லது தண்டு குழியில் வெள்ளை, பஞ்சுபோன்ற வளர்ச்சிகளாக நீண்ட காலத்திற்கு செயலற்ற நிலையில் உள்ளது (ஸ்க்வார்ட்ஸ் மற்றும் பலர்., 2005). S. sclerotiorum ஸ்க்லெரோட்டியாவை உருவாக்கும் திறன் கொண்டது, இது பாதிக்கப்பட்ட வயல்களில் நீண்ட காலத்திற்கு உயிர்வாழவும், நோயின் போது நிலைத்திருக்கவும் அனுமதிக்கிறது (Schwartz et al., 2005). ஸ்க்லெரோட்டியா ஊட்டச்சத்துக்கள் நிறைந்தது, நீண்ட காலத்திற்கு மண்ணில் நிலைத்திருக்கும், மேலும் அடுத்தடுத்த தொற்றுகளுக்கு முதன்மை இனோகுலமாக செயல்படுகிறது (Schwartz et al., 2005). சாதகமான சூழ்நிலையில், ஸ்க்லெரோட்டியா முளைத்து காற்றில் பரவும் வித்துகளை உருவாக்குகிறது, அவை பூக்கள், தண்டுகள் அல்லது காய்கள் உட்பட தாவரத்தின் அனைத்து தரைக்கு மேலே உள்ள பகுதிகளையும் பாதிக்கலாம் (Schwartz et al., 2005).
ஸ்க்லரோட்டினியா ஸ்க்லரோட்டியோரம் அதன் புரவலன் தாவரங்களைப் பாதிக்க பல அடுக்கு உத்தியைப் பயன்படுத்துகிறது, இதில் ஸ்க்லரோஷிய முளைப்பு முதல் அறிகுறி வளர்ச்சி வரை தொடர்ச்சியான ஒருங்கிணைந்த நிகழ்வுகள் அடங்கும். ஆரம்பத்தில், எஸ். ஸ்க்லரோட்டியோரம் அப்போதீசியா எனப்படும் காளான் போன்ற அமைப்புகளிலிருந்து இடைநீக்கம் செய்யப்பட்ட வித்துகளை (அஸ்கோஸ்போர்கள் என்று அழைக்கப்படுகிறது) உருவாக்குகிறது, அவை காற்றில் பரவி பாதிக்கப்பட்ட தாவர குப்பைகளில் அசையாத ஸ்க்லரோட்டியாவாக உருவாகின்றன (போல்டன் மற்றும் பலர், 2006). பின்னர் பூஞ்சை ஆக்ஸாலிக் அமிலத்தை சுரக்கிறது, இது ஒரு வைரஸ் காரணியாகும், இது தாவர செல் சுவர் pH ஐக் கட்டுப்படுத்தவும், நொதிச் சிதைவு மற்றும் திசு படையெடுப்பை ஊக்குவிக்கவும் (ஹெகெடஸ் மற்றும் ரிம்மர், 2005), மற்றும் புரவலன் தாவரத்தின் ஆக்ஸிஜனேற்ற வெடிப்பை அடக்கவும் செய்கிறது. இந்த அமிலமயமாக்கல் செயல்முறை தாவர செல் சுவரை பலவீனப்படுத்துகிறது, பூஞ்சை செல் சுவர் சிதைக்கும் நொதிகளின் (CWDEs) இயல்பான மற்றும் திறமையான செயல்பாட்டிற்கு சாதகமான சூழலை வழங்குகிறது, இதனால் நோய்க்கிருமி உடல் தடையை கடந்து புரவலன் திசுக்களில் ஊடுருவ அனுமதிக்கிறது (மார்சியானோ மற்றும் பலர், 1983). ஊடுருவியவுடன், S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் பாலிகேலக்டுரோனேஸ் மற்றும் செல்லுலேஸ் போன்ற பல CWDE களை சுரக்கிறது, இது பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களில் அதன் பரவலை எளிதாக்குகிறது மற்றும் திசு நெக்ரோசிஸை ஏற்படுத்துகிறது. புண்கள் மற்றும் ஹைபல் மேட்களின் முன்னேற்றம் வெள்ளை பூஞ்சையின் சிறப்பியல்பு அறிகுறிகளுக்கு வழிவகுக்கிறது (ஹெகெடஸ் மற்றும் ரிம்மர், 2005). இதற்கிடையில், புரவலன் தாவரங்கள் வடிவ அங்கீகார ஏற்பிகள் (PRRs) மூலம் நோய்க்கிருமி-தொடர்புடைய மூலக்கூறு வடிவங்களை (PAMPs) அங்கீகரிக்கின்றன, இது இறுதியில் பாதுகாப்பு பதில்களை செயல்படுத்தும் தொடர்ச்சியான சமிக்ஞை நிகழ்வுகளைத் தூண்டுகிறது.
பல தசாப்தங்களாக நோய் கட்டுப்பாட்டு முயற்சிகள் இருந்தபோதிலும், நோய்க்கிருமியின் எதிர்ப்பு, உயிர்வாழ்வு மற்றும் தகவமைப்புத் திறன் காரணமாக, மற்ற வணிகப் பயிர்களைப் போலவே, பீன்ஸிலும் போதுமான எதிர்ப்புத் திறன் கொண்ட ஜெர்ம்பிளாசம் பற்றாக்குறை உள்ளது. எனவே நோய் மேலாண்மை மிகவும் சவாலானது மற்றும் கலாச்சார நடைமுறைகள், உயிரியல் கட்டுப்பாடு மற்றும் இரசாயன பூஞ்சைக் கொல்லிகளின் கலவையை உள்ளடக்கிய ஒருங்கிணைந்த, பன்முக உத்தி தேவைப்படுகிறது (ஓ'சல்லிவன் மற்றும் பலர், 2021). வெள்ளை பூஞ்சையின் வேதியியல் கட்டுப்பாடு மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கிறது, ஏனெனில் பூஞ்சைக் கொல்லிகள், சரியாகவும் சரியான நேரத்திலும் பயன்படுத்தப்படும்போது, ​​நோயின் பரவலை திறம்பட கட்டுப்படுத்தலாம், நோய்த்தொற்றின் தீவிரத்தைக் குறைக்கலாம் மற்றும் மகசூல் இழப்புகளைக் குறைக்கலாம். இருப்பினும், அதிகப்படியான பயன்பாடு மற்றும் பூஞ்சைக் கொல்லிகளை அதிகமாக நம்பியிருப்பது S. ஸ்க்லெரோட்டியோரமின் எதிர்ப்புத் திறன் கொண்ட விகாரங்கள் தோன்றுவதற்கு வழிவகுக்கும் மற்றும் இலக்கு அல்லாத உயிரினங்கள், மண் ஆரோக்கியம் மற்றும் நீர் தரத்தை எதிர்மறையாக பாதிக்கும் (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). எனவே, சுற்றுச்சூழலுக்கு உகந்த மாற்றுகளைக் கண்டறிவது ஒரு முதன்மையான முன்னுரிமையாக மாறியுள்ளது.
புட்ரெசின், ஸ்பெர்மிடின், ஸ்பெர்மின் மற்றும் கேடவெரின் போன்ற பாலிஅமைன்கள் (PAs), மண்ணில் பரவும் தாவர நோய்க்கிருமிகளுக்கு எதிராக நம்பிக்கைக்குரிய மாற்றாகச் செயல்பட முடியும், இதன் மூலம் ஆபத்தான இரசாயன பூஞ்சைக் கொல்லிகளின் பயன்பாட்டை முழுமையாகவோ அல்லது பகுதியாகவோ குறைக்க முடியும் (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). உயர் தாவரங்களில், PAs செல் பிரிவு, வேறுபாடு மற்றும் அஜியோடிக் மற்றும் உயிரியல் அழுத்தங்களுக்கு எதிர்வினை (Killiny and Nehela, 2020) உள்ளிட்ட பல உடலியல் செயல்முறைகளில் ஈடுபட்டுள்ளன. அவை ஆக்ஸிஜனேற்றிகளாகச் செயல்படலாம், எதிர்வினை ஆக்ஸிஜன் இனங்களை (ROS) அகற்ற உதவலாம், ரெடாக்ஸ் ஹோமியோஸ்டாசிஸைப் பராமரிக்கலாம் (Nehela and Killiny, 2023), பாதுகாப்பு தொடர்பான மரபணுக்களைத் தூண்டலாம் (Romero et al., 2018), பல்வேறு வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளை ஒழுங்குபடுத்தலாம் (Nehela and Killiny, 2023), எண்டோஜெனஸ் பைட்டோஹார்மோன்களை மாற்றியமைக்கலாம் (Nehela and Killiny, 2019), முறையான பெறப்பட்ட எதிர்ப்பை (SAR) நிறுவலாம் மற்றும் தாவர-நோய்க்கிருமி தொடர்புகளை ஒழுங்குபடுத்தலாம் (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). தாவர பாதுகாப்பில் PA களின் குறிப்பிட்ட வழிமுறைகள் மற்றும் பாத்திரங்கள் தாவர இனங்கள், நோய்க்கிருமிகள் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் நிலைமைகளைப் பொறுத்து மாறுபடும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. தாவரங்களில் மிகுதியாக உள்ள PA, அத்தியாவசிய பாலிஅமைன் L-ornithine (Killiny and Nehela, 2020) இலிருந்து உயிரியக்க ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது.
