கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் உள்ள நோயாளிகளில், குடலில் இருந்து பெறப்பட்ட டிரிப்டோபான் மெட்டாபொலைட் இண்டோல்-3-புரோபியோனிக் அமிலத்தின் (IPA) சீரம் அளவுகள் குறைவாக இருப்பதாக நாங்கள் முன்னர் தெரிவித்தோம். இந்த ஆய்வில், சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய பருமனான கல்லீரல்களில் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் DNA மெத்திலோமையும், விட்ரோவில் கல்லீரல் ஸ்டெலேட் செல்கள் (HSCs) பினோடைபிக் செயலிழப்பு தூண்டுவதில் IPA இன் பங்கையும் ஆராய்ந்தோம்.
இந்த ஆய்வில், டைப் 2 நீரிழிவு நோய் (T2DM) இல்லாத (வயது 46.8 ± 9.3 வயது; BMI: 42.7 ± 5.0 கிலோ/மீ²) 116 பருமனான நோயாளிகள் குவோபியோ பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சை மையத்தில் (KOBS) பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சைக்கு உட்படுத்தப்பட்டனர். சுற்றும் IPA அளவுகள் திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS) மூலம் அளவிடப்பட்டன, கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்வு மொத்த RNA வரிசைமுறை மூலம் செய்யப்பட்டது, மற்றும் DNA மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு இன்ஃபினியம் ஹ்யூமன்மெத்திலேஷன் 450 பீட்ஷிப்பைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. மனித கல்லீரல் ஸ்டெலேட் செல்கள் (LX-2) இன் விட்ரோ பரிசோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
கல்லீரலில் அப்போப்டோடிக், மைட்டோபேஜிக் மற்றும் நீண்ட ஆயுள் பாதைகளில் ஈடுபடும் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டுடன் சீரம் ஐபிஏ அளவுகள் தொடர்புடையவை. கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் சுயவிவரங்களில் ஏகேடி செரின்/த்ரியோனைன் கைனேஸ் 1 (ஏகேடி1) மரபணு மிகவும் மிகுதியாகவும் ஆதிக்கம் செலுத்தும் ஊடாடும் மரபணுவாகவும் இருந்தது. ஐபிஏ சிகிச்சையானது ஃபைப்ரோஸிஸ், அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் எல்எக்ஸ்-2 செல்களின் உயிர்வாழ்வை ஒழுங்குபடுத்தும் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைப்பதன் மூலம் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டியது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தைக் குறைத்தது மற்றும் செல் உருவவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலை மாற்றியது.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்தத் தரவுகள் IPA சாத்தியமான சிகிச்சை விளைவுகளைக் கொண்டிருப்பதையும், அப்போப்டொசிஸைத் தூண்டி, HSC பினோடைப்பை ஒரு செயலற்ற நிலைக்கு மாற்றக்கூடும் என்பதையும் ஆதரிக்கின்றன, இதன் மூலம் HSC செயல்படுத்தல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்தில் தலையிடுவதன் மூலம் கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸைத் தடுக்கும் சாத்தியத்தை விரிவுபடுத்துகிறது.
உடல் பருமன் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற நோய்க்குறியின் பரவலானது வளர்சிதை மாற்ற ரீதியாக தொடர்புடைய கொழுப்பு கல்லீரல் நோயின் (MASLD) அதிகரித்து வரும் நிகழ்வுகளுடன் தொடர்புடையது; இந்த நோய் பொது மக்கள் தொகையில் 25% முதல் 30% வரை பாதிக்கிறது [1]. MASLD நோயியலின் முக்கிய விளைவு கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் ஆகும், இது ஃபைப்ரஸ் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸின் (ECM) தொடர்ச்சியான குவிப்பால் வகைப்படுத்தப்படும் ஒரு மாறும் செயல்முறையாகும் [2]. கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸில் ஈடுபடும் முக்கிய செல்கள் கல்லீரல் ஸ்டெலேட் செல்கள் (HSCகள்) ஆகும், அவை நான்கு அறியப்பட்ட பினோடைப்களை வெளிப்படுத்துகின்றன: அமைதியான, செயல்படுத்தப்பட்ட, செயலிழக்கப்பட்ட மற்றும் முதிர்ச்சியடைந்த [3, 4]. HSCகள் செயல்படுத்தப்பட்டு, அதிக ஆற்றல் தேவைகளுடன் பெருக்கக்கூடிய ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் போன்ற செல்களாக, α-மென்மையான தசை ஆக்டின் (α-SMA) மற்றும் வகை I கொலாஜன் (Col-I) [5, 6] ஆகியவற்றின் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டுடன், இயக்கப்பட்ட HSCகள் அப்போப்டொசிஸ் அல்லது செயலிழப்பு மூலம் அகற்றப்படுகின்றன. கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் தலைகீழ் மாற்றத்தின் போது, ​​செயல்படுத்தப்பட்ட HSCகள் அப்போப்டொசிஸ் அல்லது செயலிழப்பு மூலம் அகற்றப்படுகின்றன. இந்த செயல்முறைகளில் ஃபைப்ரோஜெனிக் மரபணுக்களின் குறைப்பு மற்றும் உயிர்வாழும் மரபணுக்களின் பண்பேற்றம் (NF-κB மற்றும் PI3K/Akt சமிக்ஞை பாதைகள் போன்றவை) [7, 8], அத்துடன் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மற்றும் செயல்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் [9] ஆகியவை அடங்கும்.
குடலில் உற்பத்தி செய்யப்படும் டிரிப்டோபான் மெட்டாபொலைட் இண்டோல்-3-புரோபியோனிக் அமிலத்தின் (IPA) சீரம் அளவுகள், MASLD [10–13] உள்ளிட்ட மனித வளர்சிதை மாற்ற நோய்களில் குறைந்து வருவது கண்டறியப்பட்டுள்ளது. IPA உணவு நார்ச்சத்து உட்கொள்ளலுடன் தொடர்புடையது, அதன் ஆக்ஸிஜனேற்ற எதிர்ப்பு மற்றும் அழற்சி எதிர்ப்பு விளைவுகளுக்கு பெயர் பெற்றது, மேலும் உணவு-தூண்டப்பட்ட ஆல்கஹால் அல்லாத ஸ்டீட்டோஹெபடைடிஸ் (NASH) பினோடைப்பை இன் விவோ மற்றும் இன் விட்ரோவில் குறைக்கிறது [11–14]. குவோபியோ பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சை ஆய்வில் (KOBS) கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் இல்லாத பருமனான நோயாளிகளை விட கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் உள்ள நோயாளிகளில் சீரம் IPA அளவுகள் குறைவாக இருந்தன என்பதை நிரூபித்த எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் இருந்து சில சான்றுகள் வருகின்றன. மேலும், மனித கல்லீரல் ஸ்டெலேட் செல் (LX-2) மாதிரியில் செல் ஒட்டுதல், செல் இடம்பெயர்வு மற்றும் ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் செயல்படுத்தலின் கிளாசிக்கல் குறிப்பான்களான மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை IPA சிகிச்சை குறைக்கக்கூடும் என்பதையும், இது ஒரு சாத்தியமான ஹெபடோப்ரோடெக்டிவ் மெட்டாபொலிட் [15] என்பதையும் நாங்கள் காண்பித்தோம். இருப்பினும், HSC அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஎனெர்ஜிடிக்ஸ் ஆகியவற்றை செயல்படுத்துவதன் மூலம் IPA கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் பின்னடைவை எவ்வாறு தூண்டுகிறது என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை.
இங்கே, சீரம் IPA, பருமனான ஆனால் வகை 2 நீரிழிவு நோய் (KOBS) இல்லாத நபர்களின் கல்லீரலில் அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோபாகி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் பாதைகளில் செறிவூட்டப்பட்ட மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டுடன் தொடர்புடையது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். மேலும், IPA செயலிழக்கச் செய்யும் பாதை வழியாக செயல்படுத்தப்பட்ட ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களை (HSCs) அகற்றுதல் மற்றும் சிதைவைத் தூண்ட முடியும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம். இந்த முடிவுகள் IPA-க்கு ஒரு புதிய பங்கை வெளிப்படுத்துகின்றன, இது கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் பின்னடைவை ஊக்குவிப்பதற்கான ஒரு சாத்தியமான சிகிச்சை இலக்காக அமைகிறது.
KOBS குழுவில் நடத்தப்பட்ட முந்தைய ஆய்வில், கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் உள்ள நோயாளிகளுக்கு கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸ் இல்லாத நோயாளிகளுடன் ஒப்பிடும்போது குறைந்த சுழற்சி IPA அளவுகள் இருப்பதாகக் காட்டியது [15]. வகை 2 நீரிழிவு நோயின் சாத்தியமான குழப்பமான விளைவை விலக்க, நடந்துகொண்டிருக்கும் KOBS ஆய்வில் இருந்து வகை 2 நீரிழிவு நோய் இல்லாத 116 பருமனான நோயாளிகளை (சராசரி வயது ± SD: 46.8 ± 9.3 ஆண்டுகள்; BMI: 42.7 ± 5.0 கிலோ/மீ2) (அட்டவணை 1) நாங்கள் சேர்த்துக் கொண்டோம் [16]. அனைத்து பங்கேற்பாளர்களும் எழுத்துப்பூர்வமாக ஒப்புதல் அளித்தனர் மற்றும் ஹெல்சின்கி பிரகடனத்தின் (54/2005, 104/2008 மற்றும் 27/2010) படி வடக்கு சாவோ கவுண்டி மருத்துவமனையின் நெறிமுறைகள் குழுவால் ஆய்வு நெறிமுறை அங்கீகரிக்கப்பட்டது.
