Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS-க்கு குறைந்த ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காண்பிப்போம்.
முதுகெலும்புள்ள விலங்குகளைப் போலல்லாமல், பூச்சிகளில் ஆண் சார்புடைய பாலியல் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்கள் இல்லை என்று பரவலாகக் கருதப்படுகிறது. அனோபிலிஸ் காம்பியாவில், எக்டிசோன் ஸ்டீராய்டு 20-ஹைட்ராக்ஸிஎக்டிசோன் (20E) பெண்களால் தொகுக்கப்படும்போது முட்டை வளர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்தவும், ஆண்களால் பாலியல் ரீதியாக மாற்றப்படும்போது இனச்சேர்க்கை காலத்தைத் தூண்டவும் பரிணமித்ததாகத் தெரிகிறது3. முட்டை வளர்ச்சி மற்றும் இனச்சேர்க்கை அத்தியாவசிய இனப்பெருக்க பண்புகளாக இருப்பதால், பெண் அனோபிலிஸ் கொசுக்கள் இந்த ஹார்மோன் சமிக்ஞைகளை எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்வது புதிய மலேரியா கட்டுப்பாட்டுத் திட்டங்களை வடிவமைக்க உதவும். இங்கே, இந்த இனப்பெருக்க செயல்பாடுகள் எக்டிஸ்டீராய்டு-செயல்படுத்தும்/செயலிழக்கச் செய்யும் நொதிகளின் சிக்கலான நெட்வொர்க் மூலம் தனித்துவமான பாலியல் ஸ்டீராய்டுகளால் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதை நாங்கள் வெளிப்படுத்துகிறோம். ஆண்-குறிப்பிட்ட ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட எக்டிசோன், 3-டீஹைட்ரோ-20E (3D20E) ஐ நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம், இது பாலியல் பரிமாற்றத்தைத் தொடர்ந்து பெண் பாலியல் ஏற்புத்தன்மையை மூடுவதன் மூலம் பெற்றோரைப் பாதுகாக்கிறது மற்றும் டிபாஸ்போரிலேஷன் மூலம் செயல்படுத்தப்படுகிறது.குறிப்பாக, 3D20E பரிமாற்றம் பிளாஸ்மோடியம் நோய்த்தொற்றின் போது முட்டை வளர்ச்சியைப் பராமரிக்கும் இனப்பெருக்க மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டையும் தூண்டியது, பாதிக்கப்பட்ட பெண்களின் ஆரோக்கியத்தை உறுதி செய்கிறது. பெண்-பெறப்பட்ட 20E பாலியல் ரீதியான எதிர்வினையைத் தூண்டாது, ஆனால் 20E-தடுக்கும் கைனேஸ்கள் தடுக்கப்பட்ட பிறகு இனச்சேர்க்கை தனிநபர்கள் முட்டையிட அனுமதிக்கிறது. இந்த ஆண்-குறிப்பிட்ட பூச்சி ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனின் அடையாளம் மற்றும் பெண் பாலியல் ஏற்புத்திறன், கருவுறுதல் மற்றும் பிளாஸ்மோடியத்துடனான தொடர்பு ஆகியவற்றை ஒழுங்குபடுத்துவதில் அதன் பங்கு ஆகியவை மலேரியாவைப் பரப்பும் கொசுக்களின் இனப்பெருக்க வெற்றியைக் குறைக்கும் திறனைக் குறிக்கிறது.
மனித மலேரியா ஒட்டுண்ணிகளின் ஒரே நோய்க்கிருமியான அனோபிலிஸ் கொசுக்களில் பரவலான பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்பு காரணமாக மலேரியா வழக்குகள் மற்றும் இறப்புகள் மீண்டும் அதிகரித்து வருகின்றன4. இந்த கொசுக்களின் இனச்சேர்க்கை உயிரியல் புதிய மலேரியா கட்டுப்பாட்டு தலையீடுகளுக்கு குறிப்பாக கவர்ச்சிகரமான இலக்காகும், ஏனெனில் பெண்கள் ஒரு முறை மட்டுமே இனச்சேர்க்கை செய்கிறார்கள்5; இந்த ஒற்றை இனச்சேர்க்கை நிகழ்வை மலட்டுத்தன்மையாக்குவது வயலில் கொசுக்களின் எண்ணிக்கையைக் குறைக்க பெரும் ஆற்றலைக் கொண்டிருக்கும்.
ஆண்களிடமிருந்து அதிக டைட்டர் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களைப் பெற்ற பிறகு பெண்கள் பாலியல் ரீதியாக செயலிழக்கிறார்கள். மேலும் இனச்சேர்க்கையில் சிரமத்திற்கு தூண்டுதல் 20-ஹைட்ராக்ஸிசெக்டிசோன் (20E) என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது லார்வா நிலையில் உருகும் சுழற்சியின் சீராக்கி என நன்கு அறியப்படும் ஒரு ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் ஆகும். 20E ஐ ஒருங்கிணைத்து மாற்றும் ஆண்களின் திறன் குறிப்பாக செல்லியா7 என்ற துணை இனத்தின் ஒரு பகுதியாக இருக்கும் அனோபிலிஸ் இனங்களில் உருவாகியுள்ளது, இது ஆப்பிரிக்காவில் விநியோகிக்கப்படுகிறது மற்றும் அனோபிலிஸ் காம்பியா உட்பட மலேரியாவின் மிகவும் ஆபத்தான திசையன்களை உள்ளடக்கியது. இது குறிப்பாக குறிப்பிடத்தக்கது, ஏனெனில் இந்த இனங்களில் பெண்கள் ஒவ்வொரு இரத்த உணவிற்கும் பிறகும் 20E ஐ உற்பத்தி செய்கிறார்கள், மேலும் 20E ஓஜெனிசிஸ் சுழற்சியை இயக்குகிறது (குறிப்பு 8 ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், பெண்கள் தங்கள் சொந்த இனச்சேர்க்கை திறனை சமரசம் செய்யாமல் எக்டிசோனின் இரண்டு வெவ்வேறு மூலங்களிலிருந்து (ஆண் பரிமாற்றம் மற்றும் இரத்த உணவு தூண்டுதல்) சமிக்ஞைகளை எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கிறார்கள் என்பது பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை. உண்மையில், பெண்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் 20E பாலியல் சகிப்புத்தன்மையைத் தூண்டினால், இது கன்னிப் பாலூட்டும் நபர்களில் மலட்டுத்தன்மைக்கு வழிவகுக்கும், இது இந்த கொசுக்களில் மிகவும் பொதுவான நடத்தை5.
ஒரு சாத்தியமான விளக்கம் என்னவென்றால், A. gambiae ஆண்கள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஆண்-குறிப்பிட்ட எக்டிசோனை மாற்றுகிறார்கள், இது பெண் இனப்பெருக்க பாதையில் ஒரு சமிக்ஞை அடுக்கை செயல்படுத்துகிறது, இதன் விளைவாக இனச்சேர்க்கை உறுதியற்ற தன்மை ஏற்படுகிறது. இருப்பினும், முதுகெலும்புகள் ஈஸ்ட்ரோஜன் மற்றும் ஆண்ட்ரோஜன் போன்ற பல ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களைக் கொண்டிருந்தாலும் (குறிப்பு 9 இல் மதிப்பாய்வு செய்யப்பட்டது), எங்கள் அறிவுக்கு, ஆண்ட்ரோஜெனிக்-சார்புடைய ஸ்டீராய்டுகள் பூச்சிகளில் அடையாளம் காணப்படவில்லை.
பாலியல் ரீதியாக முதிர்ச்சியடைந்த A. gambiae இன் ஆண் துணை சுரப்பியில் (MAG) ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களின் தொகுப்பைத் தீர்மானிக்க, சாத்தியமான மாற்றியமைக்கும் ஸ்டீராய்டுகளைத் தேடத் தொடங்கினோம். முன்னர் பயன்படுத்தப்பட்ட குறைவான குறிப்பிட்ட முறையை விட, உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ குரோமடோகிராஃபியுடன் இணைந்து டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (HPLC-MS/MS) ஐப் பயன்படுத்தி, இந்த திசுக்களில் எக்டிசோன் (E) மற்றும் 20E ஐக் கண்டறிந்தோம், இது முந்தைய முடிவை உறுதிப்படுத்தியது. இருப்பினும், மாதிரி 3-dehydro-20E-22-பாஸ்பேட் (3D20E22P)12 சூத்திரத்துடன் ஒத்துப்போகும் ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட பாஸ்போரிலேட்டட் ஸ்டீராய்டுகளால் ஆதிக்கம் செலுத்தியது (படம் 1). மற்ற வடிவங்களில் 3-dehydro-20E (3D20E) மற்றும் 20E-22-பாஸ்பேட் (20E22P) ஆகியவை அடங்கும். 3D20E22P இன் HPLC-MS/MS சமிக்ஞை தீவிரம் அதன் டிபாஸ்போரிலேட்டட் வடிவமான 3D20E ஐ விட இரண்டு அளவு அதிகமாகவும், E மற்றும் 20E ஐ விட மூன்று அளவு அதிகமாகவும் இருந்தது (படம் 1).உடலின் மற்ற பகுதிகளிலும் கீழ் இனப்பெருக்கப் பாதையிலும் இருந்தாலும் (LRT; நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு படம் 1a).புதிதாக மூடப்பட்ட (<1 நாள் வயதுடைய) ஆண்களிலும் பெண்களிலும் எக்டிஸ்டீராய்டுகளை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம், மேலும் MAG இல் மட்டும் 3D20E மற்றும் 3D20E22P ஆகியவற்றைக் கண்டறிந்தோம்; E, 20E மற்றும் 20E22P இரு பாலினத்திலும் இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1b).இந்தத் தரவுகள் A. gambiae வயது வந்த ஆண்கள் தங்கள் MAG களில் பெண்களால் ஒருங்கிணைக்கப்படாத மாற்றியமைக்கும் ஹார்மோன்களின் உயர் டைட்டர்களை உருவாக்குகின்றன என்பதைக் குறிக்கின்றன.