தாவர வளர்ச்சி மற்றும் வளர்ச்சியில் எல்-ஆர்னிதைன் பல பங்கு வகிக்கிறது. எடுத்துக்காட்டாக, முந்தைய ஆய்வுகள் அரிசியில் (ஓரிசா சாடிவா), ஆர்னிதைன் நைட்ரஜன் மறுசுழற்சி (லியு மற்றும் பலர், 2018), அரிசி மகசூல், தரம் மற்றும் நறுமணம் (லு மற்றும் பலர், 2020), மற்றும் நீர் அழுத்த மறுமொழி (யாங் மற்றும் பலர், 2000) ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டுகின்றன. மேலும், எல்-ஆர்னிதைனின் வெளிப்புற பயன்பாடு சர்க்கரைவள்ளிக்கிழங்குகளில் (பீட்டா வல்காரிஸ்) (ஹுசைன் மற்றும் பலர், 2019) வறட்சி சகிப்புத்தன்மையை கணிசமாக மேம்படுத்தியது மற்றும் வெங்காயத்தில் (அல்லியம் செபா) (Çavuşoǧlu மற்றும் Çavuşoǧlu, 2021) மற்றும் முந்திரி (அனகார்டியம் ஆக்சிடென்டேல்) தாவரங்களில் (டா ரோச்சா மற்றும் பலர், 2012) உப்பு அழுத்தத்தைக் குறைத்தது. அஜியோடிக் அழுத்த பாதுகாப்பில் எல்-ஆர்னிதைனின் சாத்தியமான பங்கு, சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களில் புரோலின் குவிப்பில் அதன் ஈடுபாட்டின் காரணமாக இருக்கலாம். உதாரணமாக, ஆர்னிதைன் டெல்டா அமினோட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் (டெல்டா-OAT) மற்றும் புரோலைன் டீஹைட்ரஜனேஸ் (ProDH1 மற்றும் ProDH2) மரபணுக்கள் போன்ற புரோலைன் வளர்சிதை மாற்றத்துடன் தொடர்புடைய மரபணுக்கள், நிக்கோடியானா பெந்தாமியானா மற்றும் அரபிடோப்சிஸ் தாலியானாவை ஹோஸ்ட் அல்லாத சூடோமோனாஸ் சிரிங்கே விகாரங்களுக்கு எதிராக பாதுகாப்பதில் ஈடுபட்டுள்ளதாக முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது (செந்தில்-குமார் மற்றும் மைசூர், 2012). மறுபுறம், பூஞ்சை ஆர்னிதைன் டெகார்பாக்சிலேஸ் (ODC) நோய்க்கிருமி வளர்ச்சிக்கு தேவைப்படுகிறது (சிங் மற்றும் பலர், 2020). ஹோஸ்ட்-தூண்டப்பட்ட மரபணு அமைதிப்படுத்தல் (HIGS) மூலம் ஃபுசேரியம் ஆக்சிஸ்போரம் f. sp. லைகோபெர்சிசியின் ODC ஐ குறிவைப்பது ஃபுசேரியம் வாடலுக்கு தக்காளி தாவரங்களின் எதிர்ப்பை கணிசமாக மேம்படுத்தியது (சிங் மற்றும் பலர், 2020). இருப்பினும், பைட்டோபாத்தோஜென்கள் போன்ற உயிரியல் அழுத்தங்களுக்கு எதிராக வெளிப்புற ஆர்னிதைன் பயன்பாட்டின் சாத்தியமான பங்கு நன்கு ஆய்வு செய்யப்படவில்லை. மிக முக்கியமாக, நோய் எதிர்ப்பு சக்தியில் ஆர்னிதினின் விளைவுகள் மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய உயிர்வேதியியல் மற்றும் உடலியல் நிகழ்வுகள் பெரும்பாலும் ஆராயப்படாமல் உள்ளன.
பருப்பு வகைகளில் S. sclerotiorum தொற்றின் சிக்கலான தன்மையைப் புரிந்துகொள்வது பயனுள்ள கட்டுப்பாட்டு உத்திகளை உருவாக்குவதற்கு முக்கியமானது. இந்த ஆய்வில், ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தொற்றுக்கு பயறு வகை தாவரங்களின் பாதுகாப்பு வழிமுறைகள் மற்றும் எதிர்ப்பை மேம்படுத்துவதில் டயமின் L-ornithine இன் சாத்தியமான பங்கை அடையாளம் காண நாங்கள் நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளோம். பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களின் பாதுகாப்பு பதில்களை மேம்படுத்துவதோடு, L-ornithine ரெடாக்ஸ் நிலையை பராமரிப்பதிலும் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். L-ornithine இன் சாத்தியமான விளைவுகள் நொதி மற்றும் நொதி அல்லாத ஆக்ஸிஜனேற்ற பாதுகாப்பு வழிமுறைகளின் ஒழுங்குமுறை மற்றும் பூஞ்சை நோய்க்கிருமித்தன்மை/வைரஸ் காரணிகள் மற்றும் தொடர்புடைய புரதங்களில் குறுக்கீடு ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையவை என்று நாங்கள் முன்மொழிகிறோம். L-ornithine இன் இந்த இரட்டை செயல்பாடு, வெள்ளை பூஞ்சையின் தாக்கத்தைக் குறைப்பதற்கும், இந்த சக்திவாய்ந்த பூஞ்சை நோய்க்கிருமிக்கு பொதுவான பயறு வகை பயிர்களின் எதிர்ப்பை அதிகரிப்பதற்கும் ஒரு நிலையான உத்திக்கான ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய வேட்பாளராக அமைகிறது. தற்போதைய ஆய்வின் முடிவுகள், வெள்ளை பூஞ்சையைக் கட்டுப்படுத்துவதற்கும், பயறு வகை உற்பத்தியில் அதன் தாக்கத்தைக் குறைப்பதற்கும் புதுமையான, சுற்றுச்சூழல் நட்பு முறைகளை உருவாக்க உதவக்கூடும்.
இந்த ஆய்வில், எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய வணிக வகை பொதுவான அவரை, கிசா 3 (ஃபேசியோலஸ் வல்காரிஸ் எல். சி.வி. கிசா 3), சோதனைப் பொருளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. எகிப்தின் வேளாண் ஆராய்ச்சி மையம் (ARC), வயல் பயிர் ஆராய்ச்சி நிறுவனம் (FCRI), பயறு ஆராய்ச்சித் துறை ஆகியவற்றால் ஆரோக்கியமான விதைகள் வழங்கப்பட்டன. ஐந்து விதைகள் பிளாஸ்டிக் தொட்டிகளில் (உள் விட்டம் 35 செ.மீ, ஆழம் 50 செ.மீ) கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் (25 ± 2 °C, ஈரப்பதம் 75 ± 1%, 8 மணிநேர ஒளி/16 மணிநேர இருள்) S. ஸ்க்லரோட்டியோரம்-பாதிக்கப்பட்ட மண்ணால் நிரப்பப்பட்டன. விதைத்த 7-10 நாட்களில் (DPS), நாற்றுகள் மெல்லியதாகி, ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் சீரான வளர்ச்சி மற்றும் மூன்று முழுமையாக விரிவடைந்த இலைகளுடன் இரண்டு நாற்றுகள் மட்டுமே இருக்கும். அனைத்து தொட்டி செடிகளும் இரண்டு வாரங்களுக்கு ஒரு முறை தண்ணீர் ஊற்றப்பட்டு, கொடுக்கப்பட்ட வகைக்கு பரிந்துரைக்கப்பட்ட விகிதத்தில் மாதந்தோறும் உரமிடப்பட்டன.
500 மி.கி/லி செறிவுள்ள எல்-ஆர்னிதினெடியமைனை ((+)-(S)-2,5-டைமினோபென்டானோயிக் அமிலம் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) தயாரிக்க, 50 மி.கி முதலில் 100 மி.லி. மலட்டு வடிகட்டிய நீரில் கரைக்கப்பட்டது. பின்னர் ஸ்டாக் கரைசல் நீர்த்தப்பட்டு அடுத்தடுத்த சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஆறு தொடர் எல்-ஆர்னிதின் செறிவுகள் (12.5, 25, 50, 75, 100, மற்றும் 125 மி.கி/லி) செயற்கை முறையில் சோதிக்கப்பட்டன. கூடுதலாக, மலட்டு வடிகட்டிய நீர் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாகவும் (மோக்) வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியாகவும் (ரிசோலெக்ஸ்-டி) 50% ஈரப்படுத்தக்கூடிய தூள் (டோக்ளோஃபோஸ்-மெத்தில் 20% + திராம் 30%; கேஇசட்-காஃப்ர் எல் ஜயாட் பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் கெமிக்கல்ஸ் நிறுவனம், காஃப்ர் எல் ஜயாட், கர்பியா கவர்னரேட், எகிப்து) நேர்மறை கட்டுப்பாட்டாகவும் பயன்படுத்தப்பட்டது. வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான "ரிசோலெக்ஸ்-டி" ஐந்து செறிவுகளில் (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) செயற்கை முறையில் சோதிக்கப்பட்டது.
வெள்ளை பூஞ்சை காளான் (தொற்று விகிதம்: 10–30%) அறிகுறிகளைக் கொண்ட பொதுவான அவரை தண்டுகள் மற்றும் காய்களின் மாதிரிகள் வணிக பண்ணைகளில் இருந்து சேகரிக்கப்பட்டன. பாதிக்கப்பட்ட தாவரப் பொருட்களில் பெரும்பாலானவை இனங்கள்/வகை (எளிதில் பாதிக்கக்கூடிய வணிக வகை கிசா 3) மூலம் அடையாளம் காணப்பட்டாலும், மற்றவை, குறிப்பாக உள்ளூர் சந்தைகளில் இருந்து பெறப்பட்டவை, அறியப்படாத இனங்களைச் சேர்ந்தவை. சேகரிக்கப்பட்ட பாதிக்கப்பட்ட பொருட்கள் முதலில் 0.5% சோடியம் ஹைபோகுளோரைட் கரைசலில் 3 நிமிடங்களுக்கு மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டன, பின்னர் பல முறை மலட்டு வடிகட்டிய நீரில் கழுவப்பட்டு, அதிகப்படியான தண்ணீரை அகற்ற மலட்டு வடிகட்டி காகிதத்தால் துடைக்கப்பட்டன. பின்னர் பாதிக்கப்பட்ட உறுப்புகள் நடுத்தர திசுக்களில் இருந்து சிறிய துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டன (ஆரோக்கியமான மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களுக்கு இடையில்), உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் அகார் (PDA) ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்டு, ஸ்க்லரோஷியா உருவாவதைத் தூண்டுவதற்காக 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 12 மணிநேர ஒளி/12 மணிநேர இருண்ட சுழற்சியுடன் 5 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. மைசீலிய முனை முறை கலப்பு அல்லது மாசுபட்ட கலாச்சாரங்களிலிருந்து பூஞ்சை தனிமைப்படுத்தல்களை சுத்திகரிக்க பயன்படுத்தப்பட்டது. சுத்திகரிக்கப்பட்ட பூஞ்சை தனிமைப்படுத்தல் முதலில் அதன் கலாச்சார உருவவியல் பண்புகளின் அடிப்படையில் அடையாளம் காணப்பட்டது, பின்னர் நுண்ணிய அம்சங்களின் அடிப்படையில் S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் என உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. இறுதியாக, அனைத்து சுத்திகரிக்கப்பட்ட தனிமைப்படுத்தல்களும் கோச்சின் அனுமானங்களை பூர்த்தி செய்ய எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய பொதுவான பீன் சாகுபடியான கிசா 3 இல் நோய்க்கிருமித்தன்மைக்காக சோதிக்கப்பட்டன.