பேரியாட்ரிக் அறுவை சிகிச்சையின் போது கல்லீரல் பயாப்ஸி மாதிரிகள் பெறப்பட்டன, மேலும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட அளவுகோல்களின்படி அனுபவம் வாய்ந்த நோயியல் நிபுணர்களால் ஹிஸ்டாலஜிக்கல் முறையில் மதிப்பிடப்பட்டன [17, 18]. மதிப்பீட்டு அளவுகோல்கள் துணை அட்டவணை S1 இல் சுருக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் அவை முன்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன [19].
வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்விற்காக (n = 116) இலக்கற்ற திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS) மூலம் உண்ணாவிரத சீரம் மாதிரிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, மாதிரிகள் UHPLC-qTOF-MS அமைப்பைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன (1290 LC, 6540 qTOF-MS, அஜிலன்ட் டெக்னாலஜிஸ், வால்ட்பிரான், கார்ல்ஸ்ரூஹே, ஜெர்மனி). ஐசோபிரைல் ஆல்கஹால் (IPA) அடையாளம் காணப்படுவது தக்கவைப்பு நேரம் மற்றும் MS/MS ஸ்பெக்ட்ரத்தை தூய தரங்களுடன் ஒப்பிடுவதன் அடிப்படையில் அமைந்தது. IPA சமிக்ஞை தீவிரம் (உச்ச பகுதி) மேலும் அனைத்து பகுப்பாய்வுகளிலும் கருதப்பட்டது [20].
இல்லுமினா ஹைசெக் 2500 ஐப் பயன்படுத்தி முழு கல்லீரல் ஆர்.என்.ஏ வரிசைமுறை செய்யப்பட்டது, மேலும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி தரவு முன் செயலாக்கப்பட்டது [19, 21, 22]. மிட்டோமினர் 4.0 தரவுத்தளத்திலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட 1957 மரபணுக்களைப் பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு/பயோஜெனீசிஸைப் பாதிக்கும் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் இலக்கு வேறுபட்ட வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம் [23]. முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட அதே முறையைப் பயன்படுத்தி இன்ஃபினியம் ஹ்யூமன்மெதிலேஷன் 450 பீட்ஷிப் (இல்லுமினா, சான் டியாகோ, சிஏ, அமெரிக்கா) ஐப் பயன்படுத்தி கல்லீரல் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது [24, 25].
மனித கல்லீரல் ஸ்டெலேட் செல்கள் (LX-2) பேராசிரியர் ஸ்டெஃபனோ ரோமியோவால் அன்புடன் வழங்கப்பட்டன, மேலும் அவை DMEM/F12 ஊடகத்தில் (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) வளர்க்கப்பட்டு பராமரிக்கப்பட்டன. IPA இன் செயல்பாட்டு அளவைத் தேர்ந்தெடுக்க, LX-2 செல்கள் DMEM/F12 ஊடகத்தில் 24 மணிநேரத்திற்கு வெவ்வேறு செறிவுகளில் IPA (10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM; Sigma, 220027) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. மேலும், HSC களை செயலிழக்கச் செய்யும் IPA இன் திறனை ஆராய, LX-2 செல்கள் 5 ng/ml TGF-β1 (R&D அமைப்புகள், 240-B-002/CF) மற்றும் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 1 mM IPA உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு இணைந்து சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. தொடர்புடைய வாகனக் கட்டுப்பாடுகளுக்கு, 0.1% BSA கொண்ட 4 nM HCL TGF-β1 சிகிச்சைக்கும், 0.05% DMSO IPA சிகிச்சைக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் இரண்டும் கூட்டு சிகிச்சைக்காக ஒன்றாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) உடன் FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ஐப் பயன்படுத்தி அப்போப்டொசிஸ் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, LX-2 (1 × 105 செல்கள்/கிணறு) 12-கிணறு தகடுகளில் ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டு, பின்னர் பல அளவுகளில் IPA அல்லது IPA மற்றும் TGF-β1 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது. அடுத்த நாள், மிதக்கும் மற்றும் ஒட்டக்கூடிய செல்கள் சேகரிக்கப்பட்டு, ட்ரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, PBS உடன் கழுவப்பட்டு, Annexin V பிணைப்பு இடையகத்தில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, FITC-Annexin V மற்றும் 7-AAD உடன் 15 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன.
உயிருள்ள செல்களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியா, Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ஐப் பயன்படுத்தி ஆக்ஸிஜனேற்ற செயல்பாட்டிற்காக சாயமிடப்பட்டது. MTR மதிப்பீடுகளுக்கு, LX-2 செல்கள் IPA மற்றும் TGF-β1 உடன் சம அடர்த்தியில் அடைகாக்கப்பட்டன. 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, உயிருள்ள செல்கள் ட்ரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, PBS உடன் கழுவப்பட்டு, பின்னர் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி 20 நிமிடங்களுக்கு சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 100 μM MTR உடன் அடைகாக்கப்பட்டன [26]. நேரடி செல் உருவவியல் பகுப்பாய்விற்கு, செல் அளவு மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலானது முறையே முன்னோக்கி சிதறல் (FSC) மற்றும் பக்க சிதறல் (SSC) அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
அனைத்து தரவுகளும் (30,000 நிகழ்வுகள்) NovoCyte Quanteon (Agilent) ஐப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்டு NovoExpress® 1.4.1 அல்லது FlowJo V.10 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, சீஹார்ஸ் எக்ஸ்எஃப் செல் மிட்டோ ஸ்ட்ரெஸ் பொருத்தப்பட்ட சீஹார்ஸ் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் ஃப்ளக்ஸ் அனலைசரை (அஜிலன்ட் டெக்னாலஜிஸ், சாண்டா கிளாரா, சிஏ) பயன்படுத்தி ஆக்ஸிஜன் நுகர்வு விகிதம் (OCR) மற்றும் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் அமிலமயமாக்கல் விகிதம் (ECAR) நிகழ்நேரத்தில் அளவிடப்பட்டன. சுருக்கமாக, 2 × 104 LX-2 செல்கள்/கிணறு XF96 செல் வளர்ப்புத் தகடுகளில் விதைக்கப்பட்டன. இரவு முழுவதும் அடைகாத்த பிறகு, செல்கள் ஐசோபுரோபனால் (IPA) மற்றும் TGF-β1 (துணை முறைகள் 1) மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. சீஹார்ஸ் எக்ஸ்எஃப் அலை மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, இதில் சீஹார்ஸ் எக்ஸ்எஃப் செல் எனர்ஜி ஃபீனோடைப் சோதனை அறிக்கை ஜெனரேட்டர் அடங்கும். இதிலிருந்து, ஒரு பயோஎனெர்ஜெடிக் ஹெல்த் இன்டெக்ஸ் (BHI) கணக்கிடப்பட்டது [27].
மொத்த RNA cDNA-வில் படியெடுக்கப்பட்டது. குறிப்பிட்ட முறைகளுக்கு, குறிப்பு [15] ஐப் பார்க்கவும். மனித 60S ரைபோசோமால் அமில புரதம் P0 (RPLP0) மற்றும் சைக்ளோபிலின் A1 (PPIA) mRNA அளவுகள் கட்டமைப்பு மரபணு கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR அமைப்பு (தெர்மோ ஃபிஷர், லேண்ட்ஸ்மீர், நெதர்லாந்து) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) அல்லது Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) உடன் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் ஒப்பீட்டு Ct மதிப்பு சுழற்சி அளவுருக்கள் (ΔΔCt) மற்றும் ∆∆Ct முறையைப் பயன்படுத்தி தொடர்புடைய மரபணு வெளிப்பாடு மடிப்பு கணக்கிடப்பட்டது. ப்ரைமர்களின் விவரங்கள் துணை அட்டவணைகள் S2 மற்றும் S3 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி [28] DNeasy இரத்தம் மற்றும் திசு கருவித்தொகுப்பைப் (Qiagen) பயன்படுத்தி அணுக்கரு DNA (ncDNA) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் DNA (mtDNA) பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. துணை முறைகள் 2 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, ஒவ்வொரு இலக்கு mtDNA பகுதியின் விகிதத்தையும் மூன்று அணுக்கரு DNA பகுதிகளின் (mtDNA/ncDNA) வடிவியல் சராசரிக்குக் கணக்கிடுவதன் மூலம் mtDNA இன் ஒப்பீட்டு அளவு கணக்கிடப்பட்டது. mtDNA மற்றும் ncDNA க்கான முதன்மைப் பொருட்களின் விவரங்கள் துணை அட்டவணை S4 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
உயிருள்ள செல்கள், இடைச்செருகல் மற்றும் உள்செல்லுலார் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளைக் காட்சிப்படுத்த Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) மூலம் சாயமிடப்பட்டன. LX-2 செல்கள் (1 × 104 செல்கள்/கிணறு) கண்ணாடி ஸ்லைடுகளில் தொடர்புடைய கண்ணாடி-அடிமட்ட கலாச்சாரத் தகடுகளில் (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) வளர்க்கப்பட்டன. 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, உயிருள்ள LX-2 செல்கள் 37 °C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு 100 μM MTR உடன் அடைகாக்கப்பட்டன, மேலும் செல் கருக்கள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) உடன் சாயமிடப்பட்டன [29]. மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகள், 63×NA 1.3 நோக்கத்தைப் பயன்படுத்தி 5% CO2 உடன் ஈரப்பதமான வளிமண்டலத்தில் 37 °C இல் Zeiss LSM 800 கன்ஃபோகல் தொகுதியுடன் பொருத்தப்பட்ட Zeiss Axio Observer தலைகீழ் நுண்ணோக்கியைப் (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. ஒவ்வொரு மாதிரி வகைக்கும் பத்து Z-தொடர் படங்களை நாங்கள் பெற்றுள்ளோம். ஒவ்வொரு Z-தொடரும் 30 பிரிவுகளைக் கொண்டுள்ளது, ஒவ்வொன்றும் 9.86 μm தடிமன் கொண்டது. ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும், ZEN 2009 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி பத்து வெவ்வேறு பார்வை புலங்களின் படங்கள் பெறப்பட்டன (கார்ல் ஜெய்ஸ் மைக்ரோஇமேஜிங் GmbH, ஜெனா, ஜெர்மனி), மேலும் துணை முறைகள் 3 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள அளவுருக்களின்படி ImageJ மென்பொருளை (v1.54d) [30, 31] பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
செல்கள் 0.1 M பாஸ்பேட் பஃபரில் 2% குளுடரால்டிஹைடுடன் சரி செய்யப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து 1% ஆஸ்மியம் டெட்ராக்சைடு கரைசலுடன் (சிக்மா ஆல்ட்ரிச், MO, USA) சரி செய்யப்பட்டன, படிப்படியாக அசிட்டோனுடன் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) நீரிழப்பு செய்யப்பட்டன, இறுதியாக எபோக்சி பிசினில் பதிக்கப்பட்டன. மிக மெல்லிய பகுதிகள் தயாரிக்கப்பட்டு 1% யுரேனைல் அசிடேட் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) மற்றும் 1% லீட் சிட்ரேட் (மெர்க், டார்ம்ஸ்டாட், ஜெர்மனி) ஆகியவற்றைக் கொண்டு கறை படிந்தன. 80 kV முடுக்கி மின்னழுத்தத்தில் JEM 2100F EXII டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கியை (JEOL லிமிடெட், டோக்கியோ, ஜப்பான்) பயன்படுத்தி அல்ட்ராஸ்ட்ரக்சரல் படங்கள் பெறப்பட்டன.