MAG மற்றும் பெண் LRT (ஏட்ரியா, விந்து வெசிகல்ஸ் மற்றும் பரோவேரியம் உட்பட) 4 நாள் (4 நாள்) கன்னி ஆண்களிடமிருந்தும், கன்னி மற்றும் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்களிடமிருந்தும் (0.5, 3, மற்றும் 12 hpm) பிரிக்கப்பட்டன. இந்த திசுக்களில் உள்ள எக்டிசோன் HPLC-MS/MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (சராசரி ± sem; இணைக்கப்படாத t-சோதனை, இரு பக்க, தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதம் (FDR) சரி செய்யப்பட்டது; NS, குறிப்பிடத்தக்கதாக இல்லை; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.035; 12 மணிநேரம் vs. 3 மணிநேரம், P = 0.0015; 12 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.030. 3D20E22P: 3 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.25; 12 மணிநேரம் vs. 3 மணிநேரம், P = 0.0032; 12 மணிநேரம் vs. 0.5 மணிநேரம், P = 0.015). தரவு மூன்று உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து பெறப்பட்டது. ஆர்வமுள்ள ஒவ்வொரு எக்டிசோனுக்கும் உச்சப் பகுதி கொசுக்களின் எண்ணிக்கையால் கணக்கிடப்பட்டு இயல்பாக்கப்பட்டது. எக்டிசோன் பின்வருமாறு நிறத்தால் குறிப்பிடப்படுகிறது: E, பச்சை; 20E, ஆரஞ்சு; 20E22P, ஊதா; 3D20E, நீலம்; 3D20E22P, இளஞ்சிவப்பு. குறைந்த எக்டிசோன் அளவைக் காட்ட y- அச்சில் உள்ள செருகல் அளவை அதிகரிக்கிறது.
இனச்சேர்க்கையின் போது 3D20E22P மற்றும் 3D20E ஆகியவை மாற்றப்படுகின்றனவா என்பதை ஆராய, இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு பல்வேறு நேரப் புள்ளிகளில் பெண் LRTகளைப் பிரித்தோம். கன்னிப் பெண்களில் எக்டிசோன் காணப்படவில்லை என்றாலும், இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு உடனடியாக LRT இல் கணிசமான அளவு 3D20E22P இருப்பதைக் கண்டோம் (0.5 மணிநேரம் இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு, hpm), காலப்போக்கில் குறைகிறது, அதே நேரத்தில் 3D20E அளவுகள் கணிசமாக அதிகரித்தன (படம் 1). வேதியியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட 3D20E ஐ ஒரு தரநிலையாகப் பயன்படுத்தி, இனச்சேர்க்கை LRT களில் இந்த ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனின் அளவுகள் 20E ஐ விட குறைந்தது 100 மடங்கு அதிகமாக இருப்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 1). எனவே, இனச்சேர்க்கையின் போது பெண் LRT க்கு மாற்றப்படும் முக்கிய ஆண் எக்டிசோன் 3D20E22P ஆகும், மேலும் அதன் டிபாஸ்போரிலேட்டட் வடிவமான 3D20E, இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு விரைவில் மிகவும் அதிகமாகிறது. பெண் இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு உயிரியலில் பிந்தைய எக்டிசோனுக்கு இது ஒரு முக்கிய பங்கைக் குறிக்கிறது.
ஒரு புதிய RNA வரிசைமுறை (RNA-seq) தரவுத்தொகுப்பை (படம் 2a) உருவாக்கிய பிறகு, தனிப்பயன்-கட்டமைக்கப்பட்ட பயோஇன்ஃபர்மேடிக்ஸ் பைப்லைனைப் பயன்படுத்தி, எக்டிசோன் கைனேஸ் (EcK), எக்டிசோன் ஆக்சிடேஸ் (EO) மற்றும் எக்டிசோன் குறியாக்கம் 20E-மாற்றியமைக்கப்பட்ட பாஸ்பேடேஸ் மரபணுவைத் தேடினோம். EPP) இனப்பெருக்க திசுக்களில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. ஒரு வேட்பாளர் EPP மரபணுவையும் இரண்டு சாத்தியமான EcK மரபணுக்களையும் (EcK1 மற்றும் EcK2) அடையாளம் கண்டோம், ஆனால் ஒரு நல்ல வேட்பாளர் EO மரபணுவைக் கண்டுபிடிக்க முடியவில்லை. குறிப்பாக, தனிப்பட்ட EPP மரபணுக்கள் காம்பியன் MAG களில் அதிக அளவில் (98.9 வது சதவீதம்) வெளிப்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் பெண் LRT களில் அல்ல (படம் 2b), இந்த பெண் திசுக்களில் 3D20E22P இன் டிபாஸ்போரிலேஷன் ஏற்பட்டதால், எங்கள் எதிர்பார்ப்புகளுக்கு மாறாக. எனவே, இனச்சேர்க்கையின் போது ஆண் EPP மாற்றப்படலாம் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். உண்மையில், இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு பெண் புரதத்தை மறைக்க இன் விவோ நிலையான ஐசோடோப்பு லேபிளிங்கைப் பயன்படுத்தினோம், இது பெண் ஏட்ரியத்தில் MS ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட ஒரு நொதியாகும் (படம் 2c மற்றும் துணை அட்டவணை 1). MAG மற்றும் இனச்சேர்க்கை (ஆனால் கன்னி அல்ல) பெண் LRT இல் EPP இருப்பது குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம் 2d).
a, EcKகள், EOகள் மற்றும் EPPகளை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்களுக்காக ஒவ்வொரு பாலினத்தின் இனப்பெருக்க திசுக்களையும் தேடுவதற்கான தனிப்பயன்-கட்டமைக்கப்பட்ட உயிரித் தகவலியல் குழாய். அம்புக்குறிகளுக்கு அடுத்துள்ள எண்கள் ஒவ்வொரு படியிலும் ஆண் மற்றும் பெண் வேட்பாளர்களின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கின்றன. இந்த பகுப்பாய்வு ஆண்களில் வெளிப்படுத்தப்படும் ஒரு EPP மரபணு (EPP) மற்றும் ஒரு EcK மரபணு (EcK1) மற்றும் இரு பாலினங்களிலும் வெளிப்படுத்தப்படும் ஒரு EcK மரபணு (EcK2) ஆகியவற்றை அடையாளம் கண்டுள்ளது, ஆனால் ஒரு வேட்பாளர் EO மரபணுவை வழங்காது.b, கன்னி (V) மற்றும் இனச்சேர்க்கை (M) அனோபிலிஸ் காம்பியா மற்றும் அனோபிலிஸ் அல்பிகான்ஸ் திசுக்களில் வேட்பாளர் மரபணு வெளிப்பாட்டை ஒப்பிடும் வெப்ப வரைபடம்.Spca, கருத்தரித்தல்; MAGகள், ஆண்களில் துணை சுரப்பிகள்; உடலின் பிற பாகங்கள், மார்பகங்கள், இறக்கைகள், கால்கள், கொழுப்பு உடல்கள் மற்றும் இரு பாலினத்திலும் உள்ள உள் உறுப்புகள் மற்றும் பெண்களில் கருப்பைகள் உட்பட. காம்பியாவின் MAG மற்றும் ஏட்ரியா இரண்டிலும் EcK2 அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, அதேசமயம் EPP MAG.c இல் மட்டுமே காணப்படுகிறது, 3, 12 மற்றும் 24 hpm இல் ஆண் விந்து வெளியேறும் குழு பெண் ஏட்ரியாவிற்கு இடமாற்றம் செய்வதற்கான புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு, 67 மிக அதிகமான புரதங்களைக் காட்டுகிறது. அனைத்து புரதங்களையும் லேபிளிட (மற்றும் மறைக்க) 15N கொண்ட உணவில் பெண்கள் வளர்க்கப்பட்டனர். டேக் செய்யப்படாத ஆண்கள் டேக் செய்யப்பட்ட பெண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்டனர், மேலும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விற்காக பெண் LRTகள் 3, 12 மற்றும் 24 hpm இல் துண்டிக்கப்பட்டன (விந்து வெளியேறும் புரதங்களின் முழுமையான பட்டியலுக்கு துணை அட்டவணை 1 ஐப் பார்க்கவும்). இந்த திசுக்களின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு மூலம் கன்னி ஆண்களின் MAG இல் செருகல், EPP, Eck1 மற்றும் EcK2 கண்டறியப்பட்டன.d, EPP இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்களின் MAG மற்றும் LRT இல் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட் மூலம் கண்டறியப்பட்டது, ஆனால் கன்னி பெண்கள் அல்லது ஆண்கள் அல்லது மீதமுள்ள பெண்களில் அல்ல. உடல். சவ்வுகள் ஒரே நேரத்தில் ஆன்டி-ஆக்டின் (ஏற்றுதல் கட்டுப்பாடு) மற்றும் ஆன்டி-ஈபிபி ஆன்டிபாடிகள் மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. அனைத்து ஆண்களும் கன்னிப் பெண்கள். ஜெல் மூல தரவுகளுக்கு துணை படம் 1 ஐப் பார்க்கவும். மேற்கத்திய பிளட்கள் இரண்டு முறை செய்யப்பட்டு இதே போன்ற முடிவுகள் கிடைத்தன.