கூடுதலாக, வைட் மற்றும் பலர், 1990; பதுரோ-சீஸ்னீவ்ஸ்கா மற்றும் பலர், 2017 விவரித்தபடி, உள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் ஸ்பேசர் (ITS) வரிசைமுறையின் அடிப்படையில் மிகவும் ஊடுருவும் S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல் (தனிமைப்படுத்தல் #3) மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, தனிமைப்படுத்தல்கள் உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பில் (PDB) வளர்க்கப்பட்டு 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 5–7 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. பின்னர் பூஞ்சை மைசீலியம் சேகரிக்கப்பட்டு, சீஸ்க்லாத் மூலம் வடிகட்டப்பட்டு, இரண்டு முறை மலட்டு நீரில் கழுவப்பட்டு, மலட்டு வடிகட்டி காகிதத்தால் உலர்த்தப்பட்டது. விரைவு-DNA™ பூஞ்சை/பாக்டீரியல் மினிபிரெப் கிட் (குராமே-இசியோகா, 1997; அடல்லா மற்றும் பலர், 2022, 2024) ஐப் பயன்படுத்தி மரபணு டிஎன்ஏ தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. பின்னர் ITS rDNA பகுதி குறிப்பிட்ட ப்ரைமர் ஜோடி ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; எதிர்பார்க்கப்படும் அளவு: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) ஐப் பயன்படுத்தி பெருக்கப்பட்டது. சுத்திகரிக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்புகள் வரிசைப்படுத்தலுக்கு சமர்ப்பிக்கப்பட்டன (பெய்ஜிங் Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA வரிசைமுறைகள் Sanger வரிசைமுறை முறையைப் பயன்படுத்தி இருதரப்பு வரிசைமுறைப்படுத்தப்பட்டன. பின்னர் BLASTn மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி GenBank மற்றும் தேசிய உயிரி தொழில்நுட்ப தகவல் மையத்தில் (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) சமீபத்திய தரவுகளுடன் கூடிய வினவல் வரிசைமுறைகள் ஒப்பிடப்பட்டன. மூலக்கூறு பரிணாம மரபியல் பகுப்பாய்வு தொகுப்பில் (MEGA-11; பதிப்பு 11) ClustalW ஐப் பயன்படுத்தி NCBI GenBank (துணை அட்டவணை S1) இல் உள்ள சமீபத்திய தரவுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட 20 பிற S. sclerotiorum விகாரங்கள்/தனிமைப்படுத்தல்களுடன் வினவல் வரிசை ஒப்பிடப்பட்டது (குமார் மற்றும் பலர், 2024). பரிணாம பகுப்பாய்வு அதிகபட்ச நிகழ்தகவு முறை மற்றும் பொதுவான நேர-மீளக்கூடிய நியூக்ளியோடைடு மாற்று மாதிரியைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது (Nei and Kumar, 2000). அதிக பதிவு-நிகழ்தகவு கொண்ட மரம் காட்டப்பட்டுள்ளது. ஹூரிஸ்டிக் தேடலுக்கான ஆரம்ப மரம், அண்டை-இணைக்கும் (NJ) மரத்திற்கும் (Kumar et al., 2024) அதிகபட்ச பார்சிமோனி (MP) மரத்திற்கும் இடையில் அதிக பதிவு-நிகழ்தகவு கொண்ட மரத்தைத் தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. NJ மரம் பொதுவான நேர-மீளக்கூடிய மாதிரியைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்ட ஜோடிவரிசை தூர அணியைப் பயன்படுத்தி கட்டமைக்கப்பட்டது (Nei and Kumar, 2000).
எல்-ஆர்னிதின் மற்றும் பாக்டீரிசைடு "ரைசோலெக்ஸ்-டி" ஆகியவற்றின் பாக்டீரியா எதிர்ப்பு செயல்பாடு அகார் பரவல் முறையால் இன் விட்ரோவில் தீர்மானிக்கப்பட்டது. முறை: எல்-ஆர்னிதினின் (500 மி.கி/லி) ஸ்டாக் கரைசலின் சரியான அளவை எடுத்து, 10 மில்லி பி.டி.ஏ ஊட்டச்சத்து ஊடகத்துடன் நன்கு கலந்து, முறையே 12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 மி.கி/லி இறுதி செறிவுகளுடன் கரைசல்களைத் தயாரிக்கவும். ஐந்து செறிவுகளில் பூஞ்சைக் கொல்லியான "ரைசோலெக்ஸ்-டி" (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) மற்றும் மலட்டு வடிகட்டிய நீர் ஆகியவை கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ஊடகம் திடப்படுத்தப்பட்ட பிறகு, 4 மிமீ விட்டம் கொண்ட ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் கலாச்சாரத்தின் புதிதாக தயாரிக்கப்பட்ட மைசீலிய பிளக், பெட்ரி டிஷின் மையத்திற்கு மாற்றப்பட்டு, மைசீலியம் முழு கட்டுப்பாட்டு பெட்ரி டிஷையும் மூடும் வரை 25±2°C வெப்பநிலையில் வளர்க்கப்பட்டது, அதன் பிறகு பூஞ்சை வளர்ச்சி பதிவு செய்யப்பட்டது. சமன்பாடு 1 ஐப் பயன்படுத்தி S. ஸ்க்லரோட்டியோரமின் ஆர வளர்ச்சியின் சதவீத தடுப்பைக் கணக்கிடுங்கள்:
ஒவ்வொரு கட்டுப்பாடு/பரிசோதனைக் குழுவிற்கும் ஆறு உயிரியல் பிரதிகளும், ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதிக்கும் ஐந்து தொட்டிகளும் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்) என சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது. சோதனை முடிவுகளின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மறுஉருவாக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் இரண்டு முறை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (இரண்டு தொழில்நுட்ப பிரதிகள்). கூடுதலாக, அரை-அதிகபட்ச தடுப்பு செறிவு (IC50) மற்றும் IC99 (பிரெண்டிஸ், 1976) ஆகியவற்றைக் கணக்கிட ப்ராபிட் பின்னடைவு பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது.
பசுமை இல்ல நிலைமைகளின் கீழ் எல்-ஆர்னிதினின் திறனை மதிப்பிடுவதற்கு, தொடர்ச்சியான இரண்டு பானை பரிசோதனைகள் நடத்தப்பட்டன. சுருக்கமாக, பானைகள் கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட களிமண்-மணல் மண்ணால் நிரப்பப்பட்டன (3:1) மற்றும் புதிதாக தயாரிக்கப்பட்ட எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரம் வளர்ப்பால் தடுப்பூசி போடப்பட்டன. முதலாவதாக, எஸ். ஸ்க்லெரோட்டியோரமின் (தனிமை #3) மிகவும் ஊடுருவும் தனிமைப்படுத்தல் ஒரு ஸ்க்லெரோட்டியத்தை பாதியாக வெட்டி, ஒரு பி.டி.ஏ மீது முகம் குப்புற வைத்து, மைசீலிய வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக 25°C வெப்பநிலையில் நிலையான இருட்டில் (24 மணிநேரம்) 4 நாட்கள் அடைகாப்பதன் மூலம் வளர்ப்பு செய்யப்பட்டது. பின்னர் நான்கு 5 மிமீ விட்டம் கொண்ட அகார் பிளக்குகள் முன்னணி விளிம்பிலிருந்து எடுக்கப்பட்டு, கோதுமை மற்றும் அரிசி தவிடு (1:1, v/v) ஆகியவற்றின் 100 கிராம் மலட்டு கலவையுடன் தடுப்பூசி போடப்பட்டன, மேலும் அனைத்து பிளாஸ்க்குகளும் 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 12 மணிநேர ஒளி/12 மணிநேர இருண்ட சுழற்சியின் கீழ் 5 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன, இதனால் ஸ்க்லெரோட்டியா உருவாவதைத் தூண்டுகிறது. மண்ணைச் சேர்ப்பதற்கு முன் ஒரே மாதிரியான தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக அனைத்து பிளாஸ்க்குகளின் உள்ளடக்கங்களும் முழுமையாக கலக்கப்பட்டன. பின்னர், நோய்க்கிருமிகளின் நிலையான செறிவை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் 100 கிராம் காலனித்துவ தவிடு கலவை சேர்க்கப்பட்டது. பூஞ்சை வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக தடுப்பூசி போடப்பட்ட தொட்டிகளில் தண்ணீர் ஊற்றி 7 நாட்களுக்கு பசுமை இல்ல நிலைமைகளில் வைக்கப்பட்டது.
பின்னர் ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் கிசா 3 வகையைச் சேர்ந்த ஐந்து விதைகள் விதைக்கப்பட்டன. எல்-ஆர்னிதைன் மற்றும் பூஞ்சைக் கொல்லியான ரைசோலெக்ஸ்-டி ஆகியவற்றால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தொட்டிகளுக்கு, கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட விதைகள் முதலில் இரண்டு சேர்மங்களின் நீர்வாழ் கரைசலில் முறையே சுமார் 250 மி.கி/லி மற்றும் 50 மி.கி/லி இறுதி IC99 செறிவு கொண்ட இரண்டு சேர்மங்களின் நீர்வாழ் கரைசலில் இரண்டு மணி நேரம் ஊறவைக்கப்பட்டன, பின்னர் விதைப்பதற்கு முன் ஒரு மணி நேரம் காற்றில் உலர்த்தப்பட்டன. மறுபுறம், விதைகள் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாக மலட்டு வடிகட்டிய நீரில் ஊறவைக்கப்பட்டன. 10 நாட்களுக்குப் பிறகு, முதல் நீர்ப்பாசனத்திற்கு முன், நாற்றுகள் மெல்லியதாகி, ஒவ்வொரு தொட்டியிலும் இரண்டு சுத்தமான நாற்றுகள் மட்டுமே எஞ்சியுள்ளன. கூடுதலாக, எஸ். ஸ்க்லரோட்டியோரம் தொற்றுநோயை உறுதி செய்வதற்காக, ஒரே வளர்ச்சி நிலையில் (10 நாட்கள்) ஒரே வளர்ச்சி நிலையில் உள்ள அவரை செடியின் தண்டுகள் ஒரு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட ஸ்கால்பெல் பயன்படுத்தி இரண்டு வெவ்வேறு இடங்களில் வெட்டப்பட்டு, ஒவ்வொரு காயத்திலும் தோராயமாக 0.5 கிராம் காலனிசிங் தவிடு கலவை வைக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து அதிக ஈரப்பதம் தடுப்பூசி போடப்பட்ட அனைத்து தாவரங்களிலும் தொற்று மற்றும் நோய் வளர்ச்சியைத் தூண்டுகிறது. கட்டுப்பாட்டு தாவரங்களும் இதேபோல் காயமடைந்தன, மேலும் சம அளவு (0.5 கிராம்) மலட்டுத்தன்மையற்ற, காலனித்துவப்படுத்தப்படாத தவிடு கலவையை காயத்தில் போட்டு, நோய் வளர்ச்சிக்கான சூழலை உருவகப்படுத்தவும், சிகிச்சை குழுக்களுக்கு இடையில் நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்யவும் அதிக ஈரப்பதத்தின் கீழ் பராமரிக்கப்பட்டது.