24 மணிநேரத்திற்கு IPA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட LX-2 செல்களின் உருவவியல், Zeiss தலைகீழ் ஒளி நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி 50x உருப்பெருக்கத்தில் கட்ட-மாறுபாடு நுண்ணோக்கி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (Zeiss Axio Vert.A1 மற்றும் AxioCam MRm, Jena, ஜெர்மனி).
மருத்துவத் தரவு சராசரி ± நிலையான விலகல் அல்லது சராசரி (இடைக்கால வரம்பு: IQR) என வெளிப்படுத்தப்பட்டது. மூன்று ஆய்வுக் குழுக்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகளை ஒப்பிடுவதற்கு மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு (தொடர்ச்சியான மாறிகள்) அல்லது χ² சோதனை (வகைப்படுத்தப்பட்ட மாறிகள்) பயன்படுத்தப்பட்டன. பல சோதனைகளுக்கு சரிசெய்ய தவறான நேர்மறை விகிதம் (FDR) பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் FDR < 0.05 உடன் மரபணுக்கள் புள்ளிவிவர ரீதியாக முக்கியத்துவம் வாய்ந்ததாகக் கருதப்பட்டன. சிபிஜி டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனை ஐபிஏ சிக்னல் தீவிரத்துடன் தொடர்புபடுத்த ஸ்பியர்மேன் தொடர்பு பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது, பெயரளவு p மதிப்புகள் (p < 0.05) தெரிவிக்கப்பட்டன.
சீரம் IPA அளவுகளை சுழற்றுவதோடு தொடர்புடைய 3093 கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளில் 268 டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (பெயரளவு p < 0.01), 119 மைட்டோகாண்ட்ரியா-தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (பெயரளவு p < 0.05) மற்றும் 4350 CpG களுக்கு வலை அடிப்படையிலான மரபணு தொகுப்பு பகுப்பாய்வு கருவி (WebGestalt) ஐப் பயன்படுத்தி பாதை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. இலவசமாகக் கிடைக்கும் Venny DB (பதிப்பு 2.1.0) கருவி ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த மரபணுக்களைக் கண்டறியப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் StringDB (பதிப்பு 11.5) புரத-புரத தொடர்புகளைக் காட்சிப்படுத்தப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
LX-2 பரிசோதனைக்காக, மாதிரிகள் டி'அகோஸ்டினோ-பியர்சன் சோதனையைப் பயன்படுத்தி இயல்புநிலைக்கு சோதிக்கப்பட்டன. குறைந்தது மூன்று உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து தரவு பெறப்பட்டு, போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனையுடன் ஒரு வழி ANOVA க்கு உட்படுத்தப்பட்டது. 0.05 க்கும் குறைவான p-மதிப்பு புள்ளிவிவர ரீதியாக முக்கியத்துவம் வாய்ந்ததாகக் கருதப்பட்டது. தரவு சராசரி ± SD ஆக வழங்கப்படுகிறது, மேலும் சோதனைகளின் எண்ணிக்கை ஒவ்வொரு படத்திலும் குறிக்கப்படுகிறது. அனைத்து பகுப்பாய்வுகளும் வரைபடங்களும் Windows க்கான GraphPad Prism 8 புள்ளிவிவர மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன (GraphPad Software Inc., பதிப்பு 8.4.3, San Diego, USA).
முதலில், கல்லீரல், முழு உடல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுடன் சீரம் IPA அளவுகளின் தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். மொத்த டிரான்ஸ்கிரிப்ட் சுயவிவரத்தில், சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய வலுவான மரபணு MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; மைட்டோஜென்-செயல்படுத்தப்பட்ட புரத கைனேஸ்-செயல்படுத்தப்பட்ட புரத கைனேஸ் 3); மைட்டோகாண்ட்ரியா தொடர்பான டிரான்ஸ்கிரிப்ட் சுயவிவரத்தில், வலுவான தொடர்புடைய மரபணு AKT1 (FDR = 0.7621; AKT செரின்/த்ரோயோனைன் கைனேஸ் 1) (கூடுதல் கோப்பு 1 மற்றும் கூடுதல் கோப்பு 2) ஆகும்.
பின்னர் நாங்கள் உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (n = 268; p < 0.01) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியா-தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (n = 119; p < 0.05) ஆகியவற்றை பகுப்பாய்வு செய்தோம், இறுதியில் அப்போப்டொசிஸை மிகவும் குறிப்பிடத்தக்க நியதி பாதையாக அடையாளம் கண்டோம் (p = 0.0089). சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கு, அப்போப்டொசிஸ் (FDR = 0.00001), மைட்டோபேஜி (FDR = 0.00029), மற்றும் TNF சிக்னலிங் பாதைகள் (FDR = 0.000006) ஆகியவற்றில் கவனம் செலுத்தினோம் (படம் 1A, அட்டவணை 2, மற்றும் துணை புள்ளிவிவரங்கள் 1A-B).
சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய மனித கல்லீரலில் உலகளாவிய, மைட்டோகாண்ட்ரியா-தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றின் ஒன்றுடன் ஒன்று பகுப்பாய்வு. A என்பது 268 உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள், 119 மைட்டோகாண்ட்ரியா-தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களைக் குறிக்கிறது, அவை சீரம் IPA அளவுகளுடன் தொடர்புடைய 3092 CpG தளங்களுடன் மேப் செய்யப்பட்டுள்ளன (உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன்களுக்கு p மதிப்புகள் <0.01, மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியா டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கு p மதிப்புகள் <0.05). முக்கிய ஒன்றுடன் ஒன்று டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் நடுவில் காட்டப்பட்டுள்ளன (AKT1 மற்றும் YKT6). B மற்ற மரபணுக்களுடன் அதிக தொடர்பு மதிப்பெண் (0.900) கொண்ட 13 மரபணுக்களின் தொடர்பு வரைபடம், StringDB என்ற ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தி சீரம் IPA அளவுகளுடன் கணிசமாக தொடர்புடைய 56 ஒன்றுடன் ஒன்று மரபணுக்களிலிருந்து (கருப்பு கோடு பகுதி) கட்டமைக்கப்பட்டது. பச்சை: மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) செல்லுலார் கூறுக்கு மேப் செய்யப்பட்ட மரபணுக்கள்: மைட்டோகாண்ட்ரியா (GO:0005739). தரவுகளின் அடிப்படையில் (உரைச் செயலாக்கம், பரிசோதனைகள், தரவுத்தளங்கள் மற்றும் இணை வெளிப்பாடு ஆகியவற்றின் அடிப்படையில்) பிற புரதங்களுடனான தொடர்புகளுக்கு AKT1 அதிக மதிப்பெண் (0.900) கொண்ட புரதமாகும். நெட்வொர்க் முனைகள் புரதங்களைக் குறிக்கின்றன, மற்றும் விளிம்புகள் புரதங்களுக்கு இடையிலான இணைப்புகளைக் குறிக்கின்றன.
