சுரப்புப் பாதையில் புரத வரிசைப்படுத்துதல், செல் பிரிவுப்படுத்தல் மற்றும் ஹோமியோஸ்டாசிஸைப் பராமரிக்க அவசியம். ஷெல்-மத்தியஸ்த வரிசைப்படுத்தலுடன் கூடுதலாக, சுரப்புப் போக்குவரத்தின் செயல்பாட்டில் கினசின் வரிசைப்படுத்தலில் லிப்பிட்களின் பங்கு என்பது இன்னும் பதிலளிக்கப்படாத ஒரு நீண்டகால அடிப்படைக் கேள்வியாகும். இங்கு, மிக நீண்ட செராமைடு லிப்பிட் பகுதிகளைக் கொண்ட புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட கிளைகோசைல்பாஸ்பாடிடிலினோசிட்டால்-அசைவற்ற புரதங்கள் கொத்தாக அமைக்கப்பட்டு சிறப்பு எண்டோபிளாம்களாக வகைப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதை இன் விவோவில் நிரூபிக்க 3D ஒரே நேரத்தில் பல வண்ண உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிகழ்நேர இமேஜிங்கை நாங்கள் செய்கிறோம். நிகர வெளியேறும் தளம், இது டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதங்களால் பயன்படுத்தப்படுவதிலிருந்து வேறுபட்டது. கூடுதலாக, எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலம் மென்படலத்தில் உள்ள செராமைட்டின் சங்கிலி நீளம் இந்த வரிசைப்படுத்தல் தேர்ந்தெடுப்புக்கு முக்கியமானது என்பதைக் காட்டுகிறோம். லிப்பிட் சங்கிலி நீளத்தின் அடிப்படையில் புரத சரக்குகளை சுரப்புப் பாதையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஏற்றுமதி தளங்களாக வகைப்படுத்துவதற்கான முதல் நேரடி இன் விவோ ஆதாரத்தை எங்கள் ஆய்வு வழங்குகிறது.
யூகாரியோடிக் செல்களில், எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தில் (ER) தொகுக்கப்பட்ட புரதங்கள், அவற்றின் பொருத்தமான செல்லுலார் இலக்குக்கு வழங்குவதற்காக சுரப்பு பாதை வழியாக போக்குவரத்தின் போது வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன (1). பூச்சு-மத்தியஸ்த வரிசைப்படுத்தலுடன் கூடுதலாக, குறிப்பிட்ட புரதங்கள் (2-5) குறிப்பிட்ட சவ்வு களங்களில் அவற்றைக் கொத்தாக இணைப்பதன் மூலம் சில லிப்பிடுகள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியேறும் புள்ளிகளாகவும் செயல்பட முடியும் என்று நீண்ட காலமாக ஊகிக்கப்பட்டது. இருப்பினும், இந்த சாத்தியமான லிப்பிட் அடிப்படையிலான பொறிமுறையை நிரூபிக்க நேரடி இன் விவோ ஆதாரங்கள் இன்னும் இல்லை. இந்த அடிப்படை சிக்கலைத் தீர்க்க, கிளைகோசைல்பாஸ்பாடிடிலினோசிட்டால் (GPI) நங்கூரமிடப்பட்ட புரதங்கள் (GPI-APகள்) ER இலிருந்து எவ்வாறு வித்தியாசமாக ஏற்றுமதி செய்யப்படுகின்றன என்பதை ஈஸ்டில் ஆய்வு செய்தோம். GPI-APகள் பல்வேறு வகையான லிப்பிட்-இணைக்கப்பட்ட செல் மேற்பரப்பு புரதங்கள் (6, 7). GPI-AP என்பது கிளைகோலிபிட் பகுதி (GPI நங்கூரம்) மூலம் பிளாஸ்மா சவ்வின் வெளிப்புற துண்டுப்பிரசுரங்களுடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு சுரக்கும் புரதமாகும். அவை ER லுமனில் (8) பழமைவாத பிந்தைய மொழிபெயர்ப்பு மாற்றங்களாக GPI நங்கூரங்களை ஏற்றுக்கொள்கின்றன. இணைப்பிற்குப் பிறகு, GPI-AP, ER இலிருந்து பிளாஸ்மா சவ்வுக்கு கோல்கி கருவி (5, 9) வழியாக செல்கிறது. GPI நங்கூரங்களின் இருப்பு, GPI-AP ஐ டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரக்கும் புரதங்களிலிருந்து (பிற பிளாஸ்மா சவ்வு புரதங்கள் உட்பட) சுரப்பு பாதையில் தனித்தனியாக கொண்டு செல்ல காரணமாகிறது (5, 9, 10). ஈஸ்ட் செல்களில், GPI-APகள் எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தில் உள்ள மற்ற சுரக்கும் புரதங்களிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டு, பின்னர் கோட் புரத வளாகம் II (COPII) (6, 7) ஆல் மூடப்பட்ட தனித்துவமான வெசிகிள்களில் தொகுக்கப்படுகின்றன. ER ஏற்றுமதி செயல்பாட்டில் இந்த வகைப்பாடு செயல்முறையின் தீர்மானிப்பவர்கள் தெளிவாக இல்லை, ஆனால் இந்த பொறிமுறைக்கு லிப்பிடுகள் தேவைப்படலாம் என்று ஊகிக்கப்படுகிறது, குறிப்பாக GPI நங்கூரத்தின் லிப்பிட் பகுதியின் கட்டமைப்பு மறுவடிவமைப்பு (5, 8). ஈஸ்டில், GPI லிப்பிட் மறுவடிவமைப்பு GPI இணைக்கப்பட்ட உடனேயே தொடங்குகிறது, மேலும் பல சந்தர்ப்பங்களில், இது செராமைடை 26-கார்பன் நீண்ட-சங்கிலி நிறைவுற்ற கொழுப்பு அமிலத்துடன் (C26:0) பிணைக்க காரணமாகிறது (11, 12). C26 செராமைடு இதுவரை ஈஸ்ட் செல்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் முக்கிய செராமைடு ஆகும். இது ER இல் ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது, மேலும் அதன் பெரும்பகுதி COPII வெசிகிள்கள் மூலம் கோல்கி கருவிக்கு ஏற்றுமதி செய்யப்படுகிறது (13). GPI-AP இன் ER ஏற்றுமதிக்கு குறிப்பாக தொடர்ச்சியான செராமைடு தொகுப்பு தேவைப்படுகிறது (14, 15), இதையொட்டி, கோல்கி கருவியில் செராமைடை இனோசிட்டால் பாஸ்பேட் செராமைடு (IPC) ஆக மாற்றுவது GPI நங்கூரத் தொகுப்பைப் பொறுத்தது (16). செயற்கை சவ்வுகளுடன் கூடிய உயிர் இயற்பியல் ஆய்வுகள், மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைடுகள் தனித்துவமான இயற்பியல் பண்புகளுடன் வரிசைப்படுத்தப்பட்ட களங்களை உருவாக்க ஒன்றிணைக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன (17, 18). இந்தத் தரவுகள், C26 செராமைடு மற்றும் GPI-AP உடன் C26 செராமைடு ஆகியவை ஒப்பீட்டளவில் குழப்பமான ER சவ்வு லிப்பிட் சூழலில் ஒழுங்கான பகுதிகள் அல்லது பகுதிகளாக ஒன்றிணைக்க அவற்றின் இயற்பியல் பண்புகளைப் பயன்படுத்துகின்றன என்ற கருதுகோளுக்கு வழிவகுக்கிறது. இது முக்கியமாக குறுகிய மற்றும் நிறைவுறா கிளிசரோலிப்பிட்களால் ஆனது (C16:1 மற்றும் C18:1) (19, 20). இந்தப் பகுதிகள் குறிப்பிட்ட ER வெளியேறும் தளங்களில் (ERES) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட கவனம் செலுத்தப்படும், அங்கு செராமைடு மற்றும் செராமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP ஆகியவை ஒரே பிரத்யேக COPII வெசிகிளில் (5) கோல்கிக்கு இணைந்து கொண்டு செல்லப்படலாம்.
இந்த ஆய்வில், சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் கன்போகல் ரியல்-டைம் இமேஜிங் மைக்ரோஸ்கோபி (SCLIM) ஐப் பயன்படுத்தி இந்த லிப்பிட் அடிப்படையிலான பொறிமுறையை நேரடியாக சோதித்துள்ளோம், இது ஒரு அதிநவீன நுண்ணோக்கி நுட்பமாகும், இது ஒளிரும் லேபிளிடப்பட்ட புரதங்களை ஒரே நேரத்தில் கண்காணிக்க முடியும். முப்பரிமாண மற்றும் முப்பரிமாண (3D) படங்கள் உயிருள்ள செல்களில் மிக அதிக தெளிவுத்திறன் மற்றும் வேகத்தைக் கொண்டுள்ளன (21, 22).
S. cerevisiae இல் ER ஐ விட்டு வெளியேறிய பிறகு, டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரக்கும் புரதங்களிலிருந்து C26 செராமைடு குழுவுடன் கூடிய சாதாரண GPI-AP எவ்வாறு திரையிடப்பட்டது என்பதை மேலும் வரையறுக்க, முதலில் SCLIM தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தினோம். ER இன் வகைப்பாட்டைச் சரிபார்க்க, புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சரக்கு ERES இல் நுழைவதை நேரடியாகக் காட்சிப்படுத்தக்கூடிய ஒரு மரபணு அமைப்பைப் பயன்படுத்தினோம் (7, 23). சரக்காக, பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதம் (GFP) உடன் லேபிளிடப்பட்ட C26 செராமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP Gas1 மற்றும் அருகிலுள்ள அகச்சிவப்பு ஃப்ளோரசன்ட் புரதம் (iRFP) உடன் லேபிளிடப்பட்ட டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரக்கும் புரதம் Mid2 ஆகியவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்தோம், இவை இரண்டும் பிளாஸ்மா சவ்வை இலக்காகக் கொண்டுள்ளன (24–26). sec31-1 வெப்பநிலை-உணர்திறன் விகாரத்தில், இந்த இரண்டு சரக்குகளும் ஒரு கேலக்டோஸ்-தூண்டக்கூடிய ஊக்குவிப்பாளர் மற்றும் ஒரு அமைப்பு ERES மார்க்கரின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன. தீவிர வெப்பநிலையில் (37°C), sec31-1 பிறழ்வு COPII முளைப்பு மற்றும் ER ஏற்றுமதியைத் தடுக்க COPII பூச்சு கூறு Sec31 இன் செயல்பாட்டைப் பாதிப்பதால், புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சரக்கு ER இல் குவிகிறது (23). குறைந்த வெப்பநிலைக்கு (24°C) குளிர்ந்த பிறகு, sec31-1 விகாரி செல்கள் சுரக்கும் பகுதியிலிருந்து மீண்டு, திரட்டப்பட்ட புதிய செயற்கை சரக்கு ER இலிருந்து ஏற்றுமதி செய்யத் தொடங்கியது. CLIM காட்சிப்படுத்தல், புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP ஆகியவை 37°C இல் அடைகாத்த பிறகும் sec31-1 விகாரி செல்களின் ER இல் குவிந்து, பின்னர் 24°C இல் 5 நிமிடங்களுக்கு வெளியிடப்பட்டதைக் காட்டியது (படம் 1). Mid2-iRFP முழு ER சவ்விலும் விநியோகிக்கப்படுவதாலும், Gas1-GFP தொடர்ச்சியாக இல்லாத ER சவ்வில் குவிந்து சேகரிக்கப்படுவதாலும், அவற்றின் விநியோகம் முற்றிலும் வேறுபட்டது (படம் 1, A முதல் C மற்றும் மூவி S1). கூடுதலாக, படம் 1D இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, Gas1-GFP கிளஸ்டரில் Mid2-iRFP இல்லை. இந்த முடிவுகள் GPI-AP மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதங்கள் ஆரம்பத்தில் வெவ்வேறு ER சவ்வு பகுதிகளாக பிரிக்கப்பட்டதைக் குறிக்கின்றன. Gas1-GFP கிளஸ்டர், mCherry இன் COPII கோட் புரதம் Sec13 (படம் 1, E மற்றும் F, மற்றும் திரைப்படம் S1) (23) உடன் பெயரிடப்பட்ட ஒரு குறிப்பிட்ட ERES க்கு அருகில் உள்ளது.