சிகிச்சை முறை: பீன் நாற்றுகளுக்கு 500 மில்லி எல்-ஆர்னிதைன் (250 மி.கி/லி) நீர் கரைசல் அல்லது பூஞ்சைக் கொல்லியான ரைசோலெக்ஸ்-டி (50 மி.கி/லி) மண்ணில் நீர்ப்பாசனம் செய்து பாய்ச்சப்பட்டது, பின்னர் சிகிச்சை 10 நாட்கள் இடைவெளியில் மூன்று முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது. மருந்துப்போலி சிகிச்சை பெற்ற கட்டுப்பாடுகள் 500 மில்லி மலட்டு வடிகட்டிய நீரில் நீர்ப்பாசனம் செய்யப்பட்டன. அனைத்து சிகிச்சைகளும் பசுமை இல்ல நிலைமைகளின் கீழ் மேற்கொள்ளப்பட்டன (25 ± 2°C, 75 ± 1% ஈரப்பதம் மற்றும் 8 மணிநேர ஒளி/16 மணிநேர இருள் ஒளிக்காலம்). அனைத்து தொட்டிகளிலும் பதினைந்து வாரங்களுக்கு ஒருமுறை தண்ணீர் பாய்ச்சப்பட்டது மற்றும் மாதந்தோறும் சீரான NPK உரத்துடன் (20-20-20, 3.6% கந்தகம் மற்றும் TE நுண்ணூட்டச்சத்துக்களுடன்; ஜைன் விதைகள், எகிப்து) 3-4 கிராம்/லி செறிவில் குறிப்பிட்ட வகைக்கான பரிந்துரைகள் மற்றும் உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி இலைகளில் தெளிப்பதன் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது. வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால், முழுமையாக விரிவடைந்த முதிர்ந்த இலைகள் (மேலிருந்து 2வது மற்றும் 3வது இலைகள்) ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் 72 மணிநேர சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய சிகிச்சையில் (hpt) சேகரிக்கப்பட்டு, ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டு, தொகுக்கப்பட்டு -80 °C இல் சேமிக்கப்பட்டன, இதில் ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்த குறிகாட்டிகளின் இடத்திலேயே ஹிஸ்டோகெமிக்கல் உள்ளூர்மயமாக்கல், லிப்பிட் பெராக்சிடேஷன், நொதி மற்றும் நொதி அல்லாத ஆக்ஸிஜனேற்றிகள் மற்றும் மரபணு வெளிப்பாடு ஆகியவை அடங்கும்.
டெரான் மற்றும் பலர் (2006) மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெட்ஸோல்ட் மற்றும் டிக்சன் அளவுகோலை (1996) அடிப்படையாகக் கொண்ட தடுப்பூசி போட்ட 21 நாட்களுக்குப் பிறகு (dpi) வெள்ளை பூஞ்சை தொற்று தீவிரம் வாரந்தோறும் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, தடுப்பூசி போடும் இடத்தில் தொடங்கி, இடைக்கணுக்கள் மற்றும் முனைகளில் புண்களின் முன்னேற்றத்தைப் பின்பற்ற பீன் செடிகளின் தண்டுகள் மற்றும் கிளைகள் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. தடுப்பூசி போடும் இடத்திலிருந்து தண்டு அல்லது கிளையில் தொலைதூரப் புள்ளி வரை காயத்தின் தூரம் அளவிடப்பட்டது மற்றும் காயத்தின் இருப்பிடத்தின் அடிப்படையில் 1–9 மதிப்பெண் ஒதுக்கப்பட்டது, அங்கு (1) தடுப்பூசி போடும் இடத்திற்கு அருகில் எந்தத் தொற்றும் இல்லை என்பதைக் குறிக்கிறது மற்றும் (2–9) கணுக்கள்/இடைக்கணுக்களில் புண் அளவு மற்றும் முன்னேற்றத்தில் படிப்படியான அதிகரிப்பைக் குறிக்கிறது (துணை அட்டவணை S2). வெள்ளை பூஞ்சை தொற்று தீவிரம் பின்னர் சூத்திரம் 2 ஐப் பயன்படுத்தி சதவீதமாக மாற்றப்பட்டது:
கூடுதலாக, நோய் முன்னேற்ற வளைவின் (AUDPC) கீழ் உள்ள பகுதி, சமன்பாடு 3 ஐப் பயன்படுத்தி பொதுவான பீன்ஸின் வெள்ளை அழுகலுக்கு (சௌஹான் மற்றும் பலர், 2020) சமீபத்தில் மாற்றியமைக்கப்பட்ட சூத்திரத்தைப் (ஷேனர் மற்றும் ஃபின்னி, 1977) பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது:
Yi = ti நேரத்தில் நோயின் தீவிரம், Yi+1 = அடுத்த முறை ti+1 இல் நோயின் தீவிரம், ti = முதல் அளவீட்டின் நேரம் (நாட்களில்), ti+1 = அடுத்த அளவீட்டின் நேரம் (நாட்களில்), n = மொத்த நேரப் புள்ளிகள் அல்லது கண்காணிப்பு புள்ளிகளின் எண்ணிக்கை. அனைத்து உயிரியல் பிரதிகளிலும் தாவர உயரம் (செ.மீ), ஒரு செடிக்கு கிளைகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் ஒரு செடிக்கு இலைகளின் எண்ணிக்கை உள்ளிட்ட பீன் தாவர வளர்ச்சி அளவுருக்கள் வாரந்தோறும் 21 நாட்களுக்கு பதிவு செய்யப்பட்டன.
ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலும், சிகிச்சையின் பின்னர் 45 வது நாளில் (கடைசி சிகிச்சைக்குப் பிறகு 15 நாட்களுக்குப் பிறகு) இலை மாதிரிகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்). இருட்டில் 4 °C இல் 80% அசிட்டோனைப் பயன்படுத்தி ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளை (குளோரோபில் a, குளோரோபில் b மற்றும் கரோட்டினாய்டுகள்) பிரித்தெடுக்க சுமார் 500 மி.கி. நொறுக்கப்பட்ட திசுக்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன. 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, மாதிரிகள் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, குளோரோபில் a, குளோரோபில் b மற்றும் கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கங்களை UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி வண்ண அளவீட்டில் தீர்மானிக்க சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டது, இது மூன்று வெவ்வேறு அலைநீளங்களில் (A470, A646 மற்றும் A663 nm) உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரை (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தப்பட்டது. இறுதியாக, ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளின் உள்ளடக்கம் லிச்சென்தாலர் (1987) விவரித்த பின்வரும் சூத்திரங்கள் 4–6 ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.
சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய 72 மணிநேரத்தில் (hpt), ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு (H2O2) மற்றும் சூப்பர் ஆக்சைடு அயனி (O2•−) ஆகியவற்றின் இன் சிட்டு ஹிஸ்டோகெமிக்கல் உள்ளூர்மயமாக்கலுக்காக ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் இலைகள் (மேலே இருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்). முறையின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மறுஉருவாக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் நகல் (இரண்டு தொழில்நுட்ப பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. H2O2 மற்றும் O2•− ஆகியவை முறையே 0.1% 3,3′-டயமினோபென்சிடைன் (DAB; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) அல்லது நைட்ரோப்ளூ டெட்ராசோலியம் (NBT; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டன, ரோமெரோ-புவேர்டாஸ் மற்றும் பலர் (2004) மற்றும் ஆடம் மற்றும் பலர் (1989) விவரித்த முறைகளைப் பின்பற்றி, சிறிய மாற்றங்களுடன். H2O2-இன் ஹிஸ்டோகெமிக்கல் உள்ளூர்மயமாக்கலுக்கு, துண்டுப்பிரசுரங்கள் 10 mM டிரிஸ் பஃபரில் (pH 7.8) 0.1% DAB உடன் வெற்றிட ஊடுருவி, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 60 நிமிடங்கள் ஒளியில் அடைகாக்கப்பட்டன. துண்டுப்பிரசுரங்கள் 4:1 (v/v) எத்தனால்: குளோரோஃபார்ம் (அல்-கோம்ஹோரியா மருந்துகள் மற்றும் மருத்துவ பொருட்கள், கெய்ரோ, எகிப்து) இல் 0.15% (v/v) TCA இல் வெளுக்கப்பட்டன, பின்னர் அவை கருமையாகும் வரை ஒளியில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன. இதேபோல், O2•− இன் ஹிஸ்டோகெமிக்கல் உள்ளூர்மயமாக்கலுக்கு வால்வுகள் 0.1 w/v % HBT கொண்ட 10 mM பொட்டாசியம் பாஸ்பேட் இடையகத்துடன் (pH 7.8) வெற்றிட ஊடுருவி செய்யப்பட்டன. துண்டுப்பிரசுரங்கள் அறை வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்கள் ஒளியில் அடைகாக்கப்பட்டன, பின்னர் மேலே குறிப்பிட்டபடி வெளுக்கப்பட்டன, பின்னர் அடர் நீலம்/வயலட் புள்ளிகள் தோன்றும் வரை ஒளிரச் செய்யப்பட்டன. இதன் விளைவாக வரும் பழுப்பு நிறத்தின் தீவிரம் (H2O2 குறிகாட்டியாக) அல்லது நீல-வயலட் நிறத்தின் (O2•− குறிகாட்டியாக) பட செயலாக்க தொகுப்பான ImageJ (http://fiji.sc; அணுகப்பட்டது 7 மார்ச் 2024).