குடல் நுண்ணுயிரி வளர்சிதை மாற்றங்கள் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் மூலம் எபிஜெனெடிக் கலவையை ஒழுங்குபடுத்த முடியும் என்பதால் [32], சீரம் ஐபிஏ அளவுகள் கல்லீரல் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனுடன் தொடர்புடையதா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். சீரம் ஐபிஏ அளவுகளுடன் தொடர்புடைய இரண்டு முக்கிய மெத்திலேஷன் தளங்கள் புரோலின்-செரின் நிறைந்த பகுதி 3 (C19orf55) மற்றும் வெப்ப அதிர்ச்சி புரத குடும்பம் பி (சிறிய) உறுப்பினர் 6 (HSPB6) (கூடுதல் கோப்பு 3) அருகே இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். 4350 CpG (p < 0.01) இன் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் சீரம் ஐபிஏ அளவுகளுடன் தொடர்புடையது மற்றும் நீண்ட ஆயுள் ஒழுங்குமுறை பாதைகளில் செறிவூட்டப்பட்டது (p = 0.006) (படம் 1A, அட்டவணை 2, மற்றும் துணை படம் 1C).
மனித கல்லீரலில் சீரம் IPA அளவுகள், உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள், மைட்டோகாண்ட்ரியாவுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் DNA மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்புகளின் அடிப்படையிலான உயிரியல் வழிமுறைகளைப் புரிந்து கொள்ள, முந்தைய பாதை பகுப்பாய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட மரபணுக்களின் ஒன்றுடன் ஒன்று பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 1A). 56 ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த மரபணுக்களின் பாதை செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வின் முடிவுகள் (படம் 1A இல் உள்ள கருப்புக் கோட்டின் உள்ளே) அப்போப்டோசிஸ் பாதை (p = 0.00029) மூன்று பகுப்பாய்வுகளுக்கு பொதுவான இரண்டு மரபணுக்களை முன்னிலைப்படுத்தியது என்பதைக் காட்டியது: AKT1 மற்றும் YKT6 (YKT6 v-SNARE ஹோமோலாக்), வென் வரைபடத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி (துணை படம் 2 மற்றும் படம் 1A). சுவாரஸ்யமாக, AKT1 (cg19831386) மற்றும் YKT6 (cg24161647) சீரம் IPA அளவுகளுடன் நேர்மறையாக தொடர்புடையவை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (கூடுதல் கோப்பு 3). மரபணு தயாரிப்புகளுக்கு இடையிலான சாத்தியமான புரத தொடர்புகளை அடையாளம் காண, உள்ளீடாக 56 ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த மரபணுக்களில் அதிக பொதுவான பிராந்திய மதிப்பெண் (0.900) கொண்ட 13 மரபணுக்களைத் தேர்ந்தெடுத்து ஒரு தொடர்பு வரைபடத்தை உருவாக்கினோம். நம்பிக்கை நிலை (விளிம்பு நம்பிக்கை) படி, அதிக மதிப்பெண் (0.900) கொண்ட AKT1 மரபணு மேலே இருந்தது (படம் 1B).
பாதை பகுப்பாய்வின் அடிப்படையில், அப்போப்டோசிஸ் முக்கிய பாதை என்பதைக் கண்டறிந்தோம், எனவே IPA சிகிச்சையானது இன் விட்ரோவில் HSC களின் அப்போப்டோசிஸை பாதிக்குமா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். IPA இன் வெவ்வேறு அளவுகள் (10 μM, 100 μM, மற்றும் 1 mM) LX-2 செல்களுக்கு நச்சுத்தன்மையற்றவை என்பதை நாங்கள் முன்னர் நிரூபித்தோம் [15]. 10 μM மற்றும் 100 μM இல் IPA சிகிச்சை சாத்தியமான மற்றும் நெக்ரோடிக் செல்களின் எண்ணிக்கையை அதிகரித்ததாக இந்த ஆய்வு காட்டுகிறது. இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​செல் நம்பகத்தன்மை 1 mM IPA செறிவில் குறைந்தது, அதே நேரத்தில் செல் நெக்ரோசிஸ் விகிதம் மாறாமல் இருந்தது (படம் 2A, B). அடுத்து, LX-2 செல்களில் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டுவதற்கான உகந்த செறிவைக் கண்டறிய, 24 மணிநேரத்திற்கு 10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM IPA ஐ சோதித்தோம் (படம் 2A-E மற்றும் துணை படம் 3A-B). சுவாரஸ்யமாக, IPA 10 μM மற்றும் 100 μM அப்போப்டோசிஸ் வீதத்தைக் குறைத்தன (%), இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது IPA 1 mM தாமதமான அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் அப்போப்டோசிஸ் வீதத்தை (%) அதிகரித்தது, எனவே மேலும் பரிசோதனைகளுக்குத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது (படங்கள் 2A–D).
IPA LX-2 செல்களின் அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டுகிறது. ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் அப்போப்டோடிக் வீதத்தையும் செல் உருவ அமைப்பையும் அளவிட அனெக்சின் V மற்றும் 7-AAD இரட்டை கறை படிதல் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. BA செல்கள் 10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM IPA உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு அல்லது F–H TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணிநேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டன. A: உயிருள்ள செல்கள் (Anexin V -/ 7AAD-); B: நெக்ரோடிக் செல்கள் (Anexin V -/ 7AAD+); C, F: ஆரம்ப (Anexin V +/ 7AAD-); D, G: தாமதமான (Anexin V+/7AAD.+); E, H: அப்போப்டோடிக் விகிதத்தில் மொத்த ஆரம்ப மற்றும் தாமதமான அப்போப்டோடிக் செல்களின் சதவீதம் (%). தரவு சராசரி ± SD, n = 3 சுயாதீன சோதனைகளாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. போன்ஃபெரோனி போஸ்ட் ஹாக் சோதனையுடன் ஒரு வழி ANOVA ஐப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *ப < 0.05; ****ப < 0.0001
முன்னர் நாம் காட்டியபடி, 5 ng/ml TGF-β1, கிளாசிக்கல் மார்க்கர் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை அதிகரிப்பதன் மூலம் HSC செயல்பாட்டைத் தூண்டலாம் [15]. LX-2 செல்கள் 5 ng/ml TGF-β1 மற்றும் 1 mM IPA உடன் இணைந்து சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன (படம் 2E–H). TGF-β1 சிகிச்சையானது அப்போப்டொசிஸ் விகிதத்தை மாற்றவில்லை, இருப்பினும், TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடும்போது IPA இணை சிகிச்சையானது தாமதமான அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் அப்போப்டொசிஸ் வீதத்தை (%) அதிகரித்தது (படம் 2E–H). இந்த முடிவுகள், TGF-β1 தூண்டலைப் பொருட்படுத்தாமல் LX-2 செல்களில் 1 mM IPA அப்போப்டொசிஸை ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தில் IPA-வின் விளைவை நாங்கள் மேலும் ஆராய்ந்தோம். 1 mM IPA ஆக்ஸிஜன் நுகர்வு விகிதம் (OCR) அளவுருக்களைக் குறைத்ததாக முடிவுகள் காட்டுகின்றன: கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது மைட்டோகாண்ட்ரியல் அல்லாத சுவாசம், அடிப்படை மற்றும் அதிகபட்ச சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு மற்றும் ATP உற்பத்தி (படம் 3A, B), அதே நேரத்தில் உயிரி ஆற்றல் சுகாதார குறியீடு (BHI) மாறவில்லை.
LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தை IPA குறைக்கிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச வளைவு (OCR) மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச அளவுருக்களாக (மைட்டோகாண்ட்ரியல் அல்லாத சுவாசம், அடிப்படை சுவாசம், அதிகபட்ச சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு, ATP உருவாக்கம், SRC மற்றும் BHI) வழங்கப்படுகிறது. A மற்றும் B செல்கள் முறையே 10 μM, 100 μM மற்றும் 1 mM IPA உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டன. C மற்றும் D செல்கள் முறையே TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணிநேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டன. அனைத்து அளவீடுகளும் CyQuant கருவியைப் பயன்படுத்தி DNA உள்ளடக்கத்திற்கு இயல்பாக்கப்பட்டன. BHI: உயிரியல் ஆற்றல்மிக்க சுகாதார குறியீடு; SRC: சுவாச இருப்பு திறன்; OCR: ஆக்ஸிஜன் நுகர்வு விகிதம். தரவு சராசரி ± நிலையான விலகல் (SD), n = 5 சுயாதீன சோதனைகளாக வழங்கப்படுகிறது. ஒரு வழி ANOVA மற்றும் Bonferroni பிந்தைய தற்காலிக சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; மற்றும் ***p < 0.001
TGF-β1-செயல்படுத்தப்பட்ட LX-2 செல்களின் பயோஎனெர்ஜிடிக் சுயவிவரத்தில் IPA-வின் விளைவைப் பற்றிய விரிவான புரிதலைப் பெற, OCR மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷனை பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 3C,D). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது TGF-β1 சிகிச்சையானது அதிகபட்ச சுவாசம், சுவாச இருப்பு திறன் (SRC) மற்றும் BHI ஆகியவற்றைக் குறைக்கக்கூடும் என்று முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 3C,D). கூடுதலாக, கூட்டு சிகிச்சையானது அடிப்படை சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு மற்றும் ATP உற்பத்தியைக் குறைத்தது, ஆனால் SRC மற்றும் BHI ஆகியவை TGF-β1 (படம் 3C,D) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டதை விட கணிசமாக அதிகமாக இருந்தன.