sec31-1 செல்கள் கேலக்டோஸ் தூண்டப்பட்ட சுரப்புகளை வெளிப்படுத்துகின்றன, ஒரு நீண்ட அசைல் சங்கிலி (C26) செராமைடு GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதம் Mid2-iRFP (TMP, நீலம்) மற்றும் இந்த கட்டமைப்பு ERES லேபிளிங் Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) 37°C இல் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டு, 24°C க்கு நகர்த்தப்பட்டு, 5 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு SCLIM ஆல் படமாக்கப்பட்டது. (A முதல் C வரை) ஒரு விமானத்தின் பிரதிநிதி இணைக்கப்பட்ட அல்லது ஒற்றை 2D படத்தைக் காட்டுகிறது (A), 10 z-பிரிவுகளின் 2D ப்ரொஜெக்ஷன் படம் (B) அல்லது சரக்கு மற்றும் ERES குறிப்பான்களின் 3D செல் அரைக்கோளப் படம் (C). அளவுகோல் 1μm (A மற்றும் B). அளவுகோல் அலகு 0.551μm (C). Gas1-GFP தனித்தனி ER பகுதிகள் அல்லது கொத்துகளில் கண்டறியப்பட்டது, அதே நேரத்தில் Mid2-iRFP கண்டறியப்பட்டு ER சவ்வு (C) முழுவதும் விநியோகிக்கப்பட்டது. (D) வெள்ளை அம்புக் கோட்டில் (இடது) Gas1-GFP கிளஸ்டரில் Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP இன் ஒப்பீட்டு ஒளிரும் தீவிரத்தை வரைபடம் காட்டுகிறது. AU, தன்னிச்சையான அலகு. (E மற்றும் F) பொருட்கள் மற்றும் ERES குறியை இணைக்கும் 3D படத்தைக் குறிக்கிறது. குறிப்பிட்ட ERES அருகே Gas1-GFP கிளஸ்டர்கள் கண்டறியப்பட்டன. அளவுகோல் அலகு 0.551μm ஆகும். (F) வெள்ளை திட அம்புக்குறி ERES உடன் தொடர்புடைய Gas1-GFP கிளஸ்டரைக் குறிக்கிறது. நடுத்தர மற்றும் வலது பேனல்கள் இணைக்கப்பட்ட பெரிதாக்கப்பட்ட 3D படத்தையும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட Gas1-GFP கிளஸ்டரின் சுழற்றப்பட்ட காட்சியையும் காட்டுகின்றன.
Gas1-GFP கிளஸ்டருக்கும் ஒரு குறிப்பிட்ட ERES க்கும் இடையிலான நெருங்கிய இடஞ்சார்ந்த உறவு, Gas1-GFP தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES க்குள் நுழைய முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது, இது ER ஐ விட்டு வெளியேற Mid2-iRFP பயன்படுத்தும் தேர்ந்தெடுப்பிலிருந்து வேறுபட்டது. இந்த சாத்தியத்தை நிவர்த்தி செய்ய, ஒன்று அல்லது இரண்டு பொருட்களுக்கான ERES விகிதத்தை நாங்கள் அளவிட்டோம் (படம் 2, A முதல் C வரை). பெரும்பாலான ERES (70%) ஒரு வகை சரக்குகளை மட்டுமே கொண்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். படம் 2C இன் கீழ் படம் Gas1-GFP (படம் 1) மட்டுமே அல்லது Mid2-iRFP (படம் 2) மட்டுமே கொண்ட ERES இன் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளைக் காட்டுகிறது. இதற்கு நேர்மாறாக, தோராயமாக 20% ERES ஒரே பகுதியில் ஒன்றுடன் ஒன்று இரண்டு சரக்குகளைக் கொண்டுள்ளது. சில ERES (10%) இரண்டு வகையான சரக்குகளைக் கொண்டிருப்பது கண்டறியப்பட்டது, ஆனால் அவை தெளிவாக வெவ்வேறு பகுதிகளில் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. எனவே, இந்த புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு ER ஏற்றுமதி செய்யப்பட்ட பிறகு, GPI-AP Gas1-GFP மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சரக்கு Mid2-iRFP ஆகியவை வெவ்வேறு ERES ஆகப் பிரிக்கப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 2D). இந்த வரிசைப்படுத்தும் திறன் முந்தைய உயிர்வேதியியல் பகுப்பாய்வு (6) மற்றும் உருவவியல் தீர்மானம் (7) உடன் மிகவும் ஒத்துப்போகிறது. ERES (படம் 2E மற்றும் மூவி S2) இல் நுழையும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சரக்குகளின் நடத்தையையும் நாம் அவதானிக்கலாம். படம் 2E, Gas1-GFP (பேனல் 3) அல்லது Mid2-iRFP (பேனல் 4) இன் ஒரு சிறிய பகுதி மட்டுமே ERES இல் ஒரு பக்கத்திலிருந்து நுழைகிறது மற்றும் ஒரு தனித்துவமான பகுதியில் அடைக்கப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது. படம் 2E இன் பேனல் 5, Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP சில நேரங்களில் ஒரே ERES இல் காணப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது, ஆனால் அவை வெவ்வேறு பக்கங்களிலிருந்து நுழைகின்றன மற்றும் வெவ்வேறு COPII வெசிகிள்களைக் குறிக்கும் தனித்தனி பகுதிகளில் குவிந்துள்ளன. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES ஆக C26 செராமைடு அடிப்படையிலான GPI-AP Gas1 இன் கவனிக்கப்பட்ட பிரிப்பு மற்றும் வகைப்பாடு குறிப்பிட்டது என்பதையும் நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், ஏனெனில் மற்றொரு டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரப்பு சரக்கு, GFP-டேக் செய்யப்பட்ட பிளாஸ்மா சவ்வு புரதம் Axl2 (27), Mid2-iRFP ஐ ஒத்த நடத்தையைக் காட்டுகிறது. (படம் S1 மற்றும் மூவி S3). புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட Axl2-GFP, Mid2-iRFP (படம் S1, A மற்றும் B) போன்ற ER சவ்வு வழியாக விநியோகிக்கப்படுகிறது, மேலும் பெரும்பாலான ERES இல் Mid2-iRFP உடன் இணைந்து உள்ளூர்மயமாக்கப்படுகிறது (படம் S1, B முதல் D வரை). படம் 1 இன் பேனல்கள் 1 மற்றும் 2. இரண்டு டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சரக்குகள் ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும் ERES இன் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளை S1C காட்டுகிறது. இந்த சந்தர்ப்பங்களில், இரண்டு பொருட்களும் ஒன்றாக ERES இல் நுழைகின்றன (படம் S1E, பேனல் 3 மற்றும் மூவி S3).
கேலக்டோஸ் தூண்டக்கூடிய சுரப்புகளை வெளிப்படுத்தும் sec31-1 செல்கள், Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (TMP, நீலம்) மற்றும் Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) என லேபிளிடும் அமைப்பு ERES 37 இல் வைக்கப்பட்டன. °C இல் 30 நிமிடங்கள் அடைகாத்த பிறகு, சுரப்புத் தொகுதியை வெளியிட 24 °C க்கு நகர்த்தவும், 20 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு SCLIM உடன் படம் எடுக்கவும். (A முதல் C வரை) சரக்கு மற்றும் ERES ஆல் குறிக்கப்பட்ட 10 z-பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ 2D ப்ரொஜெக்ஷன் படங்கள் (A; அளவுகோல் பட்டை, 1μm) அல்லது 3D செல் அரைக்கோள படங்கள் (B மற்றும் C; அளவுகோல் அலகு, 0.456μm). (B) இல் உள்ள கீழ் பேனலும் (C) இல் உள்ள பேனலும் ERES (மெஜந்தா) இல் உள்ள பொருட்களை மட்டுமே காண்பிக்க பதப்படுத்தப்பட்ட படங்களைக் காண்பிக்கின்றன [Gas1-GFP (சாம்பல்) மற்றும் Mid2-iRFP (வெளிர் நீலம்)]. (C) திறந்த அம்பு: ERES ஒரு சரக்கு மட்டுமே கொண்டு செல்கிறது (1 முதல் 4 வரை). சாம்பல் அம்பு: ERES பிரிக்கப்பட்ட சரக்குகளைக் கொண்டுள்ளது (5). வெள்ளை திட அம்பு: இணைந்து அமைந்துள்ள சரக்குகளைக் கொண்ட ERES. கீழே: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒற்றை ERES Gas1-GFP (1) அல்லது Mid2-iRFP (2) மட்டுமே கொண்டுள்ளது. அளவுகோல் பட்டை, 100 nm. (D) (C) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஒளி நுண்ணோக்கி வரைபடத்தின் அளவு. ஒரே ஒரு சரக்கு (Gas1-GFP அல்லது Mid2-iRFP), பிரிக்கப்பட்ட சரக்கு மற்றும் ஒன்றுடன் ஒன்று சரக்குகளைக் கொண்ட ERES இன் சராசரி சதவீதம். மூன்று சுயாதீன சோதனைகளில், 54 கலங்களில் n=432. பிழைப் பட்டை = SD. இரண்டு வால் இணைக்கப்படாத t சோதனை. *** P = 0.0002. (E) (C) எனக் குறிக்கப்பட்ட தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சரக்குகளின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES இன் 3D படம். Gas1-GFP (பச்சை) (3) அல்லது Mid2-iRFP (நீலம்) (4) ஒரு பக்கத்திலிருந்து ERES (மெஜந்தா) க்குள் நுழைகிறது மற்றும் ERES க்குள் ஒரு சிறிய பகுதிக்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது. சில நேரங்களில், இரண்டு வகையான சரக்குகளும் ஒரே பக்கத்திலிருந்து ஒரே ERES (5) க்குள் நுழைந்து ERES க்குள் ஒரு தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பகுதிக்குள் அடைக்கப்படுகின்றன. அளவுகோல் பட்டை, 100 nm.