மலோண்டியால்டிஹைடு (MDA; லிப்பிட் பெராக்சிடேஷனின் குறிப்பானாக) டு மற்றும் பிராம்லேஜ் (1992) முறையின்படி சிறிய மாற்றங்களுடன் தீர்மானிக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) இலைகள் 72 மணிநேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு சேகரிக்கப்பட்டன (hpt). ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலும் ஐந்து தொட்டிகள் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்) அடங்கும். முறையின் துல்லியம், நம்பகத்தன்மை மற்றும் இனப்பெருக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் நகல் (இரண்டு தொழில்நுட்ப பிரதிகள்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, 0.01% பியூட்டிலேட்டட் ஹைட்ராக்ஸிடோலுயீன் (BHT; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், MO, USA) கொண்ட 20% ட்ரைக்ளோரோஅசெடிக் அமிலத்துடன் (TCA; மில்லிபோர்சிக்மா, பர்லிங்டன், MA, USA) MDA பிரித்தெடுப்பதற்கு 0.5 கிராம் தரை இலை திசு பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்னர், சூப்பர்நேட்டண்டில் உள்ள MDA உள்ளடக்கம், UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரை (ஷிமாட்ஸு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) பயன்படுத்தி 532 மற்றும் 600 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் வண்ண அளவீடு மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது, பின்னர் nmol g−1 FW ஆக வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
நொதி அல்லாத மற்றும் நொதி ஆக்ஸிஜனேற்றிகளின் மதிப்பீட்டிற்காக, ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியிலிருந்தும் 72 மணிநேர சிகிச்சைக்குப் பிறகு (hpt) இலைகள் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதியும் ஐந்து தொட்டிகளைக் கொண்டிருந்தது (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்). ஒவ்வொரு உயிரியல் மாதிரியும் நகலாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (இரண்டு தொழில்நுட்ப மாதிரிகள்). இரண்டு இலைகள் திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைக்கப்பட்டு நொதி மற்றும் நொதி அல்லாத ஆக்ஸிஜனேற்றிகள், மொத்த அமினோ அமிலங்கள், புரோலின் உள்ளடக்கம், மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் ஆக்சலேட் அளவு ஆகியவற்றை தீர்மானிக்க நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
கஹ்கோனென் மற்றும் பலர் (1999) விவரித்த முறையின் சிறிய மாற்றங்களுடன், ஃபோலின்-சியோகால்டியூ ரீஜென்ட்டை (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், MO, USA) பயன்படுத்தி மொத்த கரையக்கூடிய பீனாலிக் அமிலங்கள் தீர்மானிக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, தோராயமாக 0.1 கிராம் ஒரே மாதிரியான இலை திசுக்கள் 20 மில்லி 80% மெத்தனால் இருட்டில் 24 மணிநேரம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, மையவிலக்குக்குப் பிறகு சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டது. மாதிரி சாற்றில் 0.1 மில்லி 0.5 மில்லி ஃபோலின்-சியோகால்டியூ ரீஜென்ட்டுடன் (10%) கலக்கப்பட்டு, 30 வினாடிகள் குலுக்கப்பட்டு 5 நிமிடங்கள் இருட்டில் விடப்பட்டது. பின்னர் 0.5 மில்லி 20% சோடியம் கார்பனேட் கரைசல் (Na2CO3; அல்-கோம்ஹோரியா பார்மாசூட்டிகல்ஸ் அண்ட் மெடிக்கல் சப்ளைஸ் கம்பெனி, கெய்ரோ, எகிப்து) ஒவ்வொரு குழாயிலும் சேர்க்கப்பட்டு, நன்கு கலக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் இருட்டில் அடைகாக்கப்பட்டது. அடைகாத்த பிறகு, எதிர்வினை கலவையின் உறிஞ்சுதல் UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 765 nm இல் அளவிடப்பட்டது (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்). மாதிரி சாற்றில் உள்ள மொத்த கரையக்கூடிய பீனால்களின் செறிவு ஒரு காலிக் அமில அளவுத்திருத்த வளைவைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது (ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், NH, USA) மற்றும் ஒரு கிராம் புதிய எடைக்கு (mg GAE g-1 புதிய எடை) மில்லிகிராம்களுக்கு சமமான காலிக் அமிலமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டு உள்ளடக்கம் டிஜெரிடேன் மற்றும் பலர் (2006) முறையின்படி சிறிய மாற்றங்களுடன் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, மேலே உள்ள மெத்தனால் சாற்றில் 0.3 மில்லி 0.3 மில்லி 5% அலுமினிய குளோரைடு கரைசலுடன் (AlCl3; ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், NH, USA) கலக்கப்பட்டு, தீவிரமாகக் கிளறி, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடம் அடைகாக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 0.3 மில்லி 10% பொட்டாசியம் அசிடேட் கரைசல் (அல்-கோம்ஹோரியா பார்மாசூட்டிகல்ஸ் அண்ட் மெடிக்கல் சப்ளைஸ், கெய்ரோ, எகிப்து) சேர்க்கப்பட்டு, நன்கு கலக்கப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடம் இருட்டில் அடைகாக்கப்பட்டது. அடைகாத்த பிறகு, எதிர்வினை கலவையின் உறிஞ்சுதல் UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி (ஷிமாட்ஸு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்) 430 nm இல் அளவிடப்பட்டது. மாதிரி சாற்றில் உள்ள மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டுகளின் செறிவு ஒரு ருட்டின் அளவுத்திருத்த வளைவைப் பயன்படுத்தி (TCI அமெரிக்கா, போர்ட்லேண்ட், OR, USA) தீர்மானிக்கப்பட்டது, பின்னர் ஒரு கிராமுக்கு மில்லிகிராம் ருட்டின் சமமானதாக வெளிப்படுத்தப்பட்டது. புதிய எடை (mg RE g-1 புதிய எடை).
யோகோயாமா மற்றும் ஹிராமட்சு (2003) முன்மொழியப்பட்ட மற்றும் சன் மற்றும் பலர் (2006) மாற்றியமைத்த முறையின் அடிப்படையில், பீன் இலைகளின் மொத்த இலவச அமினோ அமில உள்ளடக்கம் மாற்றியமைக்கப்பட்ட நின்ஹைட்ரின் ரீஜென்ட்டைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, 0.1 கிராம் தரை திசுக்கள் pH 5.4 பஃபர் மூலம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன, மேலும் 200 μL சூப்பர்நேட்டன்ட் 200 μL நின்ஹைட்ரின் (2%) மற்றும் 200 μL பைரிடின் (10%; ஸ்பெக்ட்ரம் கெமிக்கல், நியூ பிரன்சுவிக், NJ, USA) உடன் வினைபுரிந்து, கொதிக்கும் நீர் குளியல் ஒன்றில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் குளிர்விக்கப்பட்டு UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 580 nm இல் அளவிடப்பட்டது (ஷிமாட்சு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்). மறுபுறம், புரோலின் பேட்ஸ் முறையால் தீர்மானிக்கப்பட்டது (பேட்ஸ் மற்றும் பலர், 1973). 3% சல்போசாலிசிலிக் அமிலத்துடன் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்தம், எம்ஏ, யுஎஸ்ஏ) புரோலைன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது, மேலும் மையவிலக்குக்குப் பிறகு, 0.5 மில்லி சூப்பர்நேட்டண்ட் 1 மில்லி பனிப்பாறை அசிட்டிக் அமிலம் (ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ஹாம்ப்டன், என்ஹெச், யுஎஸ்ஏ) மற்றும் நின்ஹைட்ரின் ரீஜென்ட் ஆகியவற்றுடன் கலந்து, 90°C வெப்பநிலையில் 45 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, மேலே உள்ள அதே ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 520 nm இல் குளிர்விக்கப்பட்டு அளவிடப்பட்டது. இலைச் சாற்றில் உள்ள மொத்த இலவச அமினோ அமிலங்கள் மற்றும் புரோலைன் முறையே கிளைசின் மற்றும் புரோலைன் அளவுத்திருத்த வளைவுகளைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், எம்ஓ, யுஎஸ்ஏ), மற்றும் மி.கி/கிராம் புதிய எடையாக வெளிப்படுத்தப்பட்டது.
ஆக்ஸிஜனேற்ற நொதிகளின் நொதி செயல்பாட்டைத் தீர்மானிக்க, தோராயமாக 500 மி.கி. ஒரே மாதிரியான திசுக்கள் 3 மில்லி 50 மி.மீ. டிரிஸ் பஃபர் (pH 7.8) உடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன, இதில் 1 மி.மீ. EDTA-Na2 (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், MO, USA) மற்றும் 7.5% பாலிவினைல்பைரோலிடோன் (PVP; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், MO, USA) ஆகியவை அடங்கும், 10,000 × கிராம் வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு குளிர்சாதன பெட்டியில் (4 °C) மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, சூப்பர்நேட்டண்ட் (கச்சா நொதி சாறு) சேகரிக்கப்பட்டது (எல்-நகர் மற்றும் பலர், 2023; ஒஸ்மான் மற்றும் பலர், 2023). பின்னர் கேட்டலேஸ் (CAT) 0.1 M சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபரின் 2 மில்லி (pH 6.5; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயிண்ட் லூயிஸ், MO, USA) மற்றும் 100 μl 269 mM H2O2 கரைசலுடன் வினைபுரிந்து அதன் நொதி செயல்பாட்டை Aebi (1984) முறையின்படி சிறிய மாற்றங்களுடன் தீர்மானிக்கப்பட்டது (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). குவாயாகால் சார்ந்த பெராக்ஸிடேஸ் (POX) நொதி செயல்பாடு ஹராச் மற்றும் பலர் (2009) முறையைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது. (2008) சிறிய மாற்றங்களுடன் (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) மற்றும் பாலிஃபீனால் ஆக்சிடேஸின் (PPO) நொதி செயல்பாடு 2.2 மில்லி 100 mM சோடியம் பாஸ்பேட் பஃபர் (pH 6.0), 100 μl குயாகாக்கால் (TCI ரசாயனங்கள், போர்ட்லேண்ட், OR, USA) மற்றும் 100 μl 12 mM H2O2 ஆகியவற்றுடன் எதிர்வினைக்குப் பிறகு தீர்மானிக்கப்பட்டது. இந்த முறை (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) இலிருந்து சிறிது மாற்றியமைக்கப்பட்டது. 0.1 M பாஸ்பேட் பஃபரில் (pH 6.0) புதிதாக தயாரிக்கப்பட்ட 3 மில்லி கேட்டகோல் கரைசலுடன் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்தம், MA, USA) (0.01 M) எதிர்வினைக்குப் பிறகு மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது. 240 nm (A240) இல் H2O2 இன் சிதைவைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் CAT செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது, 436 nm (A436) இல் உறிஞ்சுதல் அதிகரிப்பைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் POX செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது, மேலும் UV-160A ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 3 நிமிடங்களுக்கு ஒவ்வொரு 30 வினாடிகளுக்கும் 495 nm (A495) இல் உறிஞ்சுதல் ஏற்ற இறக்கங்களைப் பதிவு செய்வதன் மூலம் PPO செயல்பாடு அளவிடப்பட்டது (ஷிமாட்சு, ஜப்பான்).
கடைசி சிகிச்சைக்குப் பிறகு 72 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு பீன் இலைகளில் (மேலிருந்து இரண்டாவது மற்றும் மூன்றாவது முழுமையாக வளர்ந்த இலைகள்) பெராக்ஸிசோமல் கேட்டலேஸ் (PvCAT1; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். KF033307.1), சூப்பர் ஆக்சைடு டிஸ்முடேஸ் (PvSOD; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். XM_068639556.1), மற்றும் குளுதாதயோன் ரிடக்டேஸ் (PvGR; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண். KY195009.1) உள்ளிட்ட மூன்று ஆக்ஸிஜனேற்ற எதிர்ப்பு மரபணுக்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் அளவுகளைக் கண்டறிய நிகழ்நேர RT-PCR பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி சிம்ப்ளி பி டோட்டல் ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் கிட் (கேட் எண். பிஎஸ்சி 52 எஸ் 1; பயோஃப்ளக்ஸ், பயோரி டெக்னாலஜி, சீனா) பயன்படுத்தி ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. பின்னர், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி TOP ஸ்கிரிப்ட் ™ சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு கிட் பயன்படுத்தி சிடிஎன்ஏ ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. மேலே உள்ள மூன்று மரபணுக்களின் ப்ரைமர் வரிசைகள் துணை அட்டவணை S3 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுவாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் தொடர்புடைய மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCT முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது (Livak and Schmittgen, 2001). உயிரியல் அழுத்தத்தின் கீழ் ஆக்டின் நிலைத்தன்மை (பொதுவான பருப்பு வகைகள் மற்றும் ஆந்த்ராக்னோஸ் பூஞ்சையான Colletotrichum lindemuthianum இடையே பொருந்தாத தொடர்பு) மற்றும் அஜியோடிக் அழுத்தம் (வறட்சி, உப்புத்தன்மை, குறைந்த வெப்பநிலை) நிரூபிக்கப்பட்டது (Borges et al., 2012).
ஆரம்பத்தில், புரத-புரத BLAST கருவியைப் (BLASTp 2.15.0+) பயன்படுத்தி S. sclerotiorum இல் உள்ள ஆக்சலோஅசிடேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸ் (OAH) புரதங்களின் மரபணு அளவிலான சிலிகோ பகுப்பாய்வைச் செய்தோம் (BLASTp 2.15.0+). சுருக்கமாக, S. sclerotiorum (taxide: 5180) இல் உள்ள ஹோமோலோகஸ் புரதத்தை வரைபடமாக்க, வினவல் வரிசைகளாக Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 அமினோ அமிலங்கள்) மற்றும் Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 அமினோ அமிலங்கள்) ஆகியவற்றிலிருந்து OAH ஐப் பயன்படுத்தினோம். தேசிய உயிரி தொழில்நுட்ப தகவல் மையத்தின் (NCBI) வலைத்தளமான http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ இல் ஜென்பேங்கில் சமீபத்தில் கிடைத்த S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் மரபணு தரவுகளுக்கு எதிராக BLASTp செய்யப்பட்டது.