சீஹார்ஸ் மென்பொருள் வழங்கிய "செல்லுலார் எனர்ஜி பினோடைப் சோதனையையும்" நாங்கள் செய்தோம் (துணை படம் 4A–D). துணை படம் 3B இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, TGF-β1 சிகிச்சைக்குப் பிறகு OCR மற்றும் ECAR வளர்சிதை மாற்ற ஆற்றல்கள் இரண்டும் குறைக்கப்பட்டன, இருப்பினும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது சேர்க்கை மற்றும் IPA சிகிச்சை குழுக்களில் எந்த வித்தியாசமும் காணப்படவில்லை. மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது சேர்க்கை மற்றும் IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு OCR இன் அடிப்படை மற்றும் அழுத்த அளவுகள் இரண்டும் குறைக்கப்பட்டன (துணை படம் 4C). சுவாரஸ்யமாக, சேர்க்கை சிகிச்சையுடன் இதேபோன்ற முறை காணப்பட்டது, அங்கு TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடும்போது ECAR இன் அடிப்படை மற்றும் அழுத்த அளவுகளில் எந்த மாற்றமும் காணப்படவில்லை (துணை படம் 4C). HSC களில், மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷனில் குறைவு மற்றும் TGF-β1 சிகிச்சைக்கு வெளிப்பட்ட பிறகு SCR மற்றும் BHI ஐ மீட்டெடுக்கும் கூட்டு சிகிச்சையின் திறன் ஆகியவை வளர்சிதை மாற்ற திறனை (OCR மற்றும் ECAR) மாற்றவில்லை. ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் IPA, HSC களில் உயிரியக்க ஆற்றலைக் குறைக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது, இது IPA, HSC பினோடைப்பை செயலிழக்கச் செய்யும் நோக்கி மாற்றும் குறைந்த ஆற்றல்மிக்க சுயவிவரத்தைத் தூண்டக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது (துணை படம் 4D).
மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியலில் IPA இன் விளைவு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் மற்றும் நெட்வொர்க் இணைப்புகளின் முப்பரிமாண அளவீடு மற்றும் MTR சாயமிடுதலைப் பயன்படுத்தி ஆராயப்பட்டது (படம் 4 மற்றும் துணை படம் 5). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 சிகிச்சையானது சராசரி மேற்பரப்புப் பகுதி, கிளை எண், மொத்த கிளை நீளம் மற்றும் கிளை சந்திப்பு எண் (படம் 4A மற்றும் B) ஆகியவற்றைக் குறைத்து, மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விகிதத்தை கோளத்திலிருந்து இடைநிலை உருவவியலுக்கு மாற்றியது (படம் 4C) என்பதைக் காட்டுகிறது. IPA சிகிச்சை மட்டுமே சராசரி மைட்டோகாண்ட்ரியல் அளவைக் குறைத்து, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் விகிதத்தை கோளத்திலிருந்து இடைநிலை உருவவியலுக்கு மாற்றியது (படம் 4A). இதற்கு நேர்மாறாக, மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு திறன் சார்ந்த MTR (படம் 4A மற்றும் E) ஆல் மதிப்பிடப்பட்ட கோளத்தன்மை, சராசரி கிளை நீளம் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மாறாமல் இருந்தன, மேலும் இந்த அளவுருக்கள் குழுக்களிடையே வேறுபடவில்லை. ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், TGF-β1 மற்றும் IPA சிகிச்சையானது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவம் மற்றும் அளவு மற்றும் வாழும் LX-2 செல்களில் நெட்வொர்க் சிக்கலான தன்மையை மாற்றியமைக்கிறது என்று இந்த முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ மிகுதியை ஐபிஏ மாற்றுகிறது. அ. சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணிநேரத்திற்கு TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் அடைகாக்கப்பட்ட நேரடி LX-2 செல்களின் பிரதிநிதித்துவ கன்ஃபோகல் படங்கள், மைட்டோட்ராக்கர்™ சிவப்பு CMXRos உடன் கறை படிந்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க்குகளையும் DAPI உடன் நீல நிறத்தில் கருக்களையும் காட்டுகின்றன. அனைத்து தரவுகளும் ஒரு குழுவிற்கு குறைந்தது 15 படங்களைக் கொண்டிருந்தன. ஒவ்வொரு மாதிரி வகைக்கும் 10 Z-ஸ்டாக் படங்களை நாங்கள் பெற்றோம். ஒவ்வொரு Z-அச்சு வரிசையிலும் 30 துண்டுகள் இருந்தன, ஒவ்வொன்றும் 9.86 μm தடிமன் கொண்டது. அளவுகோல் பட்டை: 10 μm. பி. படத்திற்கு தகவமைப்பு வரம்புகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட பிரதிநிதித்துவ பொருள்கள் (மைட்டோகாண்ட்ரியா மட்டும்). ஒவ்வொரு குழுவிலும் உள்ள அனைத்து செல்களுக்கும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவவியல் நெட்வொர்க் இணைப்புகளின் அளவு பகுப்பாய்வு மற்றும் ஒப்பீடு செய்யப்பட்டது. C. மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவ விகிதங்களின் அதிர்வெண். 0 க்கு நெருக்கமான மதிப்புகள் கோள வடிவங்களைக் குறிக்கின்றன, மேலும் 1 க்கு நெருக்கமான மதிப்புகள் இழை வடிவங்களைக் குறிக்கின்றன. D மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ (mtDNA) உள்ளடக்கம் பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தீர்மானிக்கப்பட்டது. E மைட்டோட்ராக்கர்™ ரெட் CMXRos பகுப்பாய்வு பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி (30,000 நிகழ்வுகள்) மூலம் செய்யப்பட்டது. தரவு சராசரி ± SD, n = 3 சுயாதீன சோதனைகளாக வழங்கப்படுகிறது. ஒரு வழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி பிந்தைய தற்காலிக சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
பின்னர் LX-2 செல்களில் உள்ள mtDNA உள்ளடக்கத்தை மைட்டோகாண்ட்ரியல் எண்ணின் குறிகாட்டியாக பகுப்பாய்வு செய்தோம். கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவில் mtDNA உள்ளடக்கம் அதிகரித்தது (படம் 4D). TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​சேர்க்கை சிகிச்சை குழுவில் mtDNA உள்ளடக்கம் குறைக்கப்பட்டது (படம் 4D), இது IPA mtDNA உள்ளடக்கத்தையும், ஒருவேளை மைட்டோகாண்ட்ரியல் எண்ணையும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தையும் குறைக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 3C). மேலும், சேர்க்கை சிகிச்சையில் mtDNA உள்ளடக்கத்தை IPA குறைப்பதாகத் தோன்றியது, ஆனால் MTR-மத்தியஸ்த மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைப் பாதிக்கவில்லை (படங்கள் 4A–C).
LX-2 செல்களில் ஃபைப்ரோஸிஸ், அப்போப்டோசிஸ், உயிர்வாழ்வு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் mRNA அளவுகளுடன் IPA இன் தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம் (படம் 5A–D). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழு, கொலாஜன் வகை I α2 சங்கிலி (COL1A2), α-மென்மையான தசை ஆக்டின் (αSMA), மேட்ரிக்ஸ் மெட்டாலோபுரோட்டினேஸ் 2 (MMP2), மெட்டாலோபுரோட்டினேஸ் 1 இன் திசு தடுப்பான் (TIMP1), மற்றும் டைனமின் 1-போன்ற மரபணு (DRP1) போன்ற மரபணுக்களின் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டியது, இது அதிகரித்த ஃபைப்ரோஸிஸ் மற்றும் செயல்படுத்தலைக் குறிக்கிறது. மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 சிகிச்சையானது நியூக்ளியர் பிரெக்னேன் X ஏற்பி (PXR), காஸ்பேஸ் 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-செல் α இன் தடுப்பான், நியூக்ளியர் காரணி κ மரபணு ஒளி பெப்டைடை (NFκB1A) மேம்படுத்தி மற்றும் நியூக்ளியர் காரணி κB கைனேஸ் துணை அலகு β (IKBKB) இன் தடுப்பான் (படம் 5A–D) ஆகியவற்றின் mRNA அளவைக் குறைத்தது. TGF-β1 சிகிச்சையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 மற்றும் IPA உடனான கூட்டு சிகிச்சை COL1A2 மற்றும் MMP2 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டைக் குறைத்தது, ஆனால் PXR, TIMP1, B-செல் லிம்போமா-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, மற்றும் IKBKB ஆகியவற்றின் mRNA அளவை அதிகரித்தது. IPA சிகிச்சையானது MMP2, Bcl-2-தொடர்புடைய புரதம் X (BAX), AKT1, ஆப்டிக் அட்ராபி புரதம் 1 (OPA1), மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு புரதம் 2 (MFN2) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டைக் கணிசமாகக் குறைத்தது, அதேசமயம் CASP8, NFκB1A, NFκB1B, மற்றும் IKBKB ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது அதிகரித்தது. இருப்பினும், காஸ்பேஸ்-3 (CASP3), அப்போப்டொடிக் பெப்டிடேஸ் செயல்படுத்தும் காரணி 1 (APAF1), மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு புரதம் 1 (MFN1) மற்றும் பிளவு புரதம் 1 (FIS1) ஆகியவற்றின் வெளிப்பாட்டில் எந்த வித்தியாசமும் காணப்படவில்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் IPA சிகிச்சையானது ஃபைப்ரோஸிஸ், அப்போப்டோசிஸ், உயிர்வாழ்வு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை மாற்றியமைக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. எங்கள் தரவுகளின்படி, IPA சிகிச்சையானது LX-2 செல்களில் ஃபைப்ரோஸிஸைக் குறைக்கிறது; அதே நேரத்தில், இது பினோடைப்பை செயலிழக்கச் செய்வதை நோக்கி மாற்றுவதன் மூலம் உயிர்வாழ்வைத் தூண்டுகிறது.