MAG இலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட 3D20E22P உடன் HPLC-MS/MS மூலம் EPP இன் எக்டிஸ்டீராய்டு பாஸ்போபாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாடு சரிபார்க்கப்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2a). மேலும், RNA-மத்தியஸ்த குறுக்கீடு (RNAi) மூலம் EPP ஐ அமைதிப்படுத்தியபோது, ​​இந்த ஆண்களின் இனப்பெருக்க திசுக்களில் பாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாட்டில் வலுவான குறைப்பைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3a), மேலும் EPP-அமைதிப்படுத்தப்பட்ட ஆண்களுடன் இணைந்த பெண்கள் பகுதி மரபணு அமைதிப்படுத்தல் இருந்தபோதிலும் டிபாஸ்போரிலேட்டட் 3D20E இன் குறைந்த விகிதத்தைக் காட்டினர் (படம் 3b). இதற்கு நேர்மாறாக, அதே கொசுக்களில் 20E22P/20E விகிதத்தில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை நாங்கள் கண்டறியவில்லை, இது நொதி 3D20E22P க்கு குறிப்பிட்டது என்பதைக் குறிக்கலாம் (படம் 3b).
a, இரட்டை இழைகள் கொண்ட EPP RNA (dsEPP) அல்லது இரட்டை இழைகள் கொண்ட GFP RNA (dsGFP) கட்டுப்பாடுகளைப் பயன்படுத்தி EPP அமைதிப்படுத்துவதால் MAG இல் பாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாடு குறைந்தது. ஒவ்வொரு பிரதியிலும் இருபது MAG குளங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன (P = 0.0046, ஜோடி t-சோதனை, இரண்டு-பக்க), தனித்தனி புள்ளிகளால் குறிப்பிடப்படுகின்றன.b, EPP- அமைதிப்படுத்தப்பட்ட ஆண்களுடன் இணைந்த பெண்கள் 3 hpm இல் டிபாஸ்போரிலேட்டட் 3D20E இன் விகிதத்தைக் கணிசமாகக் குறைவாகக் கொண்டிருந்தனர் (P = 0.0043, இணைக்கப்படாத t-சோதனை, இரண்டு-பக்க), அதேசமயம் 20E அளவுகள் பாதிக்கப்படவில்லை (P = 0.063, இணைக்கப்படாதது). t-சோதனை, இருபக்க). 13, 16 மற்றும் 19 பெண்களைக் கொண்ட மூன்று குளங்களிலிருந்து தரவு சராசரி ± sem ஆக வழங்கப்படுகிறது. c, EPP-அமைதிப்படுத்தப்பட்ட ஆண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்கள் மீண்டும் இனச்சேர்க்கை செய்யும் விகிதங்களை கணிசமாகக் கொண்டிருந்தனர் (P = 0.0002, ஃபிஷரின் சரியான சோதனை, இருபக்க). பெண்கள் தங்கள் இனச்சேர்க்கை நிலையை உறுதி செய்வதற்காக முதலில் இனச்சேர்க்கைக்கு கட்டாயப்படுத்தப்பட்டனர்; 2 நாட்களுக்குப் பிறகு, டிரான்ஸ்ஜெனிக் விந்தணுக்களைக் கொண்ட பிற ஆண்களுடன் அவர்கள் தொடர்பு கொள்ளப்பட்டனர், டிரான்ஸ்ஜீனின் அளவு PCR கண்டறிதல் மூலம் மறு இனச்சேர்க்கை விகிதங்களை மதிப்பிடுவதற்காக. EPP-அமைதிப்படுத்தப்பட்ட ஆண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட இரத்தம் குடித்த பெண்களின் கருவுறுதல் கணிசமாகக் குறைந்துள்ளது (P < 0.0001; மான்-விட்னி சோதனை, இரு பக்க) மற்றும் முட்டையிடும் விகிதம் சற்றுக் குறைந்துள்ளது (P = 0.088, மான்-விட்னி சோதனை, இரு பக்க), அதே நேரத்தில் முட்டையிடும் விகிதம் பாதிக்கப்படவில்லை (P = 0.94, ஃபிஷரின் சரியான சோதனை, இரு பக்க). அனைத்து பேனல்களிலும், n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுயாதீனமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது.NS, குறிப்பிடத்தக்கதாக இல்லை.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
அடுத்து, பெண்களில் இனச்சேர்க்கை எதிர்ப்பைத் தூண்டுவதற்கு எக்டிசோன் டிபாஸ்போரிலேஷன் முக்கியமா என்பதை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். குறிப்பாக, கூடுதல் (டிரான்ஸ்ஜெனிக்) ஆண்களுக்கு வெளிப்படும் போது (படம் 3c) கட்டுப்பாட்டு பெண்களை விட (10.4%) அதிக அதிர்வெண்ணில் (44.9%) மீண்டும் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட EPP-குறைக்கப்பட்ட ஆண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்கள். கருவுறுதலில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு (படம் 3d, இடது) மற்றும் இந்த பெண்களால் இடப்பட்ட முட்டைகளின் எண்ணிக்கையில் சிறிது குறைவு (படம் 3d, நடு) இருப்பதையும் நாங்கள் கவனித்தோம், அதே நேரத்தில் பெண்களால் இடப்பட்ட முட்டைகளின் சதவீதம் (இனச்சேர்க்கை மூலம் பெண்களில் வெளிப்படும் மற்றொரு பதில்)) பாதிக்கப்படவில்லை (படம் 3d, வலது). 3D20E22P க்கான EPP இன் கவனிக்கப்பட்ட தனித்தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு, இனச்சேர்க்கையின் போது மாற்றப்பட்ட EPP ஆல் 3D20E ஐ செயல்படுத்துவது பெண்களின் மேலும் இனச்சேர்க்கைக்கு ஏற்புத்திறனை முடக்குவதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்று இந்த முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன, இது முன்னர் 20E இன் பாலியல் பரிமாற்றத்திற்குக் கூறப்பட்ட நடத்தை. எனவே, இந்த ஆண்-குறிப்பிட்ட ஹார்மோன் பெண் கருவுறுதலையும் கடுமையாக பாதிக்கிறது.
அடுத்து, வேதியியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட 3D20E (படம் 4a–c) மற்றும் வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கும் 20E ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பாலியல் முதிர்ச்சியடைந்த கன்னிப் பெண்களில் ஊசி பரிசோதனைகளில் 20E மற்றும் 3D20E இன் செயல்பாடுகளை ஒப்பிட்டுப் பார்த்தோம். இரண்டு செறிவுகளிலும் (படம் 4d) இனச்சேர்க்கைக்கான பெண் உணர்திறனை நிறுத்துவதில் 3D20E 20E ஐ விட கணிசமாக மிகவும் பயனுள்ளதாக இருப்பதைக் கண்டோம். குறிப்பிடத்தக்க வகையில், LRT இல் 3D20E இன் உடலியல் மட்டத்தில் பாதி (ஊசிக்குப் பிறகு 1,066 pg vs. இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு 2,022 pg) அதிக செறிவுள்ள ஊசி போட்ட 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு 20E (ஊசிக்குப் பிறகு 361 pg) உடலியல் அளவை விட 20 மடங்கு அதிகமாக இருந்த பயனற்ற பெண்களின் விகிதத்தைத் தூண்டியது; நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 1).இந்த முடிவு 20E இன் பாலியல் பரிமாற்றம் இனச்சேர்க்கை பயனற்ற காலங்களை ஏற்படுத்தாது என்ற கருத்துடன் ஒத்துப்போகிறது, மேலும் பெற்றோர்-குழந்தை உறவை உறுதி செய்வதில் 3D20E ஒரு முக்கிய காரணியாக இருப்பதை மேலும் சுட்டிக்காட்டுகிறது. கன்னிப் பெண்களில் முட்டையிடும் மதிப்பீடுகளில் 3D20E 20E ஐ விட கணிசமாக அதிக செயலில் இருந்தது (படம் 4e), பகுதி EPP அமைதிக்குப் பிறகு நாம் கவனித்த சாதாரண முட்டையிடும் விகிதம் இனச்சேர்க்கையால் தூண்டப்பட்ட பெண் காரணிகளால் இன்னும் உற்பத்தி செய்யப்படும் எஞ்சிய 3D20E செயல்பாட்டின் இருப்பு காரணமாக இருந்தது என்பதைக் குறிக்கிறது.