கூடுதலாக, S. sclerotiorum (SsOAH) இலிருந்து கணிக்கப்பட்ட OAH மரபணுவும், A. fijiensis CBS 313.89 இலிருந்து AfOAH இன் பரிணாம பகுப்பாய்வு மற்றும் பைலோஜெனடிக் மரமும், P. lagena இலிருந்து PlOAH ஆகியவை MEGA11 (Tamura et al., 2021) மற்றும் JTT மேட்ரிக்ஸ் அடிப்படையிலான மாதிரி (Jones et al., 1992) இல் அதிகபட்ச நிகழ்தகவு முறையைப் பயன்படுத்தி ஊகிக்கப்பட்டன. S. sclerotiorum இலிருந்து கணிக்கப்பட்ட அனைத்து OAH மரபணுக்களின் (SsOAH) புரத வரிசைகளின் பல சீரமைப்பு பகுப்பாய்வு மற்றும் கட்டுப்பாட்டு அடிப்படையிலான சீரமைப்பு கருவியைப் (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) பயன்படுத்தி வினவல் வரிசையுடன் பைலோஜெனடிக் மரம் இணைக்கப்பட்டது (Papadopoulos மற்றும் Agwarala, 2007). கூடுதலாக, S. sclerotiorum இலிருந்து SsOAH இன் சிறந்த பொருந்தக்கூடிய அமினோ அமில வரிசைகள் ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ஐப் பயன்படுத்தி வினவல் வரிசைகளுடன் (AfOAH மற்றும் PlOAH) (Larkin et al., 2007) சீரமைக்கப்பட்டன, மேலும் ESPript கருவியைப் (பதிப்பு 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) பயன்படுத்தி சீரமைப்பில் பாதுகாக்கப்பட்ட பகுதிகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
மேலும், S. sclerotiorum SsOAH இன் கணிக்கப்பட்ட செயல்பாட்டு பிரதிநிதித்துவ களங்கள் மற்றும் பாதுகாக்கப்பட்ட தளங்கள் InterPro கருவியைப் பயன்படுத்தி வெவ்வேறு குடும்பங்களாக ஊடாடும் வகையில் வகைப்படுத்தப்பட்டன (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). இறுதியாக, கணிக்கப்பட்ட S. sclerotiorum SsOAH இன் முப்பரிமாண (3D) கட்டமைப்பு மாதிரியாக்கம் புரத ஹோமோலஜி/ஒத்த அங்கீகார இயந்திரத்தைப் (Phyre2 சர்வர் பதிப்பு 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது மற்றும் SWISS-MODEL சர்வரைப் பயன்படுத்தி சரிபார்க்கப்பட்டது (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). கணிக்கப்பட்ட முப்பரிமாண கட்டமைப்புகள் (PDB வடிவம்) UCSF-Chimera தொகுப்பைப் (பதிப்பு 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) பயன்படுத்தி ஊடாடும் வகையில் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன (Pettersen et al., 2004).
ஸ்க்லரோட்டினியா ஸ்க்லரோட்டியோரமின் மைசீலியாவில் ஆக்சலோஅசிடேட் அசிடைல்ஹைட்ரோலேஸின் (SsOAH; ஜென்பேங்க் அணுகல் எண்: XM_001590428.1) டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் அளவை தீர்மானிக்க அளவு நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ஸ் PCR பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, S. ஸ்க்லரோட்டியோரம் PDB கொண்ட ஒரு பிளாஸ்கில் செலுத்தப்பட்டு, 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 150 rpm இல் 24 மணிநேரமும், நிலையான இருளில் (24 மணிநேரம்) மைசீலிய வளர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக ஒரு ஷேக்கிங் இன்குபேட்டரில் (மாதிரி: I2400, நியூ பிரன்சுவிக் சயின்டிஃபிக் கோ., எடிசன், NJ, USA) வைக்கப்பட்டது. அதன் பிறகு, செல்கள் இறுதி IC50 செறிவுகளில் (முறையே தோராயமாக 40 மற்றும் 3.2 மி.கி/லி) L-ornithine மற்றும் பூஞ்சைக் கொல்லியான Rizolex-T உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன, பின்னர் அதே நிலைமைகளின் கீழ் மற்றொரு 24 மணிநேரத்திற்கு வளர்க்கப்பட்டன. அடைகாத்த பிறகு, வளர்ப்புகள் 2500 rpm இல் 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்விற்காக சூப்பர்நேட்டண்ட் (பூஞ்சை மைசீலியம்) சேகரிக்கப்பட்டது. இதேபோல், பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களின் மேற்பரப்பில் வெள்ளை பூஞ்சை மற்றும் பருத்தி மைசீலியத்தை உருவாக்கிய பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களிலிருந்து தொற்றுக்குப் பிறகு 0, 24, 48, 72, 96 மற்றும் 120 மணிநேரங்களில் பூஞ்சை மைசீலியம் சேகரிக்கப்பட்டது. பூஞ்சை மைசீலியத்திலிருந்து RNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டது, பின்னர் மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி cDNA ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. SsOAH க்கான முதன்மை வரிசைகள் துணை அட்டவணை S3 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. SsActin (GenBank அணுகல் எண்: XM_001589919.1) வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுவாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் தொடர்புடைய மரபணு வெளிப்பாடு 2-ΔΔCT முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது (லிவாக் மற்றும் ஷ்மிட்ஜென், 2001).
சூ மற்றும் ஜாங் (2000) முறையின்படி, உருளைக்கிழங்கு டெக்ஸ்ட்ரோஸ் குழம்பு (PDB) மற்றும் பூஞ்சை நோய்க்கிருமி ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் கொண்ட தாவர மாதிரிகளில் ஆக்ஸாலிக் அமிலம் சிறிய மாற்றங்களுடன் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுருக்கமாக, S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்கள் PDB கொண்ட பிளாஸ்க்குகளில் செலுத்தப்பட்டு, பின்னர் ஒரு குலுக்கும் இன்குபேட்டரில் (மாடல் I2400, நியூ பிரன்சுவிக் சயின்டிஃபிக் கோ., எடிசன், NJ, USA) 150 rpm இல் 25 ± 2 °C இல் 3-5 நாட்களுக்கு நிலையான இருட்டில் (24 மணிநேரம்) வளர்க்கப்பட்டன. அடைகாத்த பிறகு, பூஞ்சை வளர்ப்பு முதலில் வாட்மேன் #1 வடிகட்டி காகிதம் மூலம் வடிகட்டப்பட்டு, மீதமுள்ள மைசீலியத்தை அகற்ற 5 நிமிடங்களுக்கு 2500 rpm இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. ஆக்சலேட்டின் மேலும் அளவு தீர்மானத்திற்காக சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டு 4°C இல் சேமிக்கப்பட்டது. தாவர மாதிரிகளைத் தயாரிப்பதற்காக, தோராயமாக 0.1 கிராம் தாவர திசு துண்டுகள் மூன்று முறை காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் (ஒவ்வொரு முறையும் 2 மில்லி) பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. பின்னர் மாதிரிகள் 2500 rpm இல் 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன, சூப்பர்நேட்டண்ட் வாட்மேன் எண். 1 வடிகட்டி காகிதத்தின் மூலம் உலர் வடிகட்டப்பட்டு மேலும் பகுப்பாய்விற்காக சேகரிக்கப்பட்டது.
ஆக்ஸாலிக் அமிலத்தின் அளவு பகுப்பாய்விற்கு, எதிர்வினை கலவை பின்வரும் வரிசையில் ஒரு கண்ணாடி ஸ்டாப்பர் செய்யப்பட்ட குழாயில் தயாரிக்கப்பட்டது: 0.2 மில்லி மாதிரி (அல்லது PDB கலாச்சார வடிகட்டி அல்லது ஆக்ஸாலிக் அமில நிலையான கரைசல்), 0.11 மில்லி புரோமோபீனால் நீலம் (BPB, 1 mM; ஃபிஷர் கெமிக்கல், பிட்ஸ்பர்க், PA, USA), 0.198 மில்லி 1 M சல்பூரிக் அமிலம் (H2SO4; அல்-கோம்ஹோரியா மருந்துகள் மற்றும் மருத்துவ பொருட்கள், கெய்ரோ, எகிப்து) மற்றும் 0.176 மில்லி 100 mM பொட்டாசியம் டைக்ரோமேட் (K2Cr2O7; TCI ரசாயனங்கள், போர்ட்லேண்ட், OR, USA), பின்னர் கரைசல் 4.8 மில்லிக்கு காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் நீர்த்தப்பட்டு, தீவிரமாக கலக்கப்பட்டு உடனடியாக 60 °C நீர் குளியலில் வைக்கப்பட்டது. 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, 0.5 மில்லி சோடியம் ஹைட்ராக்சைடு கரைசலை (NaOH; 0.75 M) சேர்ப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டது. எதிர்வினை கலவையின் உறிஞ்சுதல் (A600) UV-160 நிறமாலை ஒளிமானியைப் பயன்படுத்தி 600 nm இல் அளவிடப்பட்டது (ஷிமாட்ஸு கார்ப்பரேஷன், ஜப்பான்). PDB மற்றும் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர் முறையே வளர்ப்பு வடிகட்டிகள் மற்றும் தாவர மாதிரிகளின் அளவீட்டிற்கான கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. வளர்ப்பு வடிகட்டிகளில் உள்ள ஆக்சாலிக் அமில செறிவுகள், PDB ஊடகத்தின் மில்லிலிட்டருக்கு (μg.mL−1) மைக்ரோகிராம் ஆக்சாலிக் அமிலமாகவும், இலைச் சாற்றில், புதிய எடையின் ஒரு கிராமுக்கு (μg.g−1 FW) மைக்ரோகிராம் ஆக்சாலிக் அமிலமாகவும் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன, ஆக்சாலிக் அமில அளவுத்திருத்த வளைவைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக் கெமிக்கல்ஸ், வால்தம், MA, USA).
ஆய்வு முழுவதும், அனைத்து சோதனைகளும் முற்றிலும் சீரற்ற வடிவமைப்பில் (CRD) வடிவமைக்கப்பட்டன, வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால், ஒரு சிகிச்சைக்கு ஆறு உயிரியல் பிரதிகள் மற்றும் ஒரு உயிரியல் பிரதிக்கு ஐந்து தொட்டிகள் (ஒரு தொட்டிக்கு இரண்டு தாவரங்கள்) என. உயிரியல் பிரதிகள் நகல்களில் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன (இரண்டு தொழில்நுட்ப பிரதிகள்). ஒரே பரிசோதனையின் மறுஉருவாக்கத்தை சரிபார்க்க தொழில்நுட்ப பிரதிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் போலியான பிரதிகளைத் தவிர்க்க புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்படவில்லை. மாறுபாட்டின் பகுப்பாய்வு (ANOVA) ஐப் பயன்படுத்தி தரவு புள்ளிவிவர ரீதியாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து டுகே-க்ராமர் நேர்மையான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு (HSD) சோதனை (p ≤ 0.05). இன் விட்ரோ சோதனைகளுக்கு, IC50 மற்றும் IC99 மதிப்புகள் ப்ராபிட் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன மற்றும் 95% நம்பிக்கை இடைவெளிகள் கணக்கிடப்பட்டன.