அடுத்து, ER சவ்வில் இருக்கும் நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைடு (C26) குறிப்பிட்ட கிளஸ்டரிங் மற்றும் Gas1 வரிசையாக்கத்தை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES ஆக இயக்குகிறது என்ற கருதுகோளை நாங்கள் சோதித்தோம். இதற்காக, நாங்கள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈஸ்ட் ஸ்ட்ரெய்ன் GhLag1 ஐப் பயன்படுத்தினோம், இதில் இரண்டு எண்டோஜெனஸ் செராமைடு சின்தேஸ்கள் Lag1 மற்றும் Lac1 ஆகியவை GhLag1 (பருத்தியின் Lag1 ஹோமோலாக்) ஆல் மாற்றப்பட்டன, இதன் விளைவாக காட்டு வகையை விடக் குறைவான செல் சவ்வு செராமைடு திரிபு கொண்ட ஈஸ்ட் திரிபு ஏற்பட்டது (படம் 3A) (28). மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS) பகுப்பாய்வு காட்டு வகை விகாரங்களில், மொத்த செராமைடில் 95% மிக நீளமானது (C26) சங்கிலி செராமைடு என்றும், GhLag1 இல், செராமைட்டின் 85% மிக நீளமானது (C18 மற்றும் C16) என்றும் காட்டியது. ), செராமைடில் 2% மட்டுமே மிக நீளமானது (C26) சங்கிலி செராமைடு என்றும் காட்டியது. GhLag1 சவ்வில் இதுவரை கண்டறியப்பட்ட முக்கிய செராமைடுகள் C18 மற்றும் C16 செராமைடுகள் என்றாலும், GhLag1 திரிபில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட Gas1-GFP இன் GPI ஆங்கரில் C26 செராமைடு உள்ளது என்பதையும் MS பகுப்பாய்வு உறுதிப்படுத்தியது, இது காட்டு-வகை லிப்பிடுகளுடன் ஒப்பிடத்தக்கது. தரம் ஒன்றே (படம் 3A) (26). எனவே, இதன் பொருள் செராமைடு மறுவடிவமைப்பு நொதி Cwh43 C26 செராமைடுக்கு மிகவும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டதாகும், படம் 26 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, இது GhLag1 திரிபில் உள்ள ஒரு சிறிய அளவு C26 செராமைடிலிருந்து GPI ஆங்கரை முன்னுரிமையாக இணைக்கிறது. S2 (29). இருப்பினும், GhLag1 இன் செல் சவ்வு அடிப்படையில் C18-C16 செராமைடை மட்டுமே கொண்டுள்ளது, அதே நேரத்தில் Gas1-GFP இன்னும் C26 செராமைடைக் கொண்டுள்ளது. இந்த உண்மை இந்த திரிபு ER இல் சவ்வு செராமைட்டின் அசைல் சங்கிலி நீளத்தின் சிக்கலை குறிப்பாக தீர்க்க ஒரு சிறந்த கருவியாக அமைகிறது. வகுப்பு மற்றும் வரிசைப்படுத்தலின் அனுமான பங்கு. பின்னர், வழக்கமான ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மூலம், வெப்பநிலை உணர்திறன் கொண்ட விகாரமான அல்லீலுடன் கூடிய GhLag1 இல் C26 Gas1-GFP இன் கொத்துகளில் குவியும் திறனை முதலில் ஆய்வு செய்தோம், அங்கு நீண்ட (C18-C16) சங்கிலி மட்டுமே ER சவ்வு Ceramide இல் உள்ளது (படம் 3). sec31-1 இல், பெரும்பாலான Gas1-GFP கொத்துகளில் குவிந்திருப்பதை நாங்கள் கவனித்தோம், அதே நேரத்தில் sec31-1 இல் Gas1-GFP நீண்ட (C18-C16) நீண்ட செராமைடு ER சவ்வு கொண்ட GhLag1 முக்கியமாக கொத்தாக மற்றும் முழு ER சவ்வுகளிலும் விநியோகிக்கப்படவில்லை. துல்லியமாகச் சொல்வதானால், C26 செராமைடு அடிப்படையிலான கிளஸ்டரிங் குறிப்பிட்ட ERES உடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது என்பதால் (படம் 1), இந்த செயல்முறை ER ஏற்றுமதி புரத பொறிமுறையின் செயல்பாட்டையும் உள்ளடக்கியதா என்பதை நாங்கள் அடுத்து ஆராய்ந்தோம். GPI-AP ER ஏற்றுமதிக்கு ஒரு சிறப்பு COPII அமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது, இது GPI ஆங்கரின் கிளைக்கான் பகுதியின் Ted1 இன் கட்டமைப்பு மறுவடிவமைப்பால் தீவிரமாக கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது (30, 31). மறுசீரமைப்பு GPI-கிளைக்கான் பின்னர் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சரக்கு ஏற்பி p24 வளாகத்தால் அங்கீகரிக்கப்படுகிறது, இது Lst1 ஐத் தேர்ந்தெடுத்து சேர்க்கிறது, இது முக்கிய COPII சரக்கு பிணைப்பு துணை அலகான Sec24 இன் ஒரு குறிப்பிட்ட ஐசோஃபார்ம் ஆகும், இது GPI-AP நிறைந்த COPII வெசிகிள்களை உருவாக்குகிறது (31-33). எனவே, இந்த ஒற்றை புரதங்களின் நீக்கத்தை (p24 சிக்கலான கூறு Emp24, GPI-கிளைக்கான் மறுவடிவமைப்பு நொதி Ted1 மற்றும் குறிப்பிட்ட COPII துணை அலகு Lst1) sec31-1 பிறழ்வு விகாரத்துடன் இணைத்து, அவற்றை ஆய்வு செய்தோம். Gas1-cluster GFP ஐ உருவாக்குவது சாத்தியமா (படம் 3). sec31-1emp24Δ மற்றும் sec31-1ted1Δ இல், Gas1-GFP முக்கியமாக கொத்தாக பிரிக்கப்பட்டு ER சவ்வு முழுவதும் விநியோகிக்கப்படுவதை நாங்கள் கவனித்தோம், முன்பு sec31-1 GhLag1 இல் காணப்பட்டது போல, sec31-1lst1Δ இல், Gas1-GFP sec31-1 ஐப் போல. இந்த முடிவுகள், ER சவ்வில் C26 செராமைடு இருப்பதைத் தவிர, Gas1-GFP இன் கிளஸ்டரிங்கும் p24 காம்ப்ளக்ஸுடன் பிணைக்கப்பட வேண்டும், மேலும் குறிப்பிட்ட Lst1 ஆட்சேர்ப்பு தேவையில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. பின்னர், ER சவ்வில் உள்ள செராமைட்டின் சங்கிலி நீளம் Gas1-GFP ஐ p24 உடன் பிணைப்பதை ஒழுங்குபடுத்தும் சாத்தியத்தை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். இருப்பினும், சவ்வில் C18-C16 செராமைடு இருப்பது p24 காம்ப்ளக்ஸால் (படங்கள் S3 மற்றும் S4, A மற்றும் B) புனரமைக்கப்பட்ட GPI-கிளைக்கான்களையோ அல்லது GPI-AP உடன் பிணைத்து GPI-AP ஐ ஏற்றுமதி செய்வதையோ பாதிக்காது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். COPII துணை வகை Lst1 ஐ நியமிக்கவும் (படம் S4C). எனவே, C26 செராமைடு சார்ந்த கிளஸ்டரிங்கிற்கு வெவ்வேறு ER ஏற்றுமதி புரத வழிமுறைகளுடன் புரத தொடர்புகள் தேவையில்லை, ஆனால் லிப்பிட் நீளத்தால் இயக்கப்படும் மாற்று வரிசைப்படுத்தும் பொறிமுறையை ஆதரிக்கிறது. பின்னர், ER சவ்வில் உள்ள செராமைடு அசைல் சங்கிலி நீளம் Gas1-GFP ஐ தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES ஆக திறம்பட வகைப்படுத்துவதற்கு முக்கியமா என்பதை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். குறுகிய சங்கிலி செராமைடு கொண்ட GhLag1 திரிபில் உள்ள Gas1, ER ஐ விட்டு வெளியேறி பிளாஸ்மா சவ்வில் நுழைவதால் (படம் S5), செராமைடு அசைல் சங்கிலியின் நீளத்தால் வரிசைப்படுத்தல் இயக்கப்பட்டால், GhLag1 திரிபில் உள்ள Gas1 ஐ திருப்பி அனுப்பலாம் மற்றும் கடக்கலாம் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். அதே சவ்வு கொண்ட ERES பொருட்கள்.
(A) GhLag1 இன் செல் சவ்வு முக்கியமாக குறுகிய C18-C16 செராமைடுகளைக் கொண்டுள்ளது, அதே நேரத்தில் Gas1-GFP இன் GPI ஆங்கர் இன்னும் காட்டு-வகை செல்களைப் போலவே அதே C26 IPC ஐக் கொண்டுள்ளது. மேலே: காட்டு-வகை (Wt) மற்றும் GhLag1p விகாரங்களின் செல் சவ்வில் உள்ள செராமைட்டின் அசைல் சங்கிலி நீள பகுப்பாய்வு மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS) மூலம். தரவு மொத்த செராமைட்டின் சதவீதத்தைக் குறிக்கிறது. மூன்று சுயாதீன சோதனைகளின் சராசரி. பிழைப் பட்டை = SD. இரண்டு-வால் இணைக்கப்படாத t சோதனை. **** P ＜0.0001. கீழ் குழு: காட்டு-வகை மற்றும் GhLag1p விகாரங்களில் வெளிப்படுத்தப்படும் Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ஆங்கரில் இருக்கும் IPC இன் அசைல் சங்கிலி நீளத்தின் MS பகுப்பாய்வு. தரவு மொத்த IPC சமிக்ஞையின் சதவீதத்தைக் குறிக்கிறது. ஐந்து சுயாதீன சோதனைகளின் சராசரி. பிழைப் பட்டை = SD. இரண்டு-வால் இணைக்கப்படாத t சோதனை. ns, முக்கியமில்லை. P = 0.9134. (B) கேலக்டோஸ் தூண்டப்பட்ட Gas1-GFP ஐ வெளிப்படுத்தும் sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ மற்றும் sec31-1lst1Δ செல்களின் ஃப்ளோரசன்ஸ் மைக்ரோகிராஃப்கள் 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டு, 24°C க்குப் பிறகு வழக்கமான ஃப்ளோரசன்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபியைச் செய்ய அனுப்பப்பட்டன. வெள்ளை அம்பு: ER Gas1-GFP கொத்து. திறந்த அம்பு: கொத்தாக இல்லாத Gas1-GFP முழு ER சவ்விலும் விநியோகிக்கப்படுகிறது, இது ER சிறப்பியல்பு அணு வளையக் கறையைக் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை, 5μm. (C) (B) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஃபோட்டோமைக்ரோகிராஃபின் அளவு. புள்ளியிடப்பட்ட Gas1-GFP அமைப்பு கொண்ட செல்களின் சராசரி சதவீதம். மூன்று சுயாதீன சோதனைகளில், n≥300 செல்கள். பிழைப் பட்டை = SD. இரண்டு-வால் இணைக்கப்படாத t சோதனை. **** P ＜0.0001.