(a,b) 20E இலிருந்து வேதியியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட 3D20E (a) மிக உயர்ந்த மாற்றம்/செயல்திறனுடன் (மூன்று சுயாதீன தொகுப்பு எதிர்வினைகளிலிருந்து சராசரி ± sem ஆக வழங்கப்பட்ட தரவு) (b).c, நிறை நிறமாலை (கீழ் பாதி) இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண் LRT (மேல் பாதி) இல் காணப்படும் எக்டிசோனுடன் சரியாக பொருந்துகிறது.d, 20E உடன் ஒப்பிடும்போது (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ஃபிஷரின் சரியான சோதனை, இரு பக்க) மற்றும் 10% எத்தனால் (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ஃபிஷரின் சரியான சோதனை, 2-பக்க), அதே நேரத்தில் 20E அதிக அளவுகளில் மட்டுமே கட்டுப்பாட்டை விட கணிசமாக அதிகமாக இருந்தது (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, 2-பக்க).e, 3D20E ஊசி 10% எத்தனால் கட்டுப்பாடுகளை விட கன்னிப் பெண்களில் கணிசமாக அதிக முட்டையிடும் விகிதங்களைத் தூண்டியது (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க), அதே நேரத்தில் 20E கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது அதிக அளவுகளில் மட்டுமே (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க).3D20E அதிக அளவுகளில் 20E ஐ விட கணிசமாக அதிக முட்டையிடும் விகிதங்களைத் தூண்டியது (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, இருபக்க).அனைத்து பேனல்களிலும், n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுயாதீனமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது.NS, இல்லை குறிப்பிடத்தக்கது.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. தரவு மூன்று பிரதிகளிலிருந்து பெறப்பட்டது.
முந்தைய ஆய்வுகளில், ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன்களின் பாலியல் பரிமாற்றம் MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது என்று நாங்கள் தீர்மானித்தோம், இது A. gambiae பெண்களை P. falciparum தொற்றிலிருந்து பாதுகாக்கும் ஒரு பெண் இனப்பெருக்க மரபணு ஆகும், இது மிகவும் கொடிய மனித மலேரியா ஒட்டுண்ணியான 13 ஆல் ஏற்படும் சுகாதார செலவுகள். மலேரியா-உள்ளூர் பகுதிகளில் அனோபிலிஸின் இனப்பெருக்கத் திறனுக்கு MISO இன் முக்கியத்துவத்தைக் கருத்தில் கொண்டு, எந்த ஹார்மோன் 3D20E அல்லது 20E இந்த மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் தீர்மானிக்க முடிவு செய்தோம். 20E ஊசி குறிப்பாக அல்லது அதிக சக்தியுடன் HR3 மற்றும் HR4 போன்ற சில அணுக்கரு ஹார்மோன் ஏற்பிகளை (HR) தூண்டுகிறது, மேலும் Yolkogenic மரபணுக்கள் Vg14, 15, 16 போன்ற வழக்கமான கீழ்நிலை ஸ்டீராய்டு இலக்குகளைத் தூண்டினாலும், MISO 3D20E ஆல் மிகவும் வலுவாக தூண்டப்பட்டது என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 3). எனவே, இந்த ஆண்ட்ரோஜெனிக் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோனின் பாலியல் பரிமாற்றம் ஒட்டுண்ணி தொற்று காரணமாக ஏற்படும் செலவுகளிலிருந்து பெண்களைப் பாதுகாக்கும் வழிமுறைகளைத் தூண்டுவதாகத் தெரிகிறது. மேலும், 3D20E, E ஏற்பி EcR இன் இரு ஐசோஃபார்ம்களையும் வேறுபடுத்தி பாதிக்கிறது, EcR-A ஐத் தூண்டுகிறது மற்றும் EcR-B ஐ அடக்குகிறது, மேலும் பெண் கருவுறுதலைப் பாதிக்கும் HPX15 உட்பட பிற இனச்சேர்க்கையைத் தூண்டும் மரபணுக்களை மிகவும் வலுவாகத் தூண்டுகிறது. இது EPP-அமைதியான ஆண்களுடன் இணைந்த பெண்களில் காணப்படும் குறிப்பிடத்தக்க மலட்டுத்தன்மையை விளக்கக்கூடும் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 3). பாலின-குறிப்பிட்ட செயல்பாட்டிற்குக் கீழ்நோக்கிச் செயல்படுத்தப்படும் இரண்டு எக்டிசோன் ஹார்மோன்களால் முன்னுரிமையாக செயல்படுத்தப்படும் கீழ்நோக்கிய பாதைகளின் இருப்பை இந்தத் தரவுகள் பரிந்துரைக்கின்றன.
அடுத்து, எங்கள் உயிர் தகவலியல் குழாயில் அடையாளம் காணப்பட்ட இரண்டு EcK மரபணுக்களின் செயல்பாட்டை நாங்கள் சோதித்தோம். EcK1 அல்லது EcK2 ஐ அமைதிப்படுத்துவது ஆண்களில் குறிப்பிடத்தக்க இறப்புக்கு வழிவகுத்தது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 4a), எக்டிசோன் பாஸ்போரிலேஷன் மற்றும் இதனால் செயலிழப்பு உயிர்வாழ்வதற்கு முக்கியமானது என்பதைக் குறிக்கிறது. EcK2 EcK1 ஐ விட அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டதாலும், புரோட்டியோமிக்ஸ் மூலம் MAG களில் கண்டறியப்பட்டதாலும் (படம் 2b,c மற்றும் துணை அட்டவணை 2), அதை 20E உடன் அடைகாப்பதன் மூலம் அதன் எக்டிஸ்டீராய்டு கைனேஸ் செயல்பாட்டை நாங்கள் சரிபார்த்தோம், இதன் விளைவாக பாஸ்போரிலேஷன் 20E22P (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2) கிடைத்தது. 4b). 3D20E ஐ ஒரு அடி மூலக்கூறாகப் பயன்படுத்தும்போது, ​​பாஸ்போரிலேட்டட் தயாரிப்பு 3D20E22P (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 4c) ஐக் கண்டறிய முடியவில்லை, இது 3D20E ஐ விட 20E EcK2 இன் விருப்பமான இலக்காக இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.
எங்கள் RNA-seq பகுப்பாய்வின்படி, கன்னிப் பெண்களின் LRT-யிலும் EcK2 அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டது, அங்கு இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு அது அணைக்கப்பட்டது (படம் 2b). இந்தத் தரவை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் EcK2 வெளிப்பாடு இரத்தம் ஊட்டுவதால் பாதிக்கப்படவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5a). எங்கள் ஆரம்ப MS சோதனைகளை விரிவுபடுத்தி, 20E22P இன் உச்சம் 20E இன் உச்சத்துடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது என்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (இரத்த உணவுக்குப் பிறகு 22-26 மணி நேரம்; நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு படம் 5b). கன்னிப் பெண்களில் EcK2 ஐ அமைதிப்படுத்துவது இரத்த உணவுக்குப் பிறகு 26 மணிநேரத்தில் 20E முதல் 20E22P வரையிலான ஒப்பீட்டு விகிதத்தில் 3 மடங்கு அதிகரிப்பை ஏற்படுத்தியது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படங்கள் 2c மற்றும் 5c), இது பெண்களில் EcK2 பாஸ்போரிலேட் செய்கிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது. குறிப்பாக, EcK2-குறைக்கப்பட்ட கன்னிப் பெண்கள் முழு பாலியல் ஏற்புத்திறனைப் பராமரித்தனர் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5d,e), மேலும் 20E இன் பெண் உற்பத்தி இனச்சேர்க்கை பயனற்ற தன்மையைத் தூண்டாது என்பதைக் குறிக்கிறது. மாதவிடாய். இருப்பினும், இந்த பெண்கள் கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது முட்டையிடும் விகிதங்களை கணிசமாக அதிகரித்தனர், 30% க்கும் அதிகமான கன்னிப்பெண்கள் முட்டையிடுகிறார்கள் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5f). இரத்த ஊட்டத்திற்குப் பிறகு இரட்டை இழைகள் கொண்ட Eck2 RNA (dsEcK2) ஊசிகள் செய்யப்பட்டால், முட்டையிடுதல் ஏற்படவில்லை, அந்த நேரத்தில் இரத்த உட்கொள்ளல் காரணமாக 20E உச்சநிலை குறைந்துவிட்டது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் இரத்தத்தை உறிஞ்சிய பிறகு உற்பத்தி செய்யப்படும் 20E முட்டையிடுதலைத் தூண்டும் ஒரு மாதிரியை ஆதரிக்கின்றன, ஆனால் முட்டையிடும் தொகுதி (EcK2 மற்றும் பிற காரணிகள்) இனச்சேர்க்கை மூலம் அணைக்கப்படும் போது மட்டுமே. 20E அல்லது 3D20E ஊசிகள் கன்னிப் பெண்களில் EcK2 வெளிப்பாட்டைத் தடுக்கவில்லை (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5g), மற்ற காரணிகள் இந்த கைனேஸின் தடுப்பை மத்தியஸ்தம் செய்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், இரத்த ஊட்டத்திற்குப் பிறகு 20E அளவுகள் இனச்சேர்க்கை அசௌகரியத்தைத் தூண்ட போதுமானதாக இல்லை, ஆனால் பாலியல் ரீதியாக மாற்றப்பட்ட 3D20E இன் உயர் டைட்டர்களால் திறம்பட தூண்டப்பட்டன.