LX-2 செல்களில் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட், அப்போப்டோடிக், நம்பகத்தன்மை மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டைனமிக்ஸ் மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டை IPA மாற்றியமைக்கிறது. சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் TGF-β1 மற்றும் IPA உடன் LX-2 செல்கள் 24 மணிநேரத்திற்கு தூண்டப்பட்ட பிறகு, எண்டோஜெனஸ் கட்டுப்பாட்டுடன் (RPLP0 அல்லது PPIA) தொடர்புடைய mRNA வெளிப்பாட்டை ஹிஸ்டோகிராம்கள் காட்டுகின்றன. A ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களைக் குறிக்கிறது, B அப்போப்டோடிக் செல்களைக் குறிக்கிறது, C உயிர்வாழும் செல்களைக் குறிக்கிறது, மற்றும் D மைட்டோகாண்ட்ரியல் டைனமிக்ஸ் மரபணு வெளிப்பாட்டைக் குறிக்கிறது. தரவு சராசரி ± நிலையான விலகல் (SD), n = 3 சுயாதீன சோதனைகளாக வழங்கப்படுகிறது. ஒரு வழி ANOVA மற்றும் Bonferroni பிந்தைய தற்காலிக சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
பின்னர், செல் அளவு (FSC-H) மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை (SSC-H) ஆகியவற்றில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன (படம் 6A,B), மேலும் IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு செல் உருவ அமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி (TEM) மற்றும் கட்ட மாறுபாடு நுண்ணோக்கி (துணை படம் 6A-B) மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன. எதிர்பார்த்தபடி, TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவில் உள்ள செல்கள் கட்டுப்பாட்டு குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது அளவில் அதிகரித்தன (படம் 6A,B), இது கரடுமுரடான எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் (ER*) மற்றும் பாகோலிசோசோம்களின் (P) உன்னதமான விரிவாக்கத்தைக் காட்டுகிறது, இது ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலைக் குறிக்கிறது (துணை படம் 6A). இருப்பினும், TGF-β1-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​TGF-β1 மற்றும் IPA சேர்க்கை சிகிச்சை குழுவில் செல் அளவு, சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை (படம் 6A,B) மற்றும் ER* உள்ளடக்கம் குறைக்கப்பட்டன (துணை படம் 6A). மேலும், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது IPA சிகிச்சையானது செல் அளவு, சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை (படங்கள் 6A,B), P மற்றும் ER* உள்ளடக்கம் (துணை படம் 6A) ஆகியவற்றைக் குறைத்தது. கூடுதலாக, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது 24 மணிநேர IPA சிகிச்சையின் பின்னர் அப்போப்டோடிக் செல்களின் உள்ளடக்கம் அதிகரித்தது (வெள்ளை அம்புகள், துணை படம் 6B). ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் 1 mM IPA HSC அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டலாம் மற்றும் TGF-β1 ஆல் தூண்டப்பட்ட செல் உருவவியல் அளவுருக்களில் ஏற்படும் மாற்றங்களை மாற்றியமைக்கலாம், இதன் மூலம் HSC செயலிழப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம், இது செல் அளவு மற்றும் சிக்கலான தன்மையை ஒழுங்குபடுத்துகிறது.
LX-2 செல்களில் செல் அளவு மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மையை IPA மாற்றுகிறது. ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி பகுப்பாய்வின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள். பகுப்பாய்வு LX-2 செல்களுக்கு குறிப்பிட்ட கேட்டிங் உத்தியைப் பயன்படுத்தியது: செல் மக்கள்தொகையை வரையறுக்க SSC-A/FSC-A, இரட்டையர்களை அடையாளம் காண FSC-H/FSC-A, மற்றும் செல் அளவு மற்றும் சிக்கலான பகுப்பாய்விற்கு SSC-H/FSC-H. செல்கள் TGF-β1 (5 ng/ml) மற்றும் 1 mM IPA உடன் சீரம் இல்லாத ஊடகத்தில் 24 மணிநேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டன. செல் அளவு மற்றும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான பகுப்பாய்விற்காக LX-2 செல்கள் கீழ் இடது குவாட்ரன்ட் (SSC-H-/FSC-H-), மேல் இடது குவாட்ரன்ட் (SSC-H+/FSC-H-), கீழ் வலது குவாட்ரன்ட் (SSC-H-/FSC-H+) மற்றும் மேல் வலது குவாட்ரன்ட் (SSC-H+/FSC-H+) என விநியோகிக்கப்பட்டன. B. செல் உருவவியல் FSC-H (முன்னோக்கிய சிதறல், செல் அளவு) மற்றும் SSC-H (பக்க சிதறல், சைட்டோபிளாஸ்மிக் சிக்கலான தன்மை) (30,000 நிகழ்வுகள்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. தரவு சராசரி ± SD, n = 3 சுயாதீன சோதனைகளாக வழங்கப்படுகிறது. ஒரு வழி ANOVA மற்றும் போன்ஃபெரோனி பிந்தைய தற்காலிக சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர ஒப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 மற்றும் ****p < 0.0001
IPA போன்ற குடல் வளர்சிதை மாற்றங்கள் ஆராய்ச்சியின் ஒரு சூடான தலைப்பாக மாறியுள்ளன, இது குடல் நுண்ணுயிரிகளில் புதிய இலக்குகளைக் கண்டறியக்கூடும் என்று பரிந்துரைக்கிறது. எனவே மனிதர்களில் கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸுடன் நாம் இணைத்துள்ள ஒரு வளர்சிதை மாற்றமான IPA, விலங்கு மாதிரிகளில் [15] ஒரு சாத்தியமான ஃபைப்ரோடிக் எதிர்ப்பு கலவையாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது என்பது சுவாரஸ்யமானது [13, 14]. இங்கே, டைப் 2 நீரிழிவு நோய் (T2D) இல்லாத பருமனான நபர்களில் சீரம் IPA மற்றும் உலகளாவிய கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் DNA மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பை முதன்முறையாக நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம், இது அப்போப்டொசிஸ், மைட்டோபாகி மற்றும் நீண்ட ஆயுளை எடுத்துக்காட்டுகிறது, அத்துடன் கல்லீரல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை ஒழுங்குபடுத்தும் சாத்தியமான வேட்பாளர் மரபணு AKT1 ஐ எடுத்துக்காட்டுகிறது. எங்கள் ஆய்வின் மற்றொரு புதுமை என்னவென்றால், LX-2 செல்களில் அப்போப்டொசிஸ், செல் உருவவியல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஎனெர்ஜிடிக்ஸ் மற்றும் இயக்கவியல் ஆகியவற்றுடன் IPA சிகிச்சையின் தொடர்புகளை நாங்கள் நிரூபித்தோம், இது HSC பினோடைப்பை செயலிழக்கச் செய்யும் குறைந்த ஆற்றல் நிறமாலையைக் குறிக்கிறது, இது IPA ஐ கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸை மேம்படுத்துவதற்கான சாத்தியமான வேட்பாளராக மாற்றுகிறது.