இந்தச் சிக்கலை நேரடியாகத் தீர்க்க, GhLag1 இல் Gas1-GFP மற்றும் Mid2-iRFP இன் SCLIM காட்சிப்படுத்தலை sec31-1 வெப்பநிலை உணர்திறன் கொண்ட அல்லீலைப் பயன்படுத்தி (படம் 4 மற்றும் மூவி S4) செய்தோம். ER 37°C இல் தக்கவைக்கப்பட்டு பின்னர் 24°C இல் வெளியிடப்பட்ட பிறகு, புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட Gas1-GFP இன் பெரும்பாலானவை ER சவ்வு முழுவதும் கொத்தாகப் பிரிக்கப்படவில்லை மற்றும் விநியோகிக்கப்படவில்லை, இது வழக்கமான நுண்ணோக்கிகளால் கவனிக்கப்பட்டது (படம் 4, A மற்றும் B). கூடுதலாக, ERES இன் ஒரு பெரிய சதவீதம் (67%) இரண்டு வகையான சரக்குகளை அதில் இணைத்து அமைந்துள்ளது (படம் 4D). படம் 4C இன் பேனல்கள் 1 மற்றும் 2, Gas1-GFP மற்றும் Mid2-GFP ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த ERES இன் இரண்டு பொதுவான எடுத்துக்காட்டுகளைக் காட்டுகின்றன. கூடுதலாக, இரண்டு பொருட்களும் ஒரே ERES இல் சேர்க்கப்பட்டன (படம் 4E, பேனல் 3 மற்றும் மூவி S4). எனவே, ER சவ்வில் உள்ள செராமைடு அசைல் சங்கிலியின் நீளம் ER புரத திரட்டல் மற்றும் வகைப்பாட்டின் ஒரு முக்கிய தீர்மானிப்பதாகும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன.
Sec31-1 GhLag1 செல்கள், கேலக்டோஸ் தூண்டப்பட்ட சுரப்புகள், Gas1-GFP (GPI-AP, பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (TMP, நீலம்) மற்றும் கான்ஸ்டிடியூட்டிவ் ERES-லேபிளிடப்பட்ட Sec13-mCherry (ERES, மெஜந்தா) ஆகியவற்றை வெளிப்படுத்துகின்றன. 37°C இல் அடைகாக்கவும். 30 நிமிடங்கள் தொடரவும், சுரப்புகளை வெளியிட 24°C க்குக் குறைத்து, 20 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு SCLIM உடன் படத்தை வைக்கவும். (A முதல் C வரை) சரக்கு மற்றும் ERES ஆல் குறிக்கப்பட்ட 10 z-பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ 2D ப்ரொஜெக்ஷன் படங்கள் (A; அளவுகோல் பட்டை, 1μm) அல்லது 3D செல் அரைக்கோள படங்கள் (B மற்றும் C; அளவுகோல் அலகு, 0.45μm). (B) இல் உள்ள கீழ் பேனலும் (C) இல் உள்ள பேனலும் ERES (மெஜந்தா) இல் உள்ள பொருட்களை மட்டுமே காண்பிக்க பதப்படுத்தப்பட்ட படங்களைக் காண்பிக்கின்றன [Gas1-GFP (சாம்பல்) மற்றும் Mid2-iRFP (வெளிர் நீலம்)]. (C) வெள்ளை நிறத்தில் நிரப்பப்பட்ட அம்பு: ERES, பொருட்கள் ஒன்றுடன் ஒன்று. திறந்த அம்பு: ERES இல் ஒரே ஒரு உருப்படி மட்டுமே உள்ளது. கீழ்ப் பலகம்: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES இல் (C) இல் குறிக்கப்பட்ட ஒன்றுடன் ஒன்று பொருட்கள் (1 மற்றும் 2) உள்ளன. அளவுகோல் பட்டை, 100 nm. (D) (C) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஒளி நுண்ணோக்கி வரைபடத்தின் அளவு. sec31-1 மற்றும் sec31-1 GhLag1 அலகுகளில், ஒரு சரக்கு (Gas1-GFP அல்லது Mid2-iRFP) மட்டுமே சேர்க்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சரக்கு மற்றும் ஒன்றுடன் ஒன்று சரக்குகளுக்கான ERES இன் சராசரி சதவீதம். மூன்று சுயாதீன சோதனைகளில், n = 54 கலங்களில் 432 (sec31-1) மற்றும் n = 47 கலங்களில் 430 (sec31-1 GhLag1). பிழைப் பட்டை = SD. இரண்டு வால் இணைக்கப்படாத t சோதனை. *** P = 0.0002 (sec31-1) மற்றும் ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ERES இன் 3D படம் (C) இல் குறிக்கப்பட்ட ஒன்றுடன் ஒன்று சரக்கு (3) உடன். Gas1-GFP (பச்சை) மற்றும் Mid2-iRFP (நீலம்) ஆகியவை ஒரே பக்கத்திலிருந்து ERES (மெஜந்தா) ஐ அணுகி அதே ERES தடைசெய்யப்பட்ட பகுதியில் இருக்கும். அளவுகோல் பட்டை, 100 nm.
இந்த ஆய்வு, லிப்பிட் அடிப்படையிலான புரத சரக்குகள் சுரக்கும் பாதையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஏற்றுமதி தளங்களாக வகைப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதற்கான நேரடி இன் விவோ ஆதாரங்களை வழங்குகிறது, மேலும் வகைப்பாடு தேர்ந்தெடுப்புக்கு அசைல் சங்கிலி நீளத்தின் முக்கியத்துவத்தை வெளிப்படுத்துகிறது. SCLIM எனப்படும் சக்திவாய்ந்த மற்றும் அதிநவீன நுண்ணோக்கி நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, ஈஸ்டில் புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட Gas1-GFP (மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி (C26) செராமைடு லிப்பிட் பகுதியுடன் கூடிய ஒரு பெரிய பிளாஸ்மா சவ்வு GPI-AP) ஐ நாங்கள் நிரூபித்தோம். தனித்தனி ER களில் தொகுக்கப்பட்ட பகுதிகள் குறிப்பிட்ட ERES உடன் தொடர்புடையவை, அதே நேரத்தில் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் சுரக்கும் புரதங்கள் ER சவ்வு முழுவதும் விநியோகிக்கப்படுகின்றன (படம் 1). கூடுதலாக, இந்த இரண்டு வகையான பொருட்களும் வெவ்வேறு ERES இல் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் நுழைகின்றன (படம் 2). சவ்வில் உள்ள செல்லுலார் செராமைட்டின் அசைல் சங்கிலி நீளம் C26 இலிருந்து C18-C16 ஆகக் குறைக்கப்படுகிறது, Gas1-GFP கிளஸ்டர் தனித்த ER பகுதிக்குள் சீர்குலைக்கப்படுகிறது, மேலும் Gas1-GFP அதே ERES வழியாக டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதத்துடன் ER ஐ விட்டு வெளியேற திருப்பி விடப்படுகிறது (படம் 3 மற்றும் படம் 3). 4).
ER இலிருந்து வெளியேற GPI-AP ஒரு சிறப்பு புரத பொறிமுறையைப் பயன்படுத்தினாலும், C26 செராமைடு சார்ந்த பிரிப்பு ERES சிறப்புக்கு வழிவகுக்கும் வேறுபட்ட புரத தொடர்புகளை நம்பியிருக்கவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படங்கள் S4 மற்றும் S5). அதற்கு பதிலாக, எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் லிப்பிட் அடிப்படையிலான புரதக் கொத்து மற்றும் பிற சரக்குகளைத் தொடர்ந்து விலக்குவதன் மூலம் இயக்கப்படும் மாற்று வகைப்பாடு பொறிமுறையை ஆதரிக்கின்றன. ஒரு குறிப்பிட்ட ERES உடன் தொடர்புடைய Gas1-GFP பகுதி அல்லது கொத்து டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் சுரக்கும் புரதம் Mid2-iRFP ஐக் கொண்டிருக்கவில்லை என்பதை எங்கள் அவதானிப்புகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன, இது C26 செராமைடு சார்ந்த GPI-AP கொத்து தொடர்புடைய ERES இல் நுழைவதை எளிதாக்கும், அதே நேரத்தில், டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் விலக்கப்படும் சுரப்புகள் இந்த குறிப்பிட்ட ERES இல் நுழைகின்றன (படங்கள் 1 மற்றும் 2). இதற்கு நேர்மாறாக, ER சவ்வில் C18-C16 செராமைடுகள் இருப்பது GPI-AP பகுதிகள் அல்லது கொத்துக்களை உருவாக்குவதற்கு காரணமாகாது, எனவே அவை டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் சுரக்கும் புரதங்களை அதே ERES இல் விலக்கவோ அல்லது மாற்றவோ இல்லை (படங்கள் 3 மற்றும் 4). . எனவே, குறிப்பிட்ட ERES உடன் இணைக்கப்பட்ட புரதங்களின் தொகுப்பை எளிதாக்குவதன் மூலம் C26 செராமைடு பிரித்தல் மற்றும் வகைப்படுத்தலை இயக்குகிறது என்று நாங்கள் முன்மொழிகிறோம்.