எங்கள் முடிவுகள் A. gambiae இன் இனப்பெருக்க வெற்றியை ஒழுங்குபடுத்தும் வழிமுறைகள் பற்றிய முக்கியமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன. ஆண்களுக்கு ஏற்றவாறு மாற்றியமைக்கப்பட்ட 3D20E இன் உயர் டைட்டர்களை ஒருங்கிணைக்க ஆண்கள் பரிணமித்த ஒரு மாதிரி உருவாகியுள்ளது, இது பெண்களை மேலும் இனச்சேர்க்கைக்கு உணர்திறன் நீக்குவதன் மூலம் பெற்றோரை உறுதி செய்கிறது. அதே நேரத்தில், இந்த மலேரியா திசையன்கள் ஆண்களுக்கு ஏற்ற EPP இன் பாலியல் பரிமாற்றத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக பெண்களில் 3D20E ஐ செயல்படுத்த ஒரு திறமையான அமைப்பையும் உருவாக்கியுள்ளன. எங்கள் அறிவுக்கு, இது ஆண் மற்றும் பெண் ஆதிக்கம் செலுத்தும் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் அமைப்பின் பூச்சிகளில் ஒரு தனித்துவமான மற்றும் முக்கியமான செயல்பாட்டைச் செய்வதற்கான முதல் எடுத்துக்காட்டு. ஆண்-குறிப்பிட்ட எக்டிசோன் செயல்பாடு முன்வைக்கப்பட்டுள்ளது, ஆனால் திட்டவட்டமாக நிரூபிக்கப்படவில்லை. எடுத்துக்காட்டாக, பெரும்பாலும் மறுக்கப்பட்ட கருதுகோள் 18, இந்த செயல்பாடுகள் 20E முன்னோடி E1 ஆல் செய்யப்படலாம். டிரோசோபிலாவில், மோனாண்ட்ரி சிறிய பாலின பெப்டைடுகளின் பாலியல் பரிமாற்றத்தால் தூண்டப்படுகிறது என்பது அனைவரும் அறிந்ததே19,20, அவை குறிப்பிட்ட பாலின பெப்டைடு மூலம் பெண் இனப்பெருக்க பாதையை புனரமைக்கும் நியூரான்களுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன. ஏற்பிகள்21,22. A. gambiae பெண்களில் 3D20E ஆல் கட்டுப்படுத்தப்படும் கீழ்நிலை சமிக்ஞை அடுக்குகளைத் தீர்மானிக்கவும், இந்த அடுக்குகளை கொசுக்கள் மற்றும் டிரோசோபிலாவிற்கு இடையில் பாதுகாக்க முடியுமா என்பதைத் தீர்மானிக்கவும் மேலும் பணி தேவைப்படுகிறது.
எங்கள் ஆய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட பெண் கருவுறுதல் மற்றும் நடத்தையில் 3D20E இன் முக்கிய பங்கைக் கருத்தில் கொண்டு, 3D20E தொகுப்பு மற்றும் செயல்படுத்தலுக்கு வழிவகுக்கும் பாதைகள் எதிர்கால கொசு கட்டுப்பாட்டு உத்திகளுக்கு புதிய வாய்ப்புகளை வழங்குகின்றன, அதாவது மலட்டு பூச்சி தொழில்நுட்ப உத்திகளில் போட்டி மலட்டு ஆண்களின் உருவாக்கம். காட்டு வெளியீட்டிற்கு பயன்படுத்தவும் அல்லது கன்னி விளையாட்டில் 3D20E ஐப் பின்பற்றவும். A. gambiae மற்றும் பிற செல்லியா இனங்கள் தங்கள் விந்துவை இனச்சேர்க்கை செருகிகளாக உறைய வைக்கும் திறனைப் பெற்றபோது 3D20E இன் ஆண்-குறிப்பிட்ட செயல்பாடு உருவாகியிருக்கலாம், ஏனெனில் இது அதிக எண்ணிக்கையிலான ஹார்மோன்கள் மற்றும் ஹார்மோன்-செயல்படுத்தும் நொதிகளை திறம்பட மாற்ற அனுமதிக்கிறது. இதையொட்டி, 3D20E பரிணாமத்தை செயல்படுத்துவது, அதிக மலேரியா பாதிப்பு உள்ள பகுதிகளில் பெண்கள் (MISO இன் அதிக வெளிப்பாடு மூலம்) தங்கள் இனப்பெருக்கத் தகுதியை ஆதரிக்க ஒரு வழிமுறையை வழங்குகிறது, இது மறைமுகமாக பிளாஸ்மோடியம் பரவலுக்கு பங்களிக்கிறது. பெண் அனோபிலிஸ் கொசுக்களில் P. ஃபால்சிபாரத்தின் உயிர்வாழ்வு மற்றும் வளர்ச்சியில் பெண் 20E ஆழமான விளைவுகளைக் கொண்டிருப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது, 24 ஆண் மற்றும் பெண் ஸ்டீராய்டு ஹார்மோன் பாதைகள் இரண்டும் இப்போது கொசு-ஒட்டுண்ணி தொடர்புகளின் முக்கிய அம்சங்களாகும்.
A. gambiae G3 இனங்கள் நிலையான பூச்சி நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்டன (26-28 °C, 65-80% ஈரப்பதம், 12:12 மணிநேர ஒளி/இருண்ட ஒளிக்காலம்). லார்வாக்களுக்கு தூள் மீன் உணவு (டெட்ராமின் டிராபிகல் ஃப்ளேக்ஸ், கோய் துகள்கள் மற்றும் டெட்ரா பாண்ட் ஸ்டிக்ஸ் 7:7:2 என்ற விகிதத்தில்) வழங்கப்பட்டது. வயது வந்த கொசுக்களுக்கு 10% டெக்ஸ்ட்ரோஸ் கரைசல் மற்றும் வாராந்திர மனித இரத்தம் வழங்கப்பட்டது (இரத்த கூறுகளை ஆய்வு செய்யவும்). நுண்ணோக்கி மூலம் முனைகளை ஆய்வு செய்த பிறகு, கூட்டுப்புழு நிலையில் பாலினங்களைப் பிரிப்பதன் மூலம் கன்னி கொசுக்கள் பெறப்பட்டன. DsRed டிரான்ஸ்ஜீனைச் சுமக்கும் ஆண் கொசுக்கள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட நெறிமுறைகளின்படி கட்டாய இனச்சேர்க்கை பரிசோதனைகள் செய்யப்பட்டன. இயற்கையான இனச்சேர்க்கைக்கு, 4 நாள் கன்னிப் பெண்கள் 1:3 விகிதத்தில் பாலியல் முதிர்ச்சியடைந்த கன்னி ஆண்களுடன் இரண்டு இரவுகள் வைக்கப்பட்டனர். ஆண்களுக்கு dsEPP ஊசி போடப்பட்ட பரிசோதனைகளுக்கு, பாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாடு அதிகபட்சமாக அமைதியாக இருந்தபோது, ​​ஊசிக்குப் பிறகு 3-4 நாட்களில் இணை-கூண்டு வைக்கப்பட்டது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2b).
கொசு திசுக்கள், மீதமுள்ள சடலங்கள் (உடலின் மீதமுள்ள பகுதி) அல்லது முழு உடலும் 100% மெத்தனாலாகப் பிரிக்கப்பட்டு ஒரு பீடரால் (2 மிமீ கண்ணாடி மணிகள், 2,400 rpm, 90 வினாடி) ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டன. திசுக்களின் அளவுகள் மற்றும் மெத்தனால் அளவுகள் பின்வருமாறு: உடலின் மீதமுள்ள பகுதி, 1,000 µl இல் 50; MAG, 50–100 80 µl; பெண் LRT, 25–50 80 µl. வீழ்படிவு அதே அளவு மெத்தனாலுடன் இரண்டாவது மெத்தனால் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. செல் குப்பைகள் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. இரண்டு பிரித்தெடுத்தல்களிலிருந்தும் மெத்தனால் இணைக்கப்பட்டு நைட்ரஜன் ஓட்டத்தின் கீழ் உலர்த்தப்பட்டது, பின்னர் தண்ணீரில் 80% மெத்தனால் பின்வரும் அளவுகளில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது: உடலின் மீதமுள்ள பகுதி, 50 µl; MAGகள் மற்றும் பெண் LRT, 30 µl.