இரத்தத்தில் உள்ள சீரம் IPA உடன் தொடர்புடைய கல்லீரல் மரபணுக்களில் செறிவூட்டப்பட்ட மிக முக்கியமான நியமன பாதைகள் அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோபேஜி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் தரக் கட்டுப்பாடு (MQC) அமைப்பின் சீர்குலைவு மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயலிழப்பு, மைட்டோபேஜி மற்றும் அப்போப்டோசிஸுக்கு வழிவகுக்கும், இதன் மூலம் MASLD ஏற்படுவதை ஊக்குவிக்கும் [33, 34]. எனவே, கல்லீரலில் அப்போப்டோசிஸ், மைட்டோபேஜி மற்றும் நீண்ட ஆயுள் மூலம் செல் இயக்கவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஒருமைப்பாட்டை பராமரிப்பதில் IPA ஈடுபடக்கூடும் என்று நாம் ஊகிக்க முடியும். YKT6 மற்றும் AKT1 ஆகிய மூன்று மதிப்பீடுகளிலும் இரண்டு மரபணுக்கள் பொதுவானவை என்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது. YKT6 என்பது செல் சவ்வு இணைவு செயல்பாட்டில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு SNARE புரதம் என்பது கவனிக்கத்தக்கது. இது ஆட்டோபேகோசோமில் STX17 மற்றும் SNAP29 உடன் ஒரு துவக்க வளாகத்தை உருவாக்குவதன் மூலம் ஆட்டோபேஜி மற்றும் மைட்டோபேஜியில் ஒரு பங்கை வகிக்கிறது, இதன் மூலம் ஆட்டோபேகோசோம்கள் மற்றும் லைசோசோம்களின் இணைவை ஊக்குவிக்கிறது [35]. மேலும், YKT6 செயல்பாட்டின் இழப்பு பலவீனமான மைட்டோபேஜிக்கு வழிவகுக்கிறது[36], அதே நேரத்தில் YKT6 இன் மேல்முறையீடு ஹெபடோசெல்லுலர் கார்சினோமாவின் (HCC) முன்னேற்றத்துடன் தொடர்புடையது, இது அதிகரித்த செல் உயிர்வாழ்வைக் காட்டுகிறது[37]. மறுபுறம், AKT1 மிக முக்கியமான ஊடாடும் மரபணுவாகும் மற்றும் PI3K/AKT சமிக்ஞை பாதை, செல் சுழற்சி, செல் இடம்பெயர்வு, பெருக்கம், குவிய ஒட்டுதல், மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு மற்றும் கொலாஜன் சுரப்பு[38–40] உள்ளிட்ட கல்லீரல் நோய்களில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது. செயல்படுத்தப்பட்ட PI3K/AKT சமிக்ஞை பாதை, புற-செல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் (ECM) உற்பத்திக்கு காரணமான செல்களான ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களை (HSCs) செயல்படுத்த முடியும், மேலும் அதன் ஒழுங்குமுறை கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸின் நிகழ்வு மற்றும் முன்னேற்றத்திற்கு பங்களிக்கக்கூடும்[40]. கூடுதலாக, AKT என்பது p53-சார்ந்த செல் அப்போப்டொசிஸைத் தடுக்கும் முக்கிய செல் உயிர்வாழும் காரணிகளில் ஒன்றாகும், மேலும் AKT செயல்படுத்தல் கல்லீரல் செல் அப்போப்டொசிஸின் தடுப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்[41, 42]. பெறப்பட்ட முடிவுகள், IPA, கல்லீரல் மைட்டோகாண்ட்ரியா-தொடர்புடைய அப்போப்டோசிஸில் ஈடுபடக்கூடும் என்றும், அப்போப்டோசிஸில் நுழைவதற்கும் அல்லது உயிர்வாழ்வதற்கும் இடையிலான ஹெபடோசைட்டுகளின் முடிவைப் பாதிப்பதாகவும் கூறுகின்றன. இந்த விளைவுகள் AKT மற்றும்/அல்லது YKT6 வேட்பாளர் மரபணுக்களால் கட்டுப்படுத்தப்படலாம், அவை கல்லீரல் ஹோமியோஸ்டாசிஸுக்கு முக்கியமானவை.
எங்கள் முடிவுகள், TGF-β1 சிகிச்சையிலிருந்து சுயாதீனமாக, LX-2 செல்களில் 1 mM IPA அப்போப்டோசிஸைத் தூண்டியது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தைக் குறைத்தது என்பதைக் காட்டியது. ஃபைப்ரோஸிஸ் தீர்வு மற்றும் ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுக்கான ஒரு முக்கிய பாதையாக அப்போப்டோசிஸ் உள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது, மேலும் கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸின் மீளக்கூடிய உடலியல் பதிலில் இது ஒரு முக்கிய நிகழ்வாகும் [4, 43]. மேலும், கூட்டு சிகிச்சையின் பின்னர் LX-2 செல்களில் BHI ஐ மீட்டெடுப்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஎனெர்ஜிக்ஸை ஒழுங்குபடுத்துவதில் IPA இன் சாத்தியமான பங்கைப் பற்றிய புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்கியது. ஓய்வு மற்றும் செயலற்ற நிலைமைகளின் கீழ், ஹெமாட்டோபாய்டிக் செல்கள் பொதுவாக ATP ஐ உருவாக்க மைட்டோகாண்ட்ரியல் ஆக்ஸிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேஷனைப் பயன்படுத்துகின்றன மற்றும் குறைந்த வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன. மறுபுறம், கிளைகோலைடிக் நிலைக்கு நுழைவதற்கான ஆற்றல் தேவைகளை ஈடுசெய்ய HSC செயல்படுத்தல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசம் மற்றும் உயிரியல் தொகுப்பை மேம்படுத்துகிறது [44]. IPA வளர்சிதை மாற்ற திறனையும் ECAR ஐயும் பாதிக்கவில்லை என்பது கிளைகோலைடிக் பாதை குறைவாக முன்னுரிமை அளிக்கப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. இதேபோல், மற்றொரு ஆய்வில், 1 mM IPA, கார்டியோமயோசைட்டுகள், மனித ஹெபடோசைட் செல் வரிசை (Huh7) மற்றும் மனித தொப்புள் நரம்பு எண்டோடெலியல் செல்கள் (HUVEC) ஆகியவற்றில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாச சங்கிலி செயல்பாட்டை மாற்றியமைக்க முடிந்தது என்பதைக் காட்டுகிறது; இருப்பினும், கார்டியோமயோசைட்டுகளில் கிளைகோலிசிஸில் IPA இன் எந்த விளைவும் காணப்படவில்லை, இது IPA மற்ற செல் வகைகளின் பயோஎனெர்ஜிக்ஸை பாதிக்கலாம் என்று கூறுகிறது [45]. எனவே, 1 mM IPA ஒரு லேசான வேதியியல் அன்கப்ளராக செயல்படக்கூடும் என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம், ஏனெனில் இது mtDNA அளவை மாற்றாமல் ஃபைப்ரோஜெனிக் மரபணு வெளிப்பாடு, செல் உருவவியல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பயோஎனெர்ஜிக்ஸை கணிசமாகக் குறைக்கும் [46]. மைட்டோகாண்ட்ரியல் அன்கப்ளர்கள் கலாச்சாரத்தால் தூண்டப்பட்ட ஃபைப்ரோஸிஸ் மற்றும் HSC செயல்படுத்தலைத் தடுக்கலாம் [47] மற்றும் அன்கப்ளிங் புரதங்கள் (UCP) அல்லது அடினைன் நியூக்ளியோடைடு டிரான்ஸ்லோகேஸ் (ANT) போன்ற சில புரதங்களால் கட்டுப்படுத்தப்படும் அல்லது தூண்டப்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ATP உற்பத்தியைக் குறைக்கலாம். செல் வகையைப் பொறுத்து, இந்த நிகழ்வு செல்களை அப்போப்டோசிஸிலிருந்து பாதுகாக்கலாம் மற்றும்/அல்லது அப்போப்டோசிஸை ஊக்குவிக்கலாம் [46]. இருப்பினும், ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் செயலிழப்புக்கு மைட்டோகாண்ட்ரியல் அன்கப்ளராக IPA இன் பங்கை தெளிவுபடுத்துவதற்கு மேலும் ஆய்வுகள் தேவை.
பின்னர் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சுவாசத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் உயிருள்ள LX-2 செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் உருவ அமைப்பில் பிரதிபலிக்கிறதா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். சுவாரஸ்யமாக, TGF-β1 சிகிச்சையானது கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை வடிவத்திற்கு மைட்டோகாண்ட்ரியல் விகிதத்தை மாற்றுகிறது, மைட்டோகாண்ட்ரியல் கிளைகள் குறைதல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவுக்கான முக்கிய காரணியான DRP1 இன் வெளிப்பாடு அதிகரிப்பு [48]. மேலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் துண்டு துண்டாக இருப்பது ஒட்டுமொத்த நெட்வொர்க் சிக்கலுடன் தொடர்புடையது, மேலும் இணைவிலிருந்து பிளவுக்கான மாற்றம் ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுக்கு மிகவும் முக்கியமானது, அதேசமயம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவு தடுப்பு HSC அப்போப்டோசிஸுக்கு வழிவகுக்கிறது [49]. எனவே, TGF-β1 சிகிச்சையானது கிளைகளைக் குறைப்பதன் மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் நெட்வொர்க் சிக்கலான தன்மையைக் குறைக்கக்கூடும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன, இது செயல்படுத்தப்பட்ட ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்கள் (HSCs) உடன் தொடர்புடைய மைட்டோகாண்ட்ரியல் பிளவுகளில் மிகவும் பொதுவானது. மேலும், IPA மைட்டோகாண்ட்ரியலின் விகிதத்தை கோள வடிவத்திலிருந்து இடைநிலை வடிவத்திற்கு மாற்றக்கூடும் என்றும், இதன் மூலம் OPA1 மற்றும் MFN2 இன் வெளிப்பாட்டைக் குறைக்கலாம் என்றும் எங்கள் தரவு காட்டுகிறது. OPA1 ஐக் குறைப்பது மைட்டோகாண்ட்ரியல் சவ்வு திறனைக் குறைத்து செல் அப்போப்டொசிஸைத் தூண்டும் என்றும் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன [50]. MFN2 மைட்டோகாண்ட்ரியல் இணைவு மற்றும் அப்போப்டோசிஸை மத்தியஸ்தம் செய்வதாக அறியப்படுகிறது[51]. பெறப்பட்ட முடிவுகள், TGF-β1 மற்றும்/அல்லது IPA ஆல் LX-2 செல்களைத் தூண்டுவது மைட்டோகாண்ட்ரியல் வடிவம் மற்றும் அளவையும், செயல்படுத்தும் நிலை மற்றும் நெட்வொர்க் சிக்கலையும் மாற்றியமைக்கிறது என்று கூறுகின்றன.