ஒரு குறிப்பிட்ட ER பகுதியில் இந்த C26 செராமைடு சார்ந்த கிளஸ்டரிங்கை எவ்வாறு அடைவது? சவ்வு செராமைடு பக்கவாட்டில் பிரிக்கும் போக்கு, GPI-AP மற்றும் C26 செராமைடு ஆகியவை குறுகிய மற்றும் நிறைவுறாத கிளிசரோலிப்பிட்களைக் கொண்ட ER சவ்வின் மிகவும் ஒழுங்கற்ற லிப்பிட் சூழலில் சிறிய மற்றும் உடனடியாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட லிப்பிட்களை உருவாக்க காரணமாக இருக்கலாம். தரமான கிளஸ்டர்கள் (17, 18). இந்த சிறிய தற்காலிக கிளஸ்டர்களை p24 காம்ப்ளக்ஸ் (34) உடன் பிணைத்த பிறகு பெரிய, மிகவும் நிலையான கிளஸ்டர்களாக மேலும் இணைக்க முடியும். இதற்கு இணங்க, பெரிய புலப்படும் கிளஸ்டர்களை உருவாக்க C26 Gas1-GFP p24 காம்ப்ளக்ஸுடன் தொடர்பு கொள்ள வேண்டும் என்பதைக் காட்டினோம் (படம் 3). p24 காம்ப்ளக்ஸ் என்பது ஈஸ்டில் நான்கு வெவ்வேறு p24 டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதங்களால் ஆன ஒரு ஹீட்டோரோசைகஸ் ஆலிகோமர் ஆகும் (35), இது மல்டிவேலண்ட் பிணைப்பை வழங்குகிறது, இது சிறிய GPI-AP கிளஸ்டர்களின் குறுக்கு-இணைப்புக்கு வழிவகுக்கும், இதன் மூலம் பெரிய நிலையான கிளஸ்டரை உருவாக்குகிறது (34). பாலூட்டிகளின் துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களில் கோல்கி போக்குவரத்தின் போது காட்டப்பட்டுள்ளபடி, GPI-APகளின் புரத எக்டோடோமைன்களுக்கு இடையிலான தொடர்பு அவற்றின் திரட்டலுக்கு பங்களிக்கக்கூடும் (36). இருப்பினும், ER சவ்வில் C18-C16 செராமைடு இருக்கும்போது, ​​p24 வளாகம் Gas1-GFP உடன் பிணைக்கப்படும்போது, ​​பெரிய தனித்தனி கொத்துகள் உருவாகாது. அடிப்படை வழிமுறை நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைட்டின் குறிப்பிட்ட இயற்பியல் மற்றும் வேதியியல் பண்புகளைப் பொறுத்தது. செயற்கை சவ்வுகளின் உயிர் இயற்பியல் ஆய்வுகள், நீண்ட (C24) மற்றும் குறுகிய (C18-C16) அசைல் சங்கிலி செராமைடுகள் இரண்டும் கட்டப் பிரிப்பை ஏற்படுத்தக்கூடும் என்றாலும், நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைடுகள் (C24) மட்டுமே படலத்தை மறுவடிவமைக்க அதிக வளைவு மற்றும் படல வளைவை ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. பரஸ்பர குறிப்பு மூலம் (17, 37, 38). Emp24 இன் மனித ஹோமோலாக் ஆன TMED2 இன் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸ், சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபுல்களில் C18 செராமைடு அடிப்படையிலான ஸ்பிங்கோமைலினுடன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் தொடர்பு கொள்கிறது என்பது காட்டப்பட்டுள்ளது (39). மூலக்கூறு இயக்கவியல் (MD) உருவகப்படுத்துதல்களைப் பயன்படுத்தி, C18 மற்றும் C26 செராமைடுகள் இரண்டும் Emp24 டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸின் சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபுல்களைச் சுற்றி குவிகின்றன, மேலும் அவை ஒத்த விருப்பங்களைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S6). Emp24 இன் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் ஹெலிக்ஸ் சவ்வில் லிப்பிட்களின் சமச்சீரற்ற விநியோகத்திற்கு வழிவகுக்கும் என்பதை இது குறிக்கிறது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இது பாலூட்டி செல்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட சமீபத்திய முடிவு. இதேபோன்ற MD உருவகப்படுத்துதல்கள் ஈதர் லிப்பிட்களின் இருப்பையும் காட்டுகின்றன (40). எனவே, ER26 இன் இரண்டு லோபுல்களில் உள்ள C26 செராமைடு உள்நாட்டில் செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்று நாங்கள் ஊகிக்கிறோம். லுமினல் லோபுல்களில் உள்ள GPI-AP நேரடியாக மல்டிவேலண்ட் p24 உடன் பிணைக்கப்படும்போதும், சைட்டோபிளாஸ்மிக் லோபுல்களில் p24 ஐச் சுற்றி C26 செராமைடு குவியும் போதும், அது அதனுடன் இணைந்த புரத திரட்டலை ஊக்குவிக்கும் மற்றும் விரல்கள் வழியாக சவ்வு வளைவு உருவாக்கப்படுகிறது (41), இதனால் GPI-AP ERES ஐ ஒட்டியுள்ள தனித்தனி பகுதிகளாகப் பிரிக்கப்படுகிறது, இது ER சவ்வின் மிகவும் வளைந்த பகுதிகளையும் ஆதரிக்கிறது (42). முந்தைய அறிக்கைகள் முன்மொழியப்பட்ட பொறிமுறையை ஆதரித்தன (43, 44). பிளாஸ்மா சவ்வில் உள்ள ஒலிகோலெக்டின்கள், நோய்க்கிருமிகள் அல்லது செராமைடு அடிப்படையிலான கிளைகோஸ்பிங்கோலிப்பிட்களுக்கு (GSL) ஆன்டிபாடிகளின் மல்டிவேலண்ட் பிணைப்பு பெரிய GSL திரட்டலைத் தூண்டுகிறது, கட்டப் பிரிப்பை மேம்படுத்துகிறது மற்றும் சவ்வு சிதைவு மற்றும் உள்மயமாக்கலை ஏற்படுத்துகிறது (44). இவாபுச்சி போன்றவை (43) நீண்ட (C24) ஆனால் குறுகியதாக இல்லாத (C16) அசைல் சங்கிலிகளின் முன்னிலையில், GSL லாக்டோசில்செராமைடுடன் பிணைக்கப்பட்ட பன்முகத்தன்மை கொண்ட லிகண்ட் பெரிய கொத்துகள் மற்றும் சவ்வு ஊடுருவலை உருவாக்குவதைத் தூண்டியது, மேலும் துண்டுப்பிரசுரங்களில் உள்ள சைட்டோபிளாசம் லின்-மத்தியஸ்த சமிக்ஞை கடத்தல் இணைக்கப்பட்ட நியூட்ரோபில்களில் அசைல் சங்கிலிகளால் இடைக்கணிக்கப்படுகிறது.
பாலூட்டிகளின் துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களில், நுனி பிளாஸ்மா சவ்வின் நிலைக்கு ஆன்டி-கோல்கி நெட்வொர்க்கின் (TGN) செறிவு GPI-AP இன் பிரிப்பு மற்றும் வரிசைப்படுத்தலைக் கட்டுப்படுத்துகிறது (10, 45). இந்த திரட்டல் GPI-AP ஒலிகோமரைசேஷன் மூலம் இயக்கப்படுகிறது (36), ஆனால் இது ஈஸ்டில் நாம் காணும் செராமைடு சங்கிலி நீளத்தையும் சார்ந்து இருக்கலாம். பாலூட்டிகளின் GPI-AP ஈதர் லிப்பிட் அடிப்படையிலான நங்கூரத்தைக் கொண்டிருந்தாலும், அதன் வேதியியல் அமைப்பு மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைடிலிருந்து மிகவும் வேறுபட்டிருந்தாலும், இரண்டு லிப்பிடுகளும் பரிணாம ரீதியாக ஒத்த இயற்பியல் மற்றும் வேதியியல் பண்புகள் மற்றும் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன (40) என்று சமீபத்திய ஆய்வில் கண்டறியப்பட்டுள்ளது. எனவே, பாலூட்டிகளின் செல்களில் உள்ள ஈதர் லிப்பிட் பகுதி ஈஸ்டில் உள்ள C26 செராமைடைப் போலவே இருக்கலாம், மேலும் அதன் பங்கு GPI-AP திரட்டுதல் மற்றும் வரிசைப்படுத்தலை ஊக்குவிக்க சவ்வில் உள்ள நீண்ட சங்கிலி செராமைடுடன் தொடர்புபடுத்துவதாகும். இந்த சாத்தியக்கூறு இன்னும் நேரடியாக சோதிக்கப்பட வேண்டியிருந்தாலும், கோல்கி உடலுக்கு நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைட்டின் போக்குவரத்து சைட்டோபிளாஸ்மிக் பரிமாற்ற புரதங்களால் மேற்கொள்ளப்படுவதில்லை, ஆனால் ஈஸ்ட் போன்ற GPI நங்கூரங்களின் தொகுப்பைப் பொறுத்தது என்பதை முந்தைய கண்டுபிடிப்புகள் ஆதரிக்கின்றன. எனவே, பரிணாம பழமைவாத பொறிமுறையானது ஒரே போக்குவரத்து வெசிகிளில் மிக நீண்ட அசைல் சங்கிலி செராமைடு மற்றும் GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ஆகியவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்து இணைந்து கொண்டு செல்ல முடியும் என்று தெரிகிறது.
ஈஸ்ட் மற்றும் பாலூட்டிகளின் துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல் அமைப்புகளில், GPI-AP திரட்டுதல் மற்றும் பிற பிளாஸ்மா சவ்வு புரதங்களிலிருந்து பிரித்தல் அனைத்தும் செல் மேற்பரப்பை அடைவதற்கு முன்பே நிகழ்கின்றன. பாலடினோ மற்றும் பலர். (48) பாலூட்டிகளின் துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் TGN இல், GPI-AP கிளஸ்டரிங் என்பது GPI-APகளை நுனி பிளாஸ்மா சவ்வுக்கு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வகைப்பாட்டிற்கு மட்டுமல்லாமல், GPI-APகளின் கிளஸ்டரிங் அமைப்பையும் அதன் உயிரியல் செயல்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதைக் கண்டறிந்தனர். செல் மேற்பரப்பு. ஈஸ்டில், ER இல் உள்ள C26 செராமைடு சார்ந்த GPI-AP கிளஸ்டர், பிளாஸ்மா சவ்வில் GPI-AP இன் கிளஸ்டர் அமைப்பு மற்றும் செயல்பாட்டு செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்த முடியும் என்பதை இந்த ஆய்வு காட்டுகிறது (24, 49). இந்த மாதிரிக்கு இணங்க, GhLag1 செல்கள் GPI தடுப்பான்கள் அல்லது செல் சுவர் ஒருமைப்பாட்டை பாதிக்கும் மருந்துகளுக்கு ஒவ்வாமை கொண்டவை (28), மேலும் ஈஸ்ட் செல்களின் இனச்சேர்க்கையில் திட்டமிடப்பட்ட முனை செராமைட்டின் செயல்பாட்டு Gas1-GFP கிளஸ்டர்களின் (49) தேவை G​ இருப்பினும், லிப்பிட் நீளத்தின் அடிப்படையில் வரிசைப்படுத்தும் முறை மூலம் செல் மேற்பரப்பின் செயல்பாட்டு அமைப்பு ER இலிருந்து திட்டமிடப்பட்டுள்ளதா என்பதை மேலும் சோதிப்பது நமது எதிர்கால ஆராய்ச்சியின் பொருளாக இருக்கும்.