மாதிரிகள் ஒரு LC கருவியுடன் (Vanquish, Thermo Fisher) இணைக்கப்பட்ட ஒரு மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (ID-X, Thermo Fisher) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. 25 °C இல் பராமரிக்கப்படும் 3 µm, 100 × 4.6 மிமீ நெடுவரிசையில் (Inspire C8, Dikma) 5 µl மாதிரி செலுத்தப்பட்டது. LC க்கான மொபைல் கட்டங்கள் A (நீர், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் B (அசிட்டோனிட்ரைல், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம்) ஆகும். LC சாய்வு பின்வருமாறு: 1 நிமிடத்திற்கு 5% B, பின்னர் 11 நிமிடங்களுக்கு 100% B ஆக அதிகரித்தது. 100% இல் 8 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, 4 நிமிடங்களுக்கு 5% B இல் நெடுவரிசையை மீண்டும் சமப்படுத்தவும். ஓட்ட விகிதம் 0.3 மில்லி நிமிடம்-1. MS மூலத்தில் அயனியாக்கம் நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறை முறைகளில் சூடான எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மூலம் நிறைவேற்றப்படுகிறது.
நிறை நிறமாலை அளவி, முழு MS பயன்முறையில் 60,000 தெளிவுத்திறனில் 350 முதல் 680 வரையிலான m/z வரம்பில் தரவை அளவிடுகிறது. [M + H]+ (அனைத்து இலக்குகள்), [M - H2O + H]+ (அனைத்து இலக்குகள்) மற்றும் [M - H]- (பாஸ்போரிலேட்டட் இலக்குகள்) ஆகியவற்றில் MS/MS தரவு பெறப்பட்டது. எந்த தரநிலையும் கிடைக்காத இலக்குகளின் எக்டிசோன் பண்புகளை உறுதிப்படுத்த MS/MS தரவு பயன்படுத்தப்பட்டது. இலக்கு வைக்கப்படாத எக்டிஸ்டீராய்டுகளை அடையாளம் காண, >15% ஒப்பீட்டு மிகுதியுடன் கூடிய அனைத்து HPLC சிகரங்களுக்கான MS/MS தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. தூய தரநிலைகளிலிருந்து (20E, 3D20E) உருவாக்கப்பட்ட நிலையான வளைவுகளைப் பயன்படுத்தி அளவீடு செய்து, ஒரு குறிப்பிட்ட மாதிரியின் (மற்ற அனைத்து இலக்குகள்) முழுமையான அளவுகள் அல்லது நீர்த்தங்களைக் கணக்கிட, ஒரு ஆணில் காணப்படும் அளவுகளுக்கு அவற்றின் சமமானதைக் கணக்கிடுங்கள். 3D20E க்கு, பின்வரும் கூட்டுத்தொகைகளைப் பயன்படுத்தி அளவீடு செய்யப்பட்டது: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.டிரேஸ்ஃபைண்டர் (பதிப்பு 4.1) ஐப் பயன்படுத்தி தரவு பிரித்தெடுக்கப்பட்டு அளவிடப்பட்டது.MS/MS தரவு Xcalibur (பதிப்பு 4.4) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.E, 20E மற்றும் 3D20E இன் MS நிறமாலை அந்தந்த தரநிலைகளுடன் ஒப்பிடப்பட்டது.3D20E22P ஜிரார்டின் வினையாக்கியுடன் வழித்தோன்றல் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.20E22P m/z விகிதத்தால் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
3D20E22P MAG இலிருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்டது. HPLC-MS/MS பகுப்பாய்வின் அதே LC நிலைமைகளின் கீழ், குவாட்ரூபோல் நிறை அடிப்படையிலான கண்டறிதல் (QDa, அக்விட்டி, வாட்டர்ஸ்) கொண்ட அல்ட்ரா-செயல்திறன் திரவ குரோமடோகிராஃப் (அக்விட்டி, வாட்டர்ஸ்) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு அளவில் சுத்திகரிப்பு செய்யப்பட்டது. முன்னர் தீர்மானிக்கப்பட்ட அதே தக்கவைப்பு நேரத்தில் 3D20E22P உடன் தொடர்புடைய m/z கண்டறியப்பட்டபோது பின்ன சேகரிப்பு தூண்டப்பட்டது. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட சேர்மங்களின் தூய்மை பின்னர் மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி HPLC-MS/MS ஆல் சரிபார்க்கப்பட்டது.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களைப் பின்பற்றி, TRI ரீஜென்ட் (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தி 10-12 இனப்பெருக்க திசுக்கள் அல்லது உடலின் பிற பாகங்களிலிருந்து (தலையில்லாத) மொத்த RNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. RNA, TURBO DNase (தெர்மோ ஃபிஷர்) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களைப் பின்பற்றி, மோலோனி முரைன் லுகேமியா வைரஸ் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் (M-MLV RT; தெர்மோ ஃபிஷர்) ஐப் பயன்படுத்தி cDNA ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அளவு PCR (RT-qPCR; நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2) க்கான ப்ரைமர்கள் முன்பு வெளியிடப்பட்டன24 அல்லது ப்ரைமர்-BLAST26 ஐப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டன, 70-150 bp அளவு மற்றும் பரந்த எக்ஸான்-எக்ஸான் சந்திப்புகள் அல்லது ப்ரைமர் ஜோடி ப்ரைமர்கள் தனித்தனி எக்ஸான்களின் தயாரிப்புகளுக்கு முன்னுரிமை அளிக்கப்பட்டது. RT-qPCR க்காக மூன்று முதல் நான்கு உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து cDNA மாதிரிகள் தண்ணீரில் நான்கு மடங்கு நீர்த்தப்பட்டன. 1× PowerUp SYBR கிரீன் மாஸ்டர் மிக்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர்), ப்ரைமர்கள் மற்றும் 5 µl நீர்த்த cDNA ஆகியவற்றைக் கொண்ட 15 µl பிரதி எதிர்வினைகளில் அளவீடு செய்யப்பட்டது. எதிர்வினைகள் ஒரு QuantStudio 6 Pro நிகழ்நேர PCR அமைப்பு (தெர்மோ ஃபிஷர்) மற்றும் தரவு சேகரிக்கப்பட்டு வடிவமைப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு (பதிப்பு 2.4.3) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. இந்த ஆய்வில் நிரூபிக்கப்பட்டபடி, ரைபோசோமால் மரபணு RpL19 (AGAP004422) உடன் தொடர்புடைய அளவுகள் இயல்பாக்கப்பட்டன, அதன் வெளிப்பாடு இரத்தம் ஊட்டுதல் 27 அல்லது இனச்சேர்க்கை 3 உடன் கணிசமாக மாறவில்லை.