எகிப்தின் எல் காபியா கவர்னரேட்டில் உள்ள பல்வேறு சோயாபீன் வயல்களில் இருந்து மொத்தம் நான்கு தனிமைப்படுத்தல்கள் சேகரிக்கப்பட்டன. PDA ஊடகத்தில், அனைத்து தனிமைப்படுத்தல்களும் கிரீமி வெள்ளை மைசீலியத்தை உற்பத்தி செய்தன, அவை விரைவாக பருத்தி வெள்ளை நிறமாகவும் (படம் 1A) பின்னர் ஸ்க்லரோஷியம் நிலையில் பழுப்பு அல்லது பழுப்பு நிறமாகவும் மாறியது. ஸ்க்லரோஷியா பொதுவாக அடர்த்தியான, கருப்பு, கோள அல்லது ஒழுங்கற்ற வடிவத்தில் இருக்கும், 5.2 முதல் 7.7 மிமீ நீளம் மற்றும் 3.4 முதல் 5.3 மிமீ விட்டம் கொண்டது (படம் 1B). நான்கு தனிமைப்படுத்தல்கள் 25 ± 2 °C வெப்பநிலையில் 10-12 நாட்கள் அடைகாத்த பிறகு வளர்ப்பு ஊடகத்தின் விளிம்பில் ஸ்க்லரோஷியாவின் விளிம்பு வடிவத்தை உருவாக்கினாலும் (படம் 1A), ஒரு தட்டுக்கு ஸ்க்லரோஷியாவின் எண்ணிக்கை அவற்றில் கணிசமாக வேறுபட்டது (P < 0.001), ஒரு தட்டுக்கு அதிக எண்ணிக்கையிலான ஸ்க்லரோஷியாவைக் கொண்ட தனிமைப்படுத்தல் 3 (ஒரு தட்டுக்கு 32.33 ± 1.53 ஸ்க்லரோஷியா; படம் 1C). இதேபோல், PDB இல் மற்ற தனிமைப்படுத்தல்களை விட ஐசோலேட் #3 அதிக ஆக்ஸாலிக் அமிலத்தை உற்பத்தி செய்தது (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; படம் 1D). ஐசோலேட் #3 பைட்டோபாத்தோஜெனிக் பூஞ்சை ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரமின் வழக்கமான உருவவியல் மற்றும் நுண்ணிய பண்புகளைக் காட்டியது. எடுத்துக்காட்டாக, PDA இல், ஐசோலேட் #3 இன் காலனிகள் வேகமாக வளர்ந்தன, கிரீமி வெள்ளை நிறத்தில் இருந்தன (படம் 1A), தலைகீழ் பழுப்பு அல்லது வெளிர் சால்மன் மஞ்சள்-பழுப்பு நிறத்தில் இருந்தன, மேலும் 9 செ.மீ விட்டம் கொண்ட தட்டின் மேற்பரப்பை முழுமையாக மூட 25 ± 2°C இல் 6-7 நாட்கள் தேவைப்பட்டன. மேலே உள்ள உருவவியல் மற்றும் நுண்ணிய பண்புகளின் அடிப்படையில், ஐசோலேட் #3 ஸ்க்லெரோட்டினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் என அடையாளம் காணப்பட்டது.
படம் 1. பொதுவான பயறு வகை பயிர்களிலிருந்து S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்களின் பண்புகள் மற்றும் நோய்க்கிருமித்தன்மை. (A) PDA ஊடகத்தில் நான்கு S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்களின் மைசீலிய வளர்ச்சி, (B) நான்கு S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்களின் ஸ்க்லெரோட்டியா, (C) ஸ்க்லெரோட்டியா எண்ணிக்கை (ஒரு தட்டில்), (D) PDB ஊடகத்தில் ஆக்சாலிக் அமில சுரப்பு (μg.mL−1), மற்றும் (E) பசுமை இல்ல நிலைமைகளின் கீழ் எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய வணிக பயறு வகை கிசா 3 இல் நான்கு S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்களின் நோய் தீவிரம் (%). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் சராசரி ± SD ஐக் குறிக்கின்றன (n = 5). வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையே புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05). (F–H) தனிமைப்படுத்தல் #3 (dpi) உடன் தடுப்பூசி போடப்பட்ட 10 நாட்களுக்குப் பிறகு, முறையே நிலத்தடி தண்டுகள் மற்றும் சிலிக்குகளில் வழக்கமான வெள்ளை அச்சு அறிகுறிகள் தோன்றின. (I) S. sclerotiorum isolate #3 இன் உள் படியெடுக்கப்பட்ட இடைவெளி (ITS) பகுதியின் பரிணாம பகுப்பாய்வு அதிகபட்ச நிகழ்தகவு முறையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது மற்றும் தேசிய உயிரி தொழில்நுட்ப தகவல் மையத்தின் (NCBI) தரவுத்தளத்திலிருந்து (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) பெறப்பட்ட 20 குறிப்பு தனிமைப்படுத்தல்கள்/விகாரங்களுடன் ஒப்பிடப்பட்டது. கிளஸ்டரிங் கோடுகளுக்கு மேலே உள்ள எண்கள் பிராந்திய கவரேஜைக் குறிக்கின்றன (%), மேலும் கிளஸ்டரிங் கோடுகளுக்கு கீழே உள்ள எண்கள் கிளை நீளத்தைக் குறிக்கின்றன.
மேலும், நோய்க்கிருமித்தன்மையை உறுதிப்படுத்த, நான்கு பெறப்பட்ட S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் தனிமைப்படுத்தல்கள், கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடிய வணிக பீன் சாகுபடியான கிசா 3 ஐ தடுப்பூசி போட பயன்படுத்தப்பட்டன, இது கோச்சின் போஸ்டுலேட்டுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் 1E). பெறப்பட்ட அனைத்து பூஞ்சை தனிமைப்படுத்தல்களும் நோய்க்கிருமிகளாக இருந்தன மற்றும் பச்சை பீனை (cv. கிசா 3) பாதிக்கக்கூடும், இது அனைத்து தரைக்கு மேலே உள்ள பகுதிகளிலும் (படம் 1F), குறிப்பாக தண்டுகளில் (படம் 1G) மற்றும் காய்களில் (படம் 1H) வழக்கமான வெள்ளை அச்சு அறிகுறிகளை ஏற்படுத்தினாலும், தடுப்பூசி போட்ட 10 நாட்களுக்குப் பிறகு (dpi), தனிமைப்படுத்தல் 3 இரண்டு சுயாதீன சோதனைகளில் மிகவும் தீவிரமான தனிமைப்படுத்தலாகும். தனிமைப்படுத்தல் 3, பீன் செடிகளில் அதிக நோய் தீவிரத்தை (%) கொண்டிருந்தது (தொற்றுக்குப் பிறகு 7, 14 மற்றும் 21 நாட்களில் முறையே 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, மற்றும் 76.7 ± 3.1; படம் 1F).
மிகவும் ஊடுருவும் S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் ஐசோலேட் #3 இன் அடையாளம், உள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் ஸ்பேசர் (ITS) வரிசைமுறையின் அடிப்படையில் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம் 1I). ஐசோலேட் #3 மற்றும் 20 குறிப்பு ஐசோலேட்கள்/விகாரங்களுக்கு இடையிலான பைலோஜெனடிக் பகுப்பாய்வு அவற்றுக்கிடையே அதிக ஒற்றுமையைக் காட்டியது (>99%). S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் ஐசோலேட் #3 (533 bp) உலர்ந்த பட்டாணி விதைகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட அமெரிக்க S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் ஐசோலேட் LPM36 (ஜென்பேங்க் அணுகல் எண் MK896659.1; 540 bp) மற்றும் வயலட் (மத்தியோலா இன்கானா) தண்டு அழுகலை ஏற்படுத்தும் சீன S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம் ஐசோலேட் YKY211 (ஜென்பேங்க் அணுகல் எண் OR206374.1; 548 bp) ஆகியவற்றுடன் அதிக ஒற்றுமையைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும், இவை அனைத்தும் டென்ட்ரோகிராமின் மேற்புறத்தில் தனித்தனியாக தொகுக்கப்பட்டுள்ளன (படம் 1I). இந்தப் புதிய வரிசைமுறை NCBI தரவுத்தளத்தில் டெபாசிட் செய்யப்பட்டு, "ஸ்க்லெரோடினியா ஸ்க்லெரோட்டியோரம் - ஐசோலேட் YN-25" (ஜென்பேங்க் அணுகல் எண் PV202792) என்று பெயரிடப்பட்டுள்ளது. ஐசோலேட் 3 மிகவும் ஊடுருவும் ஐசோலேட் என்பதைக் காணலாம்; எனவே, இந்தத் ஐசோலேட் அனைத்து அடுத்தடுத்த சோதனைகளிலும் ஆய்வுக்காகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.
S. sclerotiorum isolate 3 க்கு எதிராக வெவ்வேறு செறிவுகளில் (12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 mg/L) டயமின் L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) இன் பாக்டீரியா எதிர்ப்பு செயல்பாடு செயற்கை முறையில் ஆராயப்பட்டது. L-ornithine ஒரு பாக்டீரியா எதிர்ப்பு விளைவை ஏற்படுத்தியது மற்றும் அளவைச் சார்ந்த முறையில் S. sclerotiorum hyphae இன் ரேடியல் வளர்ச்சியை படிப்படியாகத் தடுத்தது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது (படம் 2A, B). சோதிக்கப்பட்ட அதிகபட்ச செறிவில் (125 mg/L), L-ornithine மிக உயர்ந்த மைசீலிய வளர்ச்சி தடுப்பு விகிதத்தை (99.62 ± 0.27%; படம் 2B) நிரூபித்தது, இது வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான Rizolex-T (தடுப்பு விகிதம் 99.45 ± 0.39%; படம் 2C) க்கு சமமானதாகும், இது சோதனை செய்யப்பட்ட அதிகபட்ச செறிவில் (10 mg/L), இது ஒத்த செயல்திறனைக் குறிக்கிறது.