இந்த வேலையில் பயன்படுத்தப்படும் சாக்கரோமைசஸ் செரிவிசியா விகாரங்கள் அட்டவணை S1 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. நேரடி செல் இமேஜிங்கிற்கான SCLIM இன் MMY1583 மற்றும் MMY1635 விகாரங்கள் W303 இன் பின்னணியில் கட்டமைக்கப்பட்டன. ஃப்ளோரசன்ட் புரத குறிச்சொல்லுடன் Sec13-mCherry ஐ வெளிப்படுத்தும் இந்த விகாரங்கள் pFA6a பிளாஸ்மிட்டை ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகக் கொண்டு பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (PCR) அடிப்படையிலான முறையைப் பயன்படுத்தி கட்டமைக்கப்பட்டன (23). GAL1 ஊக்குவிப்பாளரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் ஃப்ளோரசன்ட் புரதத்துடன் பெயரிடப்பட்ட Mid2-iRFP ஐ வெளிப்படுத்தும் விகாரம் பின்வருமாறு கட்டமைக்கப்பட்டது. pKTiRFP-KAN வெக்டரிலிருந்து iRFP-KanMx வரிசையின் PCR பெருக்கம் (E. O'Shea இன் பரிசு, Addgene பிளாஸ்மிட் எண் 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ஆராய்ச்சி வள அடையாளங்காட்டி (RRID): Addgene_64687) மற்றும் எண்டோஜெனஸ் Mid2 இன் C-டெர்மினஸில் செருகப்பட்டது. Mid2-iRFP மரபணு வரிசை பெருக்கப்பட்டு GAL1 ஊக்குவிப்பாளராக குளோன் செய்யப்பட்ட பிறகு, அது ஒருங்கிணைப்பு பிளாஸ்மிட் pRS306 இன் Not I-Sac I தளத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. இதன் விளைவாக வந்த பிளாஸ்மிட் pRGS7, URA3 லோகஸில் ஒருங்கிணைக்க Pst I உடன் நேரியல் செய்யப்பட்டது.
Gas1-GFP இணைவு மரபணு, சென்ட்ரோமியர் (CEN) பிளாஸ்மிட்டில் GAL1 ஊக்குவிப்பாளரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, இது பின்வருமாறு கட்டமைக்கப்படுகிறது. Gas1-GFP வரிசையானது pRS416-GAS1-GFP பிளாஸ்மிட் (24) (L. Popoloவின் பரிசு) இலிருந்து PCR ஆல் பெருக்கப்பட்டு CEN பிளாஸ்மிட் pBEVY-GL LEU2 (C இன் பரிசு) இன் Xma I–Xho I தளத்தில் குளோன் செய்யப்பட்டது. மில்லர்; Addgene பிளாஸ்மிட் எண் 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). இதன் விளைவாக வரும் பிளாஸ்மிட் pRGS6 என்று பெயரிடப்பட்டது. Axl2-GFP இணைவு மரபணுவும் pBEVY-GL LEU2 திசையனின் GAL1 ஊக்குவிப்பாளரின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் அதன் கட்டுமானம் பின்வருமாறு. Axl2-GFP வரிசையானது pRS304-p2HSE-Axl2-GFP பிளாஸ்மிட் (23) இலிருந்து PCR ஆல் பெருக்கப்பட்டு, pBEVY-GL LEU2 வெக்டரின் Bam HI-Pst I தளத்தில் குளோன் செய்யப்பட்டது. இதன் விளைவாக வந்த பிளாஸ்மிட் pRGS12 என்று பெயரிடப்பட்டது. இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளின் வரிசை அட்டவணை S2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளது.
இந்த திரிபு 0.2% அடினீன் மற்றும் 2% குளுக்கோஸ் [YP-டெக்ஸ்ட்ரோஸ் (YPD)], 2% ராஃபினோஸ் [YP-ராஃபினோஸ்] நிறைந்த ஈஸ்ட் சாறு புரதம் p (YP) ஊடகம் (1% ஈஸ்ட் சாறு மற்றும் 2% புரதம் ept). (YPR)] அல்லது 2% கேலக்டோஸ் [YP-கேலக்டோஸ் (YPG)] கார்பன் மூலமாகவோ அல்லது செயற்கை குறைந்தபட்ச ஊடகத்தில் (0.15% ஈஸ்ட் நைட்ரஜன் அடிப்படை மற்றும் 0.5% அம்மோனியம் சல்பேட்) ஊட்டச்சத்துக்குத் தேவையான பொருத்தமான அமினோ அமிலங்கள் மற்றும் காரங்களை நிரப்பவும், 2% குளுக்கோஸ் (செயற்கை குளுக்கோஸ் குறைந்தபட்ச ஊடகம்) அல்லது 2% கேலக்டோஸ் (செயற்கை கேலக்டோஸ் குறைந்தபட்ச ஊடகம்) கார்பன் மூலமாகவும் சேர்க்கப்பட்டது.
நிகழ்நேர இமேஜிங்கிற்காக, GAL1 ஊக்குவிப்பாளரின் கீழ் கட்டமைப்பை வெளிப்படுத்தும் வெப்பநிலை உணர்திறன் கொண்ட sec31-1 விகாரி செல்கள், YPR ஊடகத்தில் 24°C முதல் மிட்-லாக் கட்டம் வரை ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டன. YPG இல் 24°C இல் 1 மணி நேரம் தூண்டப்பட்ட பிறகு, செல்கள் SG இல் 37°C இல் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் சுரப்புத் தொகுதியிலிருந்து விடுவிக்க 24°C க்கு மாற்றப்பட்டன. ஒரு கண்ணாடி ஸ்லைடில் செல்களை சரிசெய்ய Concanavalin A பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் SCLIM ஆல் படம்பிடிக்கப்பட்டது. SCLIM என்பது ஒலிம்பஸ் IX-71 தலைகீழ் ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மற்றும் UPlanSApo 100×1.4 எண் துளை எண்ணெய் லென்ஸ் (ஒலிம்பஸ்), அதிவேக மற்றும் உயர்-சிக்னல்-க்கு-இரைச்சல் விகிதம் சுழலும் வட்டு கன்ஃபோகல் ஸ்கேனர் (யோகோகாவா எலக்ட்ரிக்), தனிப்பயன் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் மற்றும் தனிப்பயன் குளிரூட்டல் ஆகியவற்றின் கலவையாகும். அமைப்பின் பட தீவிரப்படுத்தி (ஹமாமட்சு ஃபோட்டோனிக்ஸ்) ×266.7 இறுதி உருப்பெருக்கத்துடன் கூடிய உருப்பெருக்கி லென்ஸ் அமைப்பையும் எலக்ட்ரான்களைப் பெருக்கும் சார்ஜ்-இணைக்கப்பட்ட சாதன கேமராவையும் (ஹமாமட்சு ஃபோட்டோனிக்ஸ்) வழங்க முடியும் (21). பட கையகப்படுத்தல் தனிப்பயன் மென்பொருளால் (யோகோகாவா எலக்ட்ரிக்) செய்யப்படுகிறது. 3D படங்களுக்கு, புறநிலை லென்ஸை செங்குத்தாக அதிர்வுறச் செய்ய தனிப்பயன் பைசோ எலக்ட்ரிக் ஆக்சுவேட்டரைப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் 100 nm இடைவெளியில் ஆப்டிகல் பாகங்களை ஒரு அடுக்கில் சேகரித்தோம். Z-ஸ்டேக் படம் 3D வோக்சல் தரவாக மாற்றப்படுகிறது, மேலும் சுழலும் வட்டு கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கிக்கு பயன்படுத்தப்படும் தத்துவார்த்த புள்ளி பரவல் செயல்பாடு வோலோசிட்டி மென்பொருளால் (பெர்கின்எல்மர்) டிகான்வல்யூஷன் செயலாக்கத்திற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இணை-இருப்பிட பகுப்பாய்விற்கான வரம்பை தானாக வோலோசிட்டி மென்பொருளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், சரக்குகள் உட்பட ERES அளவிடப்பட்டது. மெட்டாமார்ஃப் மென்பொருளை (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) பயன்படுத்தி வரி ஸ்கேன் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
புள்ளிவிவர முக்கியத்துவத்தை தீர்மானிக்க கிராப்பேட் பிரிசம் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தவும். இரு-வால் மாணவர்களின் டி-சோதனை மற்றும் மாறுபாட்டின் சாதாரண ஒரு-வழி பகுப்பாய்வு (ANOVA) சோதனைக்கு, குழுக்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகள் P <0.05 (*) இல் குறிப்பிடத்தக்க தாக்கத்தை ஏற்படுத்துவதாகக் கருதப்படுகிறது.
Gas1-GFP இன் ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கிக்கு, லாக் ஃபேஸ் செல்கள் YPD-யில் ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டு, மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு, பாஸ்பேட் பஃபர் செய்யப்பட்ட உப்புநீரால் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, குறைந்தது 15 நிமிடங்கள் பனியில் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி நுண்ணோக்கியின் கீழ் தொடர்ந்தது. Check (24) . புறநிலை லென்ஸ், L5 (GFP) வடிகட்டி, ஹமாமட்சு கேமரா மற்றும் அப்ளிகேஷன் சூட் X (LAS X) மென்பொருள் ஆகியவற்றைக் கொண்ட லைக்கா DMi8 நுண்ணோக்கி (HCX PL APO 1003/1.40 எண்ணெய் PH3 CS) கையகப்படுத்துதலுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மாதிரிகள் 65°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு SDS மாதிரி இடையகத்துடன் இயற்கை நீக்கம் செய்யப்பட்டன, பின்னர் SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (PAGE) மூலம் பிரிக்கப்பட்டன. இம்யூனோபிளாட்டிங் பகுப்பாய்விற்கு, ஒரு பாதைக்கு 10 μl மாதிரி ஏற்றப்பட்டது. முதன்மை ஆன்டிபாடி: 1:3000 நீர்த்தலில் முயல் பாலிகுளோனல் ஆன்டி-கேஸ்1, 1:500 நீர்த்தலில் முயல் பாலிகுளோனல் ஆன்டி-எம்பி24 மற்றும் 1:3000 நீர்த்தலில் முயல் பாலிகுளோனல் ஆன்டி-ஜிஎஃப்பி (எச். ரைஸ்மானிடமிருந்து பரிசு) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தவும். எலி மோனோக்ளோனல் ஆன்டி-பிஜிகே1 ஆன்டிபாடி 1:5000 நீர்த்தலில் பயன்படுத்தப்பட்டது (ஜே. டி லா க்ரூஸிடமிருந்து பரிசு). இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடி: ஹார்ஸ்ராடிஷ் பெராக்ஸிடேஸ் (HRP) இணைந்த ஆடு எதிர்ப்பு-முயல் இம்யூனோகுளோபுலின் ஜி (IgG) 1:3000 நீர்த்தலில் (பியர்ஸ்) பயன்படுத்தப்பட்டது. HRP-இணைந்த ஆடு எலி எதிர்ப்பு IgG 1:3000 (பியர்ஸ்) நீர்த்தலில் பயன்படுத்தப்பட்டது. சூப்பர்சிக்னல் வெஸ்ட் பைக்கோ ரீஜென்ட்டின் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) கெமிலுமினென்சென்ஸ் முறையால் நோய் எதிர்ப்பு சக்தி மண்டலம் காணப்பட்டது.