அஜிலன்ட் பயோஅனாலைசர் 2100 பயோஅனாலைசர் (அஜிலன்ட்) பயன்படுத்தி ஆர்.என்.ஏ தரம் சரிபார்க்கப்பட்டது. இல்லுமினா ஜோடி-இறுதி நூலகங்கள் எம்ஐடி மற்றும் ஹார்வர்டின் பிராட் இன்ஸ்டிடியூட்டில் தயாரிக்கப்பட்டு இயக்கப்பட்டன. இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் HISAT2 (பதிப்பு 2.0.5) ஐப் பயன்படுத்தி வரிசைமுறை வாசிப்புகள் A. கேம்பியா மரபணுவுடன் (PEST திரிபு, பதிப்பு 4.12) சீரமைக்கப்பட்டன. மேப்பிங் தரம் (MAPQ) மதிப்பெண்கள் <30 உடன் வாசிப்புகள் சாம்டூல்களைப் பயன்படுத்தி அகற்றப்பட்டன (பதிப்பு 1.3.1). இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் htseq-count (பதிப்பு 0.9.1) ஐப் பயன்படுத்தி மரபணுக்களுடன் மேப் செய்யப்பட்ட வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கை கணக்கிடப்பட்டது. இயல்பாக்கப்பட்ட வாசிப்பு எண்ணிக்கைகள் கணக்கிடப்பட்டு, R (பதிப்பு 4.0.3) இல் உள்ள DESeq2 தொகுப்பு (பதிப்பு 1.28.1) ஐப் பயன்படுத்தி வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
எக்டிசோன்-மாற்றியமைக்கும் மரபணு வேட்பாளர்கள் முதலில் PSI-BLAST வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) A. gambiae மரபணுவைத் தேடுவதன் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்டனர், இயல்புநிலை மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி பின்வரும் வினவல் புரத வரிசைகளுடன் அளவுருக்கள்: பாம்பிக்ஸ் மோரி (அணுகல் எண். NP_001038956.1), மஸ்கா டொமெஸ்டிகா (அணுகல் எண். XP_005182020.1, XP_005175332.1 மற்றும் XP_011294434.1) மற்றும் மைக்ரோப்ளிடிஸ் டெமோலிட்டர் (அணுகல் எண். XP_008552646.1 மற்றும் XP_008552645.1) இலிருந்து EcK பி. மோரி (அணுகல் எண். NP_001036900), ட்ரோசோபிலா மெலனோகாஸ்டர் (அணுகல் எண். NP_651202), அபிஸ் மெல்லிஃபெரா (அணுகல் எண். XP_394838) மற்றும் அசிர்தோசிஃபோன் பிசம் (அணுகல் எண். XP_001947166); மற்றும் பி. மோரி (அணுகல் எண். XP_001947166) NP_001177919.1 மற்றும் NP_001243996.1) மற்றும் டி. மெலனோகாஸ்டரின் EO (அணுகல் எண். NP_572986.1) (படி 1) இலிருந்து EPP. அடுத்து, காம்பியாவில் இனப்பெருக்க திசுக்களில் (பெண் LRT அல்லது MAG) (படி 2) அதிக mRNA வெளிப்பாட்டை (> 100 துண்டுகள்/கிலோபேஸ் எக்ஸான்கள் ஒரு மில்லியன் வரைபட வாசிப்புகள் (FPKM) அல்லது >85%) அடிப்படையாகக் கொண்டு வடிகட்டி தாக்குகிறது. தனித்தன்மையை மேம்படுத்த, இனச்சேர்க்கையின் போது எக்டிசோனை ஒருங்கிணைக்கவோ அல்லது மாற்றவோ செய்யாத அனோபிலிஸ் இனமான ஏ. அல்பிமானஸின் இனப்பெருக்க திசுக்களிலும் வெளிப்படுத்தப்படும் வேட்பாளர் நொதிகளைத் தேர்ந்தெடுத்தோம். ஏ. அல்பிமானஸ் இனப்பெருக்க திசுக்களில் (படி 3) குறைந்த வெளிப்பாடு (<100 FPKM அல்லது <85வது சதவீதம்) அடிப்படையில் வேட்பாளர் மரபணுக்கள் வடிகட்டப்பட்டன. இறுதி வடிகட்டியாக (படி 4), வேட்பாளர் மரபணுக்கள் பின்வருவனவற்றில் குறைந்தபட்சம் ஒன்றை பூர்த்தி செய்ய வேண்டும்: (1) இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டது (P < 0.05) வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களின் பகுப்பாய்வின் படி மற்றும் (2) இனப்பெருக்கம் செய்யாத திசுக்களில் (<85 % அல்லது <100 FPKM).
முழு உயிரின ஐசோடோபிக் லேபிளிங்கை அடைய, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறைகள் 28,29,30 ஐ நாங்கள் மாற்றியமைத்தோம். சுருக்கமாக, காட்டு-வகை சாக்கரோமைசஸ் செரிவிசியா வகை II (YSC2, சிக்மா) ஈஸ்ட் நைட்ரஜன் அடிப்படை (BD Difco, DF0335) இல் (wt/vol) 2% குளுக்கோஸ் (G7528, சிக்மா), 1.7% அமினோ அமிலம் இல்லாத மற்றும் அம்மோனியம் சல்பேட். வளர்ப்பு ஊடகம்) மற்றும் 5% 15N அம்மோனியம் சல்பேட் (NLM-713, >99%, கேம்பிரிட்ஜ் ஐசோடோப் ஆய்வகங்கள்) ஆகியவற்றை நைட்ரஜனின் ஒரே மூலமாகக் கொண்டு சோதிக்கப்பட்டது. ஈஸ்ட் மையவிலக்கு மூலம் மீட்கப்பட்டது மற்றும் கொசு லார்வாக்கள் கூட்டுப்புழுவாக மாறும் வரை விருப்பப்படி உணவளிக்கப்பட்டன. நான்காவது தொடக்க இறப்பைத் தடுக்க மீன் உணவுடன் (300 லார்வாக்களுக்கு 0.5 மி.கி) துணை. பின்னர் இனச்சேர்க்கையின் போது மாற்றப்பட்ட ஆண் புரோட்டியமை பகுப்பாய்வு செய்ய லேபிளிடப்படாத ஆண்களுடன் இனச்சேர்க்கை சோதனைகளில் பெண்கள் மட்டுமே பயன்படுத்தப்பட்டனர்.
4-6 நாள் வயதுடைய 15N-குறிச்சொற்கள் கொண்ட கன்னிப் பெண்கள் வயதுக்கு ஏற்ற, குறிச்சொற்கள் இல்லாத கன்னிப் பெண்களுடன் இனச்சேர்க்கை செய்ய கட்டாயப்படுத்தப்பட்டனர். எபிஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியின் கீழ் இனச்சேர்க்கை பிளக்குகளைக் கண்டறிவதன் மூலம் வெற்றிகரமான இனச்சேர்க்கை சரிபார்க்கப்பட்டது. 3, 12, மற்றும் 24 hpm இல், 45-55 இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்களின் ஏட்ரியா 50 µl அம்மோனியம் பைகார்பனேட் பஃபராக (pH 7.8) பிரிக்கப்பட்டு ஒரு பூச்சியால் ஒரே மாதிரியாக்கப்பட்டது. ஹோமோஜெனேட் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, சூப்பர்நேட்டண்ட் 50 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட்டில் 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, வாட்டர்ஸ்) உடன் கலக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு மாதிரியிலிருந்தும் சூப்பர்நேட்டண்ட் மற்றும் துகள்கள் உலர்ந்த பனியில் உறைந்து, வாஷிங்டன் பல்கலைக்கழகத்தில் உள்ள மேக்காஸ் ஆய்வகத்திற்கு ஒரே இரவில் அனுப்பப்பட்டன, அங்கு LC-MS/MS க்கான மாதிரி தயாரிப்பு முடிந்தது. 50 mM அம்மோனியத்தில் 0.1% RapiGest இன் 50 µl இல் துகள்களை மீண்டும் இணைக்கவும். நீர் குளியலில் பைகார்பனேட் மற்றும் சோனிகேட். துகள்கள் மற்றும் சூப்பர்நேட்டண்டின் புரத செறிவு BCA மதிப்பீட்டால் அளவிடப்பட்டது, மாதிரிகள் 5 mM டைதியோத்ரைட்டால் (DTT; சிக்மா) உடன் குறைக்கப்பட்டன, 15 mM அயோடோஅசெட்டமைடு (சிக்மா) உடன் அல்கைலேட் செய்யப்பட்டு 37 °C (1:0 50) இல் 1 மணி நேரம் டிரிப்சினைசேஷன்: டிரிப்சின்:அடி மூலக்கூறு விகிதம் மூலம் அடைகாக்கப்பட்டன. ரேபிஜெஸ்ட் 200 mM HCl ஐச் சேர்ப்பதன் மூலம் லைஸ் செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 37 °C இல் 45 நிமிடங்களுக்கு அடைகாத்தல் மற்றும் குப்பைகளை அகற்ற 14,000 rpm இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 4 °C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. மாதிரிகள் இரட்டை முறை திட-கட்ட பிரித்தெடுத்தல் (ஓயாசிஸ் MCX கார்ட்ரிட்ஜ்கள், வாட்டர்ஸ்) மூலம் கழுவப்பட்டு 0.33 µg µl-1 இறுதி புரத செறிவுக்காக 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டன. பெயரிடப்படாத MAG புரோட்டியோம்கள் கன்னி ஆண்களிடமிருந்து இதேபோல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. இரண்டு ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் பகுப்பாய்வு பிரதிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. அடுத்து, ஒவ்வொன்றிலும் 1 µg, 25-செ.மீ. இணைந்த சிலிக்கா 75-μm நெடுவரிசையைப் பயன்படுத்தி, 4-செ.மீ. இணைந்த சிலிக்கா காசில்1 (PQ) ஃப்ரிட் பொறியுடன் ஜூபிடர் C12 தலைகீழ்-கட்ட பிசின் (ஃபீனோமெனெக்ஸ்) மற்றும் 180-நிமிட திரவ குரோமடோகிராஃபி ஆகியவற்றால் நிரம்பிய பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. மாதிரி டைஜஸ்ட்கள் - MS/MS, நானோACQUITY UPLC சிஸ்டம் (வாட்டர்ஸ்) உடன் Q-Exactive HF மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (தெர்மோ ஃபிஷர்) இயக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு ரன்னுக்கும் உருவாக்கப்பட்ட தரவு தொடர்பான கையகப்படுத்தல் தரவு, Proteowizard (பதிப்பு 3.0.20287) ஐப் பயன்படுத்தி mzML வடிவத்திற்கு மாற்றப்பட்டது மற்றும் Anopheles gambiae (VectorBase பதிப்பு 54), Anopheles coluzzi இலிருந்து புரத வரிசைகளைக் கொண்ட FASTA தரவுத்தளத்திற்கு எதிராக Comet31 (பதிப்பு 3.2) ஐப் பயன்படுத்தி Mali-NIH (VectorBase பதிப்பு 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, மார்ச் 2021), A. gambiae RNA-seq மற்றும் அறியப்பட்ட மனித மாசுபடுத்திகளின் மூன்று-சட்ட மொழிபெயர்ப்புகளில் ஒரு தேடல் மேற்கொள்ளப்பட்டது. பெப்டைட் வரைபடத்துடன் பொருந்திய FDRகள் 0.01 வரம்பைக் கொண்ட Percolator32 (பதிப்பு 3.05) ஐப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டன, மேலும் பெப்டைடுகள் புரத பார்சிமோனியைப் பயன்படுத்தி புரத அடையாளங்களாக இணைக்கப்பட்டன. Limelight33 (பதிப்பு 2.2.0). முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் கணக்கிடப்பட்ட இயல்பாக்கப்பட்ட நிறமாலை மிகுதி காரணி (NSAF) ஐப் பயன்படுத்தி தொடர்புடைய புரத மிகுதி மதிப்பிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் தொடர்புடைய NSAF இரண்டு வெவ்வேறு உயிரியல் பிரதிகளிலிருந்து மாதிரிகளில் சராசரியாகக் கணக்கிடப்பட்டது. 15N லேபிளிங் பெண் புரோட்டியமை வெற்றிகரமாக மறைத்தது, இருப்பினும் லேபிளிடப்பட்ட கன்னிகளிடமிருந்து ஒரு சிறிய அளவு லேபிளிடப்படாத புரதத்தைக் கண்டறிய முடிந்தது. HPLC "கேரி ஓவர்" விளைவாக, ஆண்/இனச்சேர்க்கை மாதிரிகளுக்குப் பிறகு மூல மாதிரிகள் இயக்கப்பட்ட தொழில்நுட்ப ரன்களில் மட்டுமே பெண் மூல மாதிரிகளில் ஆண் புரதக் குறைப்பு (1-5 நிறமாலை) கண்டறிதலை நாங்கள் பதிவு செய்தோம். லேபிளிடப்பட்ட கன்னிகளிலிருந்து 'மாசுபடுத்திகள்' எனக் காணப்படும் அவ்வப்போது புரதங்கள் துணை அட்டவணை 1 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.