எங்கள் முடிவுகள், TGFβ-1 மற்றும் IPA ஆகியவற்றின் கூட்டு சிகிச்சையானது, அப்போப்டோசிஸ்-தவிர்க்கும் செல்களில் ஃபைப்ரோஸிஸ், அப்போப்டோசிஸ் மற்றும் உயிர்வாழ்வு தொடர்பான மரபணுக்களின் mRNA வெளிப்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் mtDNA மற்றும் செல் உருவவியல் அளவுருக்களைக் குறைக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. உண்மையில், IPA, AKT1 மற்றும் COL1A2 மற்றும் MMP2 போன்ற முக்கியமான ஃபைப்ரோஸிஸ் மரபணுக்களின் mRNA வெளிப்பாட்டு அளவைக் குறைத்தது, ஆனால் அப்போப்டோசிஸுடன் தொடர்புடைய CASP8 இன் வெளிப்பாடு அளவை அதிகரித்தது. IPA சிகிச்சைக்குப் பிறகு, BAX வெளிப்பாடு குறைந்து, TIMP1 குடும்ப துணைக்குழுக்களான BCL-2 மற்றும் NF-κB இன் mRNA வெளிப்பாடு அதிகரித்ததை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன, இது அப்போப்டோசிஸைத் தவிர்க்கும் ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களில் (HSCs) உயிர்வாழும் சமிக்ஞைகளை IPA தூண்டக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த மூலக்கூறுகள் செயல்படுத்தப்பட்ட ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களில் உயிர்வாழும் சார்பு சமிக்ஞைகளாக செயல்படக்கூடும், இது அப்போப்டோடிக் எதிர்ப்பு புரதங்களின் (Bcl-2 போன்றவை) அதிகரித்த வெளிப்பாடு, அப்போப்டோடிக் சார்பு BAX இன் வெளிப்பாடு குறைதல் மற்றும் TIMP மற்றும் NF-κB [5, 7] ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சிக்கலான இடைவினை ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். PXR மூலம் IPA அதன் விளைவுகளைச் செலுத்துகிறது, மேலும் TGF-β1 மற்றும் IPA உடனான கூட்டு சிகிச்சையானது PXR mRNA வெளிப்பாடு அளவை அதிகரிப்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது HSC செயல்படுத்தலை அடக்குவதைக் குறிக்கிறது. செயல்படுத்தப்பட்ட PXR சமிக்ஞை விவோ மற்றும் இன் விட்ரோ இரண்டிலும் HSC செயல்படுத்தலைத் தடுக்கும் என்று அறியப்படுகிறது [52, 53]. அப்போப்டொசிஸை ஊக்குவிப்பதன் மூலமும், ஃபைப்ரோஸிஸ் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்தைக் குறைப்பதன் மூலமும், உயிர்வாழும் சமிக்ஞைகளை மேம்படுத்துவதன் மூலமும் IPA செயல்படுத்தப்பட்ட HSC களின் அனுமதியில் பங்கேற்கக்கூடும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன, அவை செயல்படுத்தப்பட்ட HSC பினோடைப்பை செயலற்ற ஒன்றாக மாற்றும் பொதுவான செயல்முறைகளாகும். அப்போப்டொசிஸில் IPA இன் சாத்தியமான வழிமுறை மற்றும் பங்கிற்கான மற்றொரு சாத்தியமான விளக்கம் என்னவென்றால், இது செயல்படாத மைட்டோகாண்ட்ரியாவை முதன்மையாக மைட்டோபாகி (உள்ளார்ந்த பாதை) மற்றும் வெளிப்புற TNF சமிக்ஞை பாதை (அட்டவணை 1) மூலம் துடைக்கிறது, இது NF-κB உயிர்வாழும் சமிக்ஞை பாதையுடன் நேரடியாக இணைக்கப்பட்டுள்ளது (துணை படம் 7). சுவாரஸ்யமாக, IPA தொடர்பான செறிவூட்டப்பட்ட மரபணுக்கள் அப்போப்டொடிக் பாதையில் அப்போப்டொடிக் மற்றும் உயிர்வாழும் சார்பு சமிக்ஞைகளைத் தூண்ட முடியும் [54], IPA இந்த மரபணுக்களுடன் தொடர்புகொள்வதன் மூலம் அப்போப்டொடிக் பாதை அல்லது உயிர்வாழ்வைத் தூண்டக்கூடும் என்று கூறுகிறது. இருப்பினும், HSC செயல்படுத்தலின் போது IPA எவ்வாறு அப்போப்டொசிஸ் அல்லது உயிர்வாழ்வைத் தூண்டுகிறது மற்றும் அதன் இயக்கவியல் பாதைகள் தெளிவாக இல்லை.
IPA என்பது உணவு டிரிப்டோபனில் இருந்து குடல் நுண்ணுயிரி வழியாக உருவாகும் ஒரு நுண்ணுயிர் வளர்சிதை மாற்றமாகும். இது குடல் சூழலில் அழற்சி எதிர்ப்பு, ஆக்ஸிஜனேற்ற மற்றும் எபிஜெனெடிக் ஒழுங்குமுறை பண்புகளைக் கொண்டுள்ளது என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன.[55] IPA குடல் தடை செயல்பாட்டை மாற்றியமைக்கும் மற்றும் ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தைக் குறைக்கும் என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது அதன் உள்ளூர் உடலியல் விளைவுகளுக்கு பங்களிக்கக்கூடும்.[56] உண்மையில், IPA இரத்த ஓட்டம் வழியாக இலக்கு உறுப்புகளுக்கு கொண்டு செல்லப்படுகிறது, மேலும் IPA டிரிப்டோபன், செரோடோனின் மற்றும் இண்டோல் வழித்தோன்றல்களுடன் ஒத்த முக்கிய வளர்சிதை மாற்ற அமைப்பைப் பகிர்ந்து கொள்வதால், IPA போட்டி வளர்சிதை மாற்ற விதிகளுக்கு வழிவகுக்கும் வளர்சிதை மாற்ற நடவடிக்கைகளைச் செய்கிறது.[52] IPA நொதிகள் அல்லது ஏற்பிகளில் பிணைப்பு தளங்களுக்கு டிரிப்டோபன்-பெறப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களுடன் போட்டியிடலாம், இது சாதாரண வளர்சிதை மாற்ற பாதைகளை சீர்குலைக்கும். அதன் சிகிச்சை சாளரத்தை நன்கு புரிந்துகொள்ள அதன் மருந்தியக்கவியல் மற்றும் மருந்தியக்கவியல் பற்றிய மேலும் ஆய்வுகள் தேவை என்பதை இது எடுத்துக்காட்டுகிறது.[57] இது ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்களிலும் (HSCs) ஏற்படுமா என்பதைப் பார்க்க வேண்டும்.
எங்கள் ஆய்வில் சில வரம்புகள் இருப்பதை நாங்கள் ஒப்புக்கொள்கிறோம். IPA தொடர்பான தொடர்புகளை குறிப்பாக ஆராய, வகை 2 நீரிழிவு நோய் (T2DM) உள்ள நோயாளிகளை நாங்கள் விலக்கினோம். இது வகை 2 நீரிழிவு நோய் மற்றும் மேம்பட்ட கல்லீரல் நோயால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளுக்கு எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளின் பரந்த பொருந்தக்கூடிய தன்மையைக் கட்டுப்படுத்துகிறது என்பதை நாங்கள் ஒப்புக்கொள்கிறோம். மனித சீரத்தில் IPA இன் உடலியல் செறிவு 1–10 μM [11, 20] என்றாலும், 1 mM IPA செறிவு மிக உயர்ந்த நச்சுத்தன்மையற்ற செறிவு [15] மற்றும் நெக்ரோடிக் செல் மக்கள்தொகையின் சதவீதத்தில் எந்த வித்தியாசமும் இல்லாமல், அப்போப்டொசிஸின் மிக உயர்ந்த விகிதத்தின் அடிப்படையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. இந்த ஆய்வில் IPA இன் சூப்பர்பிசியாலஜிக்கல் அளவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், தற்போது IPA இன் பயனுள்ள டோஸ் குறித்து ஒருமித்த கருத்து இல்லை [52]. எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடத்தக்கவை என்றாலும், IPA இன் பரந்த வளர்சிதை மாற்ற விதி ஆராய்ச்சியின் செயலில் உள்ள பகுதியாகவே உள்ளது. மேலும், சீரம் IPA அளவுகள் மற்றும் கல்லீரல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் DNA மெத்திலேஷன் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு குறித்த எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் ஹீமாடோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல்கள் (HSCs) இலிருந்து மட்டுமல்ல, கல்லீரல் திசுக்களிலிருந்தும் பெறப்பட்டன. டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்விலிருந்து IPA ஹெமாட்டோபாய்டிக் ஸ்டெம் செல் (HSC) செயல்படுத்தலுடன் தொடர்புடையது [15], மேலும் HSCகள் கல்லீரல் ஃபைப்ரோஸிஸின் முன்னேற்றத்தில் ஈடுபடும் முக்கிய செல்கள் என்ற எங்கள் முந்தைய கண்டுபிடிப்புகளின் அடிப்படையில் மனித LX-2 செல்களைப் பயன்படுத்த நாங்கள் தேர்வுசெய்தோம். கல்லீரல் பல செல் வகைகளைக் கொண்டுள்ளது, எனவே காஸ்பேஸ் செயல்படுத்தல் மற்றும் டிஎன்ஏ துண்டு துண்டாக இணைக்கப்பட்ட ஹெபடோசைட்-HSC-நோயெதிர்ப்பு செல் இணை-வளர்ப்பு அமைப்பு மற்றும் புரத அளவு உள்ளிட்ட செயல்பாட்டின் வழிமுறை போன்ற பிற செல் மாதிரிகள் IPA இன் பங்கு மற்றும் பிற கல்லீரல் செல் வகைகளுடனான அதன் தொடர்புகளை ஆய்வு செய்ய கருத்தில் கொள்ள வேண்டும்.