(31) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னத்தில் ஒரு இயற்கையான நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு பரிசோதனை செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, 100 ஒளியியல் அடர்த்தியில் இரண்டு முறை 600 nm (OD600) இல் TNE இடையகத்துடன் [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ஃபீனைல்மெதில்சல்போனைல் ஃப்ளோரைடு மற்றும் புரோட்டீஸ் தடுப்பான் கலவை) ஈஸ்ட் செல்களைக் கழுவவும். இது கண்ணாடி மணிகளால் உடைக்கப்பட்டது, பின்னர் செல் குப்பைகள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகள் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. பின்னர் சூப்பர்நேட்டண்ட் 17,000 கிராம் அளவில் 15 நிமிடங்களுக்கு 4°C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. துகள் TNE இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு டிஜிட்டலிஸ் சபோனின் 1% இறுதி செறிவுடன் சேர்க்கப்பட்டது. இடைநீக்கம் 4°C இல் சுழற்சியுடன் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது, பின்னர் கரையாத கூறுகள் 13,000 கிராம் 4°C இல் 60 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. Gas1-GFP இம்யூனோபிரசிபிட்டேஷனுக்கு, முதலில் மாதிரியை 4°C வெப்பநிலையில் வெற்று அகரோஸ் மணிகள் (ChromoTek) கொண்டு 1 மணி நேரம் முன்-இன்குபேட் செய்யவும், பின்னர் 4°C வெப்பநிலையில் GFP-Trap_A (ChromoTek) கொண்டு 3 மணி நேரம் இன்குபேட் செய்யவும். இம்யூனோபிரசிபிட்டேட்டட் மணிகள் 0.2% டிகோக்ஸிஜெனின் கொண்ட TNE மூலம் ஐந்து முறை கழுவப்பட்டு, SDS மாதிரி இடையகத்தால் நீக்கப்பட்டு, SDS-PAGE இல் பிரிக்கப்பட்டு, இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
(31) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னத்தில் குறுக்கு-இணைப்பு தீர்மானம் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, செறிவூட்டப்பட்ட ER பின்னம் 0.5 mM டைதியோபிஸ் (சக்சினிமிடில் புரோபியோனேட்) (பியர்ஸ், தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், ராக்ஃபோர்ட், IL, அமெரிக்கா; 20°C, 20 நிமிடம்) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. கிளைசினைச் சேர்ப்பதன் மூலம் குறுக்கு-இணைப்பு எதிர்வினை தணிக்கப்பட்டது (50 mM இறுதி செறிவு, 5 நிமிடங்கள், 20°C).
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி (50), காட்டு-வகை மற்றும் GhLag1 விகாரங்களில் செராமைட்டின் MS பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, செல்கள் YPD இல் 30°C இல் அதிவேக கட்டத்திற்கு (3 முதல் 4 OD600 அலகுகள்/மிலி) வளர்க்கப்பட்டன, மேலும் 25×107 செல்கள் அறுவடை செய்யப்பட்டன. அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றம் ட்ரைக்ளோரோஅசெடிக் அமிலத்தால் தணிக்கப்படுகிறது. பிரித்தெடுக்கும் கரைப்பான் [எத்தனால், நீர், ஈதர், பைரிடின் மற்றும் 4.2 N அம்மோனியம் ஹைட்ராக்சைடு (15:15:5:1:0.018 v/v)] மற்றும் 1.2 nmol உள் நிலையான C17 செராமைடு (860517, அவந்தி போலார் லிப்பிட்) தரம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தவும். சாற்றின் லேசான கார நீராற்பகுப்பைச் செய்ய மோனோமெதிலமைன் ரியாஜென்ட்டை [மெத்தனால், நீர், n-பியூட்டனால் மற்றும் மெத்திலமைன் கரைசல் (4:3:1:5 v/v)] பயன்படுத்தவும், பின்னர் உப்பு நீக்க நீர்-நிறைவுற்ற n-பியூட்டனாலைப் பயன்படுத்தவும். இறுதியாக, சாறு ஒரு நேர்மறை பயன்முறை கரைப்பானில் [குளோரோஃபார்ம்/மெத்தனால்/நீர் (2:7:1) + 5 mM அம்மோனியம் அசிடேட்] மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, நிறை நிறமாலையில் செலுத்தப்பட்டது. ஸ்பிங்கோலிப்பிட் மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காணவும் அளவிடவும் பல-வினை கண்காணிப்பு (MRM) செய்யப்பட்டது. TSQ Vantage மூன்றாம் நிலை குவாட்ரூபோல் நிறை நிறமாலை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) லிப்பிட் பகுப்பாய்விற்காக ஒரு ரோபோ நானோஃப்ளோ அயன் மூல நானோமேட் HD (அட்வியன் பயோசயின்சஸ், இத்தாக்கா, NY) உடன் பொருத்தப்பட்டுள்ளது. மோதல் ஆற்றல் ஒவ்வொரு செராமைடு வகைக்கும் உகந்ததாக உள்ளது. MS தரவு நேர்மறை பயன்முறையில் பெறப்பட்டது. ஒவ்வொரு உயிரியல் பிரதிக்கும், லிப்பிட் சிக்னல் மூன்று சுயாதீன அளவீடுகளின் சராசரி ஆகும்.
(31) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, Gas1-GFP ஐ வெளிப்படுத்தும் செல்கள் (800×107) இயற்கையான நோயெதிர்ப்புத் தடுப்புக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. சுத்திகரிக்கப்பட்ட Gas1-GFP SDS-PAGE ஆல் பிரிக்கப்பட்டு ஒரு பாலிவினைலைடின் ஃப்ளோரைடு (PVDF) சவ்வுக்கு மாற்றப்பட்டது. PVDF ஐ அமைடு கருப்பு நிறத்தில் கறைபடுத்துவதன் மூலம் புரதம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டது. Gas1-GFP பட்டை PVDF இலிருந்து வெட்டப்பட்டு 5 முறை மெத்தனால் மற்றும் ஒரு முறை திரவ குரோமடோகிராபி-MS (LC-MS) தர நீரில் கழுவப்பட்டது. சவ்வுப் பட்டையை 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), பஃபர் மற்றும் 500μl புதிதாகக் கரைக்கப்பட்ட 1 M சோடியம் நைட்ரைட் கலவையுடன் 37°C இல் 3 மணி நேரம் அடைகாப்பதன் மூலம், லிப்பிட் பின்னம் Gas1-GFP இலிருந்து வெளியிடப்பட்டு லைஸ் செய்யப்படுகிறது (51). அதன் பிறகு, சவ்வுப் பட்டை LC-MS தர நீரில் நான்கு முறை கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் உலர்த்தப்பட்டு, பகுப்பாய்வு வரை -80°C இல் நைட்ரஜன் வளிமண்டலத்தில் சேமிக்கப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, ஒவ்வொரு பரிசோதனைக்கும் PVDF சவ்வின் வெற்று மாதிரி பயன்படுத்தப்பட்டது. Gas1-GFP இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட லிப்பிட் பின்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (50). சுருக்கமாக, GPI-லிப்பிட் கொண்ட PVDF பட்டைகள் 75μl எதிர்மறை அச்சு கரைப்பானில் [குளோரோஃபார்ம்/மெத்தனால் (1:2) + 5 mM அம்மோனியம் அசிடேட்] மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, ஸ்பிங்கோலிப்பிட் இனங்களின் (TSQ Vantage) எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் (ESI)-MRM/MS பகுப்பாய்வில் தேர்ச்சி பெற்றன. இந்த வழக்கில், MS தரவு எதிர்மறை அயனி முறையில் பெறப்பட்டது.
முன்னர் குறிப்பிட்டபடி, GPI ஆங்கரின் லிப்பிட் பகுதி [3H]-இனோசிட்டால்-லேபிளிடப்பட்ட GPI-AP (16) இலிருந்து பிரிக்கப்பட்டது. லிப்பிடுகள் ஒரு கரைப்பான் அமைப்பைப் பயன்படுத்தி மெல்லிய-அடுக்கு குரோமடோகிராஃபி மூலம் பிரிக்கப்பட்டு (55:45:10 குளோரோஃபார்ம்-மெத்தனால்-0.25% KCl) FLA-7000 (Fujifilm) ஐப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
Gas1-GFP (600×107) ஐ வெளிப்படுத்தும் செல்கள் TNE பஃபரால் TNE பஃபரால் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, கண்ணாடி மணிகளால் உடைக்கப்பட்டு, பின்னர் செல் குப்பைகள் மற்றும் கண்ணாடி மணிகளை அகற்ற மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன. பின்னர் சூப்பர்நேட்டண்ட் 17,000 கிராம் வெப்பநிலையில் 4°C இல் 1 மணி நேரம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. துகள் TNE இல் கழுவப்பட்டு, 0.2% டிஜிட்டலிஸ் சபோனின் கொண்ட TNE இல் 1 U PI-PLC (இன்விட்ரஜன்) உடன் 37°C இல் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. நொதி சிகிச்சைக்குப் பிறகு, சவ்வு 17,000 கிராம் 4°C இல் 1 மணி நேரம் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டது. Gas1-GFP ஐ இம்யூனோபிரிசிபிடேட் செய்ய, சூப்பர்நேட்டண்ட் ஒரே இரவில் 4°C இல் GFP-Trap_A (Chromotek) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. SDS-PAGE ஆல் பிரிக்கப்பட்ட சுத்திகரிக்கப்பட்ட Gas1-GFP கூமாஸி புத்திசாலித்தனமான நீலத்தால் கறை படிந்தது. நீர்க்குழாய் சுற்றியுள்ள சாம்பல் நிறத்தில் இருந்து Gas1-GFP நிறமிடும் பட்டை துண்டிக்கப்பட்டது, பின்னர் அயோடோஅசெட்டமைடுடன் அல்கைலேஷனுக்கும், டைதியோத்ரைட்டோலுடன் குறைப்புக்கும் பிறகு, டிரிப்சினுடன் இன்-ஜெல் செரிமானம் செய்யப்பட்டது. GPI-கிளைக்கான்களுடன் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் மற்றும் பெப்டைடுகளைப் பிரித்தெடுத்து உலர்த்தவும். உலர்ந்த பெப்டைடு 20 μl தண்ணீரில் கரைக்கப்பட்டது. LC இல் ஒரு பகுதியை (8μl) செலுத்தவும். குறிப்பிட்ட சாய்வு நிலைமைகளின் கீழ் பெப்டைடுகளைப் பிரிக்க ஒரு ஆக்டாடெசில்சிலேன் (ODS) நெடுவரிசை (டெவெலோசில் 300ODS-HG-5; உள் விட்டம் 150 மிமீ×1.0 மிமீ; நோமுரா கெமிக்கல், ஐச்சி ப்ரிபெக்சர், ஜப்பான்) பயன்படுத்தப்பட்டது. மொபைல் கட்டம் கரைப்பான் A (0.08% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் கரைப்பான் B (80% அசிட்டோனிட்ரைலில் 0.15% ஃபார்மிக் அமிலம்) ஆகும். ஒரு Accela HPLC அமைப்பு (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், பாஸ்டன், மாசசூசெட்ஸ்) 55 நிமிடங்களுக்குள் 50 μl நிமிடம்-1 ஓட்ட விகிதத்தில் கரைப்பான் A உடன் நெடுவரிசையை நீக்க பயன்படுத்தப்பட்டது, பின்னர் கரைப்பான் B இன் செறிவு 40% ஆக அதிகரிக்கப்பட்டது. , அமெரிக்கா). எல்யூயேட் தொடர்ந்து ESI அயன் மூலத்தில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது, மேலும் GPI-கிளைக்கான்களுடன் கூடிய டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் மற்றும் பெப்டைடுகள் LTQ ஆர்பிட்ராப் XL (கலப்பின நேரியல் அயன் பொறி-ஆர்பிட்ராப் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர்; தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. MS அமைப்பில், கேபிலரி மூலத்தின் மின்னழுத்தம் 4.5 kV ஆக அமைக்கப்பட்டது, மேலும் பரிமாற்ற கேபிலரியின் வெப்பநிலை 300°C இல் வைக்கப்பட்டது. கேபிலரி மின்னழுத்தம் மற்றும் குழாய் லென்ஸ் மின்னழுத்தம் முறையே 15 V மற்றும் 50 V ஆக அமைக்கப்பட்டது. MS தரவு நேர்மறை அயனி பயன்முறையில் (60,000 தெளிவுத்திறன்; ஒரு மில்லியனுக்கு 10 பாகங்கள் நிறை துல்லியம்) 300/m/z நிறை/மின்னழுத்த விகிதம் (m/z) 3000 என்ற நிறை வரம்பில் பெறப்பட்டது. MS/MS தரவு LTQ ஆர்பிட்ராப் XL இல் உள்ள அயனி பொறி மூலம் பெறப்படுகிறது [தரவு சார்ந்திருக்கும் முதல் 3 இலக்கங்கள், மோதல் தூண்டப்பட்ட விலகல் (CID)].