படம் 2. ஸ்க்லரோட்டினியா ஸ்க்லரோட்டியோரத்திற்கு எதிராக எல்-ஆர்னிதினின் இன் விட்ரோ பாக்டீரியா எதிர்ப்பு செயல்பாடு. (A) எஸ். ஸ்க்லரோட்டியோரத்திற்கு எதிராக எல்-ஆர்னிதினின் வெவ்வேறு செறிவுகளின் பாக்டீரியா எதிர்ப்பு செயல்பாட்டை வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (10 மி.கி/லி) உடன் ஒப்பிடுதல். (B, C) முறையே எல்-ஆர்னிதின் (12.5, 25, 50, 75, 100 மற்றும் 125 மி.கி/லி) அல்லது ரிசோலெக்ஸ்-டி (2, 4, 6, 8 மற்றும் 10 மி.கி/லி) ஆகியவற்றின் வெவ்வேறு செறிவுகளுடன் சிகிச்சைக்குப் பிறகு எஸ். ஸ்க்லரோட்டியோரம் மைசீலியல் வளர்ச்சியின் தடுப்பு விகிதம் (%). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் சராசரி ± SD ஐக் குறிக்கின்றன (n = 5). வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05). (D, E) முறையே எல்-ஆர்னிதின் மற்றும் வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டியின் ப்ரோபிட் மாதிரி பின்னடைவு பகுப்பாய்வு. ப்ராபிட் மாதிரி பின்னடைவு கோடு ஒரு திட நீல கோட்டாகவும், நம்பக இடைவெளி (95%) ஒரு கோடிட்ட சிவப்பு கோட்டாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது.
கூடுதலாக, தடுப்பு பின்னடைவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது மற்றும் தொடர்புடைய வரைபடங்கள் அட்டவணை 1 மற்றும் படங்கள் 2D,E இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. சுருக்கமாக, L-ornithine இன் ஏற்றுக்கொள்ளக்கூடிய சாய்வு மதிப்பு (y = 2.92x − 4.67) மற்றும் தொடர்புடைய குறிப்பிடத்தக்க புள்ளிவிவரங்கள் (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 மற்றும் p < 0.0001; படம் 2D) வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 மற்றும் p < 0.0001) உடன் ஒப்பிடும்போது S. sclerotiorum க்கு எதிராக மேம்பட்ட பூஞ்சை எதிர்ப்பு செயல்பாட்டைக் குறிக்கிறது (அட்டவணை 1).
அட்டவணை 1. எஸ். ஸ்க்லரோட்டியோரமுக்கு எதிரான எல்-ஆர்னிதின் மற்றும் வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான "ரிசோலெக்ஸ்-டி" ஆகியவற்றின் அரை-அதிகபட்ச தடுப்பு செறிவு (IC50) மற்றும் IC99 (mg/l) மதிப்புகள்.
ஒட்டுமொத்தமாக, சிகிச்சையளிக்கப்படாத S. ஸ்க்லரோட்டியோரம்-பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட பொதுவான பீன்ஸ் செடிகளில் வெள்ளை பூஞ்சையின் வளர்ச்சி மற்றும் தீவிரத்தை L-ornithine (250 mg/L) கணிசமாகக் குறைத்தது (கட்டுப்பாடு; படம் 3A). சுருக்கமாக, சிகிச்சையளிக்கப்படாத பாதிக்கப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு தாவரங்களின் நோயின் தீவிரம் படிப்படியாக அதிகரித்தாலும் (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, மற்றும் 92.33 ± 3.06%), L-ornithine பரிசோதனை முழுவதும் (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, மற்றும் 26.36 ± 3.07) சிகிச்சைக்குப் பிறகு முறையே 7, 14 மற்றும் 21 நாட்களில் (dpt) நோயின் தீவிரத்தை (%) கணிசமாகக் குறைத்தது (படம் 3A). இதேபோல், S. ஸ்க்லெரோட்டியோரம்-பாதிக்கப்பட்ட பீன்ஸ் செடிகளுக்கு 250 mg/L L-ஆர்னிதைன் சிகிச்சை அளித்தபோது, ​​நோய் முன்னேற்ற வளைவின் (AUDPC) கீழ் உள்ள பகுதி சிகிச்சை அளிக்கப்படாத கட்டுப்பாட்டில் 1274.33 ± 33.13 இலிருந்து 281.03 ± 7.95 ஆகக் குறைந்தது, இது நேர்மறை கட்டுப்பாட்டு 50 mg/L Rizolex-T பூஞ்சைக் கொல்லியை விட சற்று குறைவாக இருந்தது (183.61 ± 7.71; படம் 3B). இரண்டாவது பரிசோதனையிலும் இதே போக்கு காணப்பட்டது.
படம். 3. கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் ஸ்க்லரோட்டினியா ஸ்க்லரோட்டியோரமால் ஏற்படும் பொதுவான பீனின் வெள்ளை அழுகல் வளர்ச்சியில் எல்-ஆர்னிதினை வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்துவதன் விளைவு. (அ) 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதினுடன் சிகிச்சையளித்த பிறகு பொதுவான பீனின் வெள்ளை அச்சு நோய் முன்னேற்ற வளைவு. (ஆ) எல்-ஆர்னிதினுடன் சிகிச்சையளித்த பிறகு பொதுவான பீனின் வெள்ளை அச்சு நோய் முன்னேற்ற வளைவின் (AUDPC) கீழ் உள்ள பகுதி. மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் சராசரி ± SD ஐக் குறிக்கின்றன (n = 5). வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (ப < 0.05).
42 நாட்களுக்குப் பிறகு, 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைனை வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்துவதால், தாவர உயரம் (படம் 4A), ஒரு செடிக்கு கிளைகளின் எண்ணிக்கை (படம் 4B) மற்றும் ஒரு செடிக்கு இலைகளின் எண்ணிக்கை (படம் 4C) படிப்படியாக அதிகரித்தது. வணிக ரீதியான பூஞ்சைக் கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (50 மி.கி/லி) ஆய்வு செய்யப்பட்ட அனைத்து ஊட்டச்சத்து அளவுருக்களிலும் மிகப்பெரிய விளைவைக் கொண்டிருந்தாலும், சிகிச்சையளிக்கப்படாத கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது 250 மி.கி/லி எல்-ஆர்னிதைனின் வெளிப்புற பயன்பாடு இரண்டாவது மிகப்பெரிய விளைவைக் கொண்டிருந்தது (படம் 4A–C). மறுபுறம், எல்-ஆர்னிதைன் சிகிச்சையானது ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளான குளோரோபில் a (படம் 4D) மற்றும் குளோரோபில் b (படம் 4E) ஆகியவற்றின் உள்ளடக்கத்தில் குறிப்பிடத்தக்க விளைவை ஏற்படுத்தவில்லை, ஆனால் எதிர்மறை கட்டுப்பாடு (0.44 ± 0.02 மி.கி/கிராம் fr wt) மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடு (0.46 ± 0.02 மி.கி/கிராம் fr wt; படம் 4F) உடன் ஒப்பிடும்போது மொத்த கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கம் (0.56 ± 0.03 மி.கி/கிராம் fr wt) சற்று அதிகரித்தது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் எல்-ஆர்னிதைன் பதப்படுத்தப்பட்ட பருப்பு வகைகளுக்கு பைட்டோடாக்ஸிக் அல்ல என்பதையும் அவற்றின் வளர்ச்சியைத் தூண்டக்கூடும் என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
படம் 4. கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் ஸ்க்லரோட்டினியா ஸ்க்லரோட்டியோரமால் பாதிக்கப்பட்ட பீன் இலைகளின் வளர்ச்சி பண்புகள் மற்றும் ஒளிச்சேர்க்கை நிறமிகளில் வெளிப்புற எல்-ஆர்னிதைன் பயன்பாட்டின் விளைவு. (A) தாவர உயரம் (செ.மீ), (B) ஒரு தாவரத்திற்கு கிளைகளின் எண்ணிக்கை, (C) ஒரு தாவரத்திற்கு இலைகளின் எண்ணிக்கை, (D) குளோரோபில் a உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt), (E) குளோரோபில் b உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt), (F) மொத்த கரோட்டினாய்டு உள்ளடக்கம் (mg g-1 fr wt). மதிப்புகள் ஐந்து உயிரியல் பிரதிகளின் சராசரி ± SD ஆகும் (n = 5). வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05).
எதிர்வினை ஆக்ஸிஜன் இனங்கள் (ROS; ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு [H2O2] என வெளிப்படுத்தப்படுகிறது) மற்றும் ஃப்ரீ ரேடிக்கல்கள் (சூப்பர் ஆக்சைடு அனான்கள் [O2•−] என வெளிப்படுத்தப்படுகிறது) ஆகியவற்றின் சிட்டு ஹிஸ்டோகெமிக்கல் உள்ளூர்மயமாக்கலில், L-ஆர்னிதைனின் (250 மி.கி/லி) வெளிப்புற பயன்பாடு H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; படம். 5A) மற்றும் O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; படம். 5B) குவிப்பு சிகிச்சை அளிக்கப்படாத பாதிக்கப்பட்ட தாவரங்கள் (முறையே 173.31 ± 12.06 மற்றும் 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) மற்றும் 50 மி.கி/லி வணிக பூஞ்சைக் கொல்லியான ரிசோலெக்ஸ்-டி (170.12 ± 9.50 மற்றும் 157.00 ± 7.81) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாகக் குறைந்துள்ளது. nmol.g−1 fr wt, முறையே) 72 மணிநேரத்தில். hpt இன் கீழ் அதிக அளவு H2O2 மற்றும் O2•− குவிந்துள்ளது (படம் 5A, B). இதேபோல், TCA- அடிப்படையிலான மாலோண்டியால்டிஹைட் (MDA) மதிப்பீட்டில் S. ஸ்க்லரோட்டியோரம்-பாதிக்கப்பட்ட பீன் தாவரங்கள் அவற்றின் இலைகளில் அதிக அளவு MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) குவிந்துள்ளது (படம் 5C). இருப்பினும், L-ornithine இன் வெளிப்புற பயன்பாடு லிப்பிட் பெராக்சிடேஷனைக் கணிசமாகக் குறைத்தது, சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட தாவரங்களில் MDA உள்ளடக்கம் குறைவதன் மூலம் இது நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
படம் 5. கிரீன்ஹவுஸ் நிலைமைகளின் கீழ் தொற்றுக்குப் பிறகு 72 மணிநேரத்தில் S. ஸ்க்லரோட்டியோரமால் பாதிக்கப்பட்ட பீன் இலைகளில் ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தம் மற்றும் நொதி அல்லாத ஆக்ஸிஜனேற்ற பாதுகாப்பு வழிமுறைகளின் முக்கிய குறிப்பான்களில் வெளிப்புற L-ஆர்னிதைன் பயன்பாட்டின் விளைவு. (A) ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt இல், (B) சூப்பர் ஆக்சைடு அயனி (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt இல், (C) மாலோண்டியால்டிஹைட் (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt இல், (D) மொத்த கரையக்கூடிய பீனால்கள் (mg GAE g−1 FW) 72 hpt இல், (E) மொத்த கரையக்கூடிய ஃபிளாவனாய்டுகள் (mg RE g−1 FW), (F) மொத்த இலவச அமினோ அமிலங்கள் (mg g−1 FW) 72 hpt இல், மற்றும் (G) புரோலின் உள்ளடக்கம் (mg g−1 FW) 72 hpt இல். மதிப்புகள் 5 உயிரியல் பிரதிகளின் (n = 5) சராசரி ± நிலையான விலகலை (சராசரி ± SD) குறிக்கின்றன. வெவ்வேறு எழுத்துக்கள் சிகிச்சைகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (p < 0.05).