GROMACS (52) மென்பொருள் மற்றும் MARTINI 2 படை புலம் (53-55) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி MD உருவகப்படுத்துதல்கள் செய்யப்பட்டன. பின்னர் CHARMM GUI சவ்வு உருவாக்குநர் (56, 57) டையோலியோல்பாஸ்பேட்டிடைல்கோலின் (DOPC) மற்றும் Cer C18 அல்லது DOPC மற்றும் Cer C26 ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு இரு அடுக்கை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது. Cer C26 இன் இடவியல் மற்றும் ஆயத்தொலைவுகள் ஸ்பிங்கோசின் வாலில் இருந்து கூடுதல் மணிகளை அகற்றுவதன் மூலம் DXCE இலிருந்து பெறப்படுகின்றன. இரட்டை அடுக்கை சமநிலைப்படுத்தி அதை இயக்க கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ள செயல்முறையைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் Emp24 ஐக் கொண்ட ஒரு அமைப்பை உருவாக்க அமைப்பின் கடைசி ஆயத்தொலைவுகளைப் பயன்படுத்தவும். ஈஸ்ட் Emp24 இன் டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் டொமைன் (எச்சங்கள் 173 முதல் 193 வரை) காட்சி MD (VMD) கருவி மூலக்கூறு அமைப்பைப் பயன்படுத்தி α-ஹெலிக்ஸாக கட்டமைக்கப்பட்டது (58). பின்னர், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த லிப்பிட்களை அகற்றிய பிறகு, புரதம் கரடுமுரடான முறையில் கிரானுலேட்டாக மாற்றப்பட்டு CHARMM GUI ஐப் பயன்படுத்தி இரு அடுக்கில் செருகப்பட்டது. இறுதி அமைப்பில் 1202 DOPC மற்றும் 302 Cer C26 அல்லது 1197 DOPC மற்றும் 295 Cer C18 மற்றும் Emp24 ஆகியவை உள்ளன. அமைப்பை 0.150M செறிவுக்கு அயனியாக்கம் செய்யவும். இரண்டு இரு அடுக்கு கலவைகளுக்கு நான்கு சுயாதீன பிரதிகள் செய்யப்பட்டன.
லிப்பிட் பைலேயர் CHARMM GUI செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி சமநிலைப்படுத்தப்படுகிறது, இதில் 405,000 படிகளைக் குறைத்து பின்னர் சமநிலைப்படுத்துதல் அடங்கும், அங்கு நிலை கட்டுப்பாடுகள் படிப்படியாகக் குறைக்கப்பட்டு நீக்கப்படுகின்றன, மேலும் நேரப் படி 0.005 ps இலிருந்து 0.02 ps ஆக அதிகரிக்கப்படுகிறது. சமநிலைக்குப் பிறகு, அது 0.02 ps நேரப் படியுடன் 6 µs ஐ உருவாக்குகிறது. Emp24 ஐச் செருகிய பிறகு, அதே CHARMM GUI செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி அமைப்பைக் குறைத்து சமநிலைப்படுத்தவும், பின்னர் உற்பத்தியில் 8 வினாடிகள் இயக்கவும்.
அனைத்து அமைப்புகளுக்கும், சமநிலைப்படுத்தும் செயல்பாட்டின் போது, ​​அழுத்தம் பெரென்ட்சென் பரோஸ்டாட் (59) ஆல் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் உற்பத்தி செயல்பாட்டின் போது, ​​அழுத்தம் பாரினெல்லோ-ரஹ்மான் பரோஸ்டாட் (60) ஆல் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. எல்லா சந்தர்ப்பங்களிலும், சராசரி அழுத்தம் 1 பார் மற்றும் ஒரு அரை-ஐசோட்ரோபிக் அழுத்த இணைப்பு திட்டம் பயன்படுத்தப்படுகிறது. சமநிலை மற்றும் உற்பத்தி செயல்பாட்டில், வேக மறுசீரமைப்புடன் கூடிய ஒரு தெர்மோஸ்டாட் (61) முறையே புரதம், லிப்பிட் மற்றும் கரைப்பான் துகள்களின் வெப்பநிலையை இணைக்கப் பயன்படுகிறது. முழு செயல்பாட்டின் போது, ​​இலக்கு வெப்பநிலை 310K ஆகும். 0.005 இடையக சகிப்புத்தன்மையுடன் வெர்லெட் திட்டத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு இணைத்தல் பட்டியலை உருவாக்குவதன் மூலம் பிணைப்பு அல்லாத தொடர்பு கணக்கிடப்படுகிறது. கூலம்ப் சொல் எதிர்வினை புலம் மற்றும் 1.1 nm வெட்டு-ஆஃப் தூரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகிறது. வேண்டர் வால்ஸ் சொல் 1.1 nm வெட்டு-ஆஃப் தூரத்துடன் ஒரு வெட்டு-ஆஃப் திட்டத்தைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் வெர்லெட் வெட்டு-ஆஃப் திட்டம் சாத்தியமான சறுக்கலுக்கு (62) பயன்படுத்தப்படுகிறது.
VMD ஐப் பயன்படுத்தி, DOPC பாஸ்பேட் மணிகள் அல்லது செராமைடு AM1 மணிகள் மற்றும் புரதத்திற்கு இடையிலான வெட்டு அலைநீளம் 0.7 nm ஆகும், மேலும் புரதத்துடன் தொடர்பு கொள்ளும் லிப்பிட்களின் எண்ணிக்கை கணக்கிடப்படுகிறது. பின்வரும் சூத்திரத்தின்படி, (63) இல் உள்ளபடி குறைப்பு-செறிவூட்டல் (DE) காரணியைக் கணக்கிடுங்கள்: DE காரணி = (புரதத்தில் உள்ள மொத்த லிப்பிட்களின் அளவு 0.7) புரதம் 0.7 இல் (மொத்த லிப்பிட்களில் Cer இன் அளவு)
அறிக்கையிடப்பட்ட மதிப்பு சராசரியாகப் பெறப்படுகிறது, மேலும் பிழைப் பட்டைகள் SE இன் நான்கு சுயாதீன நகல்களாகும். DE காரணியின் புள்ளிவிவர முக்கியத்துவம் t சோதனை [(சராசரிDE-காரணி-1)/SE] மூலம் கணக்கிடப்படுகிறது. ஒரு-வால் பரவலில் இருந்து P மதிப்பைக் கணக்கிடுங்கள்.
GROMACS கருவி, Emp24 ஐக் கொண்ட அமைப்பின் 2D பக்கவாட்டு அடர்த்தி வரைபடத்தைக் கணக்கிடப் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது சுவட்டின் கடைசி 250 ns க்குள் உள்ளது. செராமைட்டின் செறிவூட்டல்/குறைப்பு வரைபடத்தைப் பெற, Cer இன் அடர்த்தி வரைபடம் Cer மற்றும் DOPC இன் வரைபடத்தின் கூட்டுத்தொகையால் வகுக்கப்படுகிறது, பின்னர் உடலில் உள்ள Cer இன் செறிவால் வகுக்கப்படுகிறது. அதே வண்ண வரைபட அளவுகோல் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
இந்தக் கட்டுரைக்கான துணைப் பொருட்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ஐப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-வணிகமற்ற உரிமத்தின் விதிமுறைகளின் கீழ் விநியோகிக்கப்படும் ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரையாகும், இது எந்தவொரு ஊடகத்திலும் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது, இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக அல்ல, மேலும் அசல் படைப்பு சரியானது என்பதே அடிப்படை. குறிப்பு.
குறிப்பு: நீங்கள் பக்கத்திற்கு பரிந்துரைக்கும் நபர் மின்னஞ்சலைப் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் தெரிந்துகொள்ளும் வகையில் மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் உங்களிடம் கேட்கிறோம். எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் நாங்கள் கைப்பற்ற மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளரா என்பதை சோதிக்கவும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுக்கவும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera, Aguilera-Romero, (செர்ஜியோ லோபஸ்), மிஹோ வாகா (மிஹோ வாகா), மிசாகோ அர்மான் (மிசாகோ அர்மான்), மியாகோ ரிமான் (மியாகோ ரிமான்), ப்ரோ அகிரா, ஸ்டெபனோ ஃபேனி, அகிஹிகோ நகனோ, மானுவல் முனிஸ்
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியீட்டு தளங்களில் புரத வரிசைப்படுத்தலுக்கான செராமைடு சங்கிலி நீளத்தின் முக்கியத்துவத்தை 3D உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிகழ்நேர இமேஜிங் வெளிப்படுத்துகிறது.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera, Aguilera-Romero, (செர்ஜியோ லோபஸ்), மிஹோ வாகா (மிஹோ வாகா), மிசாகோ அர்மான் (மிசாகோ அர்மான்), மியாகோ ரிமான் (மியாகோ ரிமான்), ப்ரோ அகிரா, ஸ்டெபனோ ஃபேனி, அகிஹிகோ நகனோ, மானுவல் முனிஸ்
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வெளியீட்டு தளங்களில் புரத வரிசைப்படுத்தலுக்கான செராமைடு சங்கிலி நீளத்தின் முக்கியத்துவத்தை 3D உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிகழ்நேர இமேஜிங் வெளிப்படுத்துகிறது.
©2020 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS என்பது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.