ஜென்ஸ்கிரிப்ட்டில் இரண்டு ஆன்டிஜெனிக் பெப்டைடுகள், QTTDRVAPAPDQQQ (ஐசோடைப் PA க்குள்) மற்றும் MESDGTTPSGDSEQ (ஐசோடைப் PA மற்றும் PB க்குள்). இரண்டு பெப்டைடுகளும் இணைக்கப்பட்டு, பின்னர் கேரியர் புரதம் KLH உடன் இணைக்கப்பட்டு நியூசிலாந்து முயல்களுக்குள் செலுத்தப்பட்டன. நான்காவது ஊசிக்குப் பிறகு முயல்கள் பலியிடப்பட்டன, மேலும் மொத்த IgG அஃபினிட்டி சுத்திகரிப்பு மூலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. மிகவும் EPP-குறிப்பிட்ட முயலிலிருந்து IgG மேலும் மேற்கத்திய பிளாட்டிங்கிற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
மேற்கத்திய கொசுக்களுக்கு, 4 நாள் கன்னி ஆண்களிடமிருந்தும், கன்னி அல்லது கட்டாயமாக இணைக்கப்பட்ட பெண்களிடமிருந்தும் (<10 இனச்சேர்க்கைக்குப் பிறகு) MAG (n = 10, இங்கு n என்பது உயிரியல் ரீதியாக சுயாதீனமான கொசு மாதிரிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது) மற்றும் பெண் LRT (n = 30), புரத பிரித்தெடுத்தல் இடையகம் (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% சோடியம் டீஆக்ஸிகோலேட்; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× புரோட்டீஸ் இன்ஹிபிட்டர் காக்டெய்ல் (ரோச்)) தனித்தனியாக சேர்க்கப்பட்டது. ஒரு பீடரைப் பயன்படுத்தி பிரித்தெடுத்த உடனேயே மாதிரிகள் ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டன (2 மிமீ கண்ணாடி மணிகள், 2,400 rpm, 90 வினாடி). கரையாத குப்பைகள் 20,000 கிராம் 4 °C இல் மையவிலக்கு மூலம் அகற்றப்பட்டன. பிராட்ஃபோர்டு மதிப்பீட்டால் (பயோ-ராட்) புரதங்கள் அளவிடப்பட்டன. பின்னர், 20 µg MAG புரதம், 40 µg LRT புரதம், மற்றும் 20 µg எஞ்சிய மொத்த புரதம் MOPS இடையகத்தைப் பயன்படுத்தி 10% Bis-Tris NuPAGE ஆல் இயற்கை நீக்கம் செய்யப்பட்டு பிரிக்கப்பட்டது. iBlot2 பரிமாற்ற அமைப்பு (தெர்மோ ஃபிஷர்) ஐப் பயன்படுத்தி புரதங்கள் பாலிவினைலைடின் ஃப்ளோரைடு சவ்வுகளுக்கு மாற்றப்பட்டன. சவ்வுகள் 1× PBS-T இல் இரண்டு முறை (PBS இல் 0.1% Tween-20) கழுவப்பட்டு, பின்னர் 22°C இல் 1 மணி நேரம் ஒடிஸி தடுப்பு இடையகத்தில் (Li-Cor) தடுக்கப்பட்டன. தனிப்பயன் முயல் எதிர்ப்பு EPP பாலிக்ளோனல் முதன்மை ஆன்டிபாடி (தடுப்பு இடையகத்தில் 1:700) மற்றும் எலி எதிர்ப்பு ஆக்டின் மோனோக்ளோனல் முதன்மை ஆன்டிபாடி MAC237 (Abeam; 1:4,000) மூலம் 4°C இல் ஒரே இரவில் சவ்வுகள் அசைக்கப்பட்டன. சவ்வுகள் PBS-T உடன் கழுவப்பட்டு, பின்னர் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் (கழுதை எதிர்ப்பு முயல் 800CW மற்றும் ஆடு எதிர்ப்பு எலி 680LT (Li-Cor), இரண்டும் 1:20,000) மூலம் அடைகாக்கப்பட்டன. 0.01% கொண்ட தடுப்பு இடையகத்தில். 22 °C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரத்திற்கு SDS மற்றும் 0.2% Tween -20. சவ்வுகள் PBS-T மூலம் கழுவப்பட்டு, Odyssey CLx ஸ்கேனருடன் படமாக்கப்பட்டன. படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டு இமேஜ் ஸ்டுடியோவில் (பதிப்பு 5.2) செயலாக்கப்பட்டன. EPP-RA ஐசோஃபார்முடன் (82 kDa) தொடர்புடைய ஒரு குறிப்பிட்ட பட்டை கண்டறியப்படவில்லை.
EPP இன் குறியீட்டுப் பகுதிகள் (ஹிஸ்டைடின் பாஸ்பேடேஸ் டொமைனைக் கொண்ட ஐசோஃபார்ம் AGAP002463-RB ஆக, NCBI பாதுகாக்கப்பட்ட டொமைன் தேடல் 34) மற்றும் EcK2 (AGAP002181) ஆகியவை pET-21a(+) பிளாஸ்மிடாக (நோவஜென் மில்லிபோர் சிக்மா) குளோன் செய்யப்பட்டன; விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2 இல் ப்ரைமர்கள் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. pET-21a(+)-EcK2 கட்டமைப்பின் C-முனையம் 6xHis குறிச்சொல்லுக்கு முன் எட்டு GS4 இணைப்பிகள் (இணைந்து) செருகப்பட்டன. NEBExpress செல்-இல்லாத E. coli புரத தொகுப்பு வினையைப் பயன்படுத்தி மறுசீரமைப்பு புரதங்கள் தயாரிக்கப்பட்டன (நியூ இங்கிலாந்து பயோலேப்ஸ்). NEBExpress Ni சுழல் நெடுவரிசைகளைப் பயன்படுத்தி மறுசீரமைப்பு புரதங்கள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன (நியூ இங்கிலாந்து பயோலேப்ஸ்). டைஹைட்ரோஃபோலேட் ரிடக்டேஸ் (DHFR) கட்டுப்பாட்டு புரதம் NEBExpress செல்-இல்லாத E. coli புரத தொகுப்பு கருவியிலிருந்து DNA வார்ப்புருவைப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்பட்டது. புரதங்கள் PBS இல் -20 °C இல் 3 மாதங்கள் வரை 50% கிளிசராலில் சேமிக்கப்பட்டன.
EPP மற்றும் திசு சாற்றின் பாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாடு 4-நைட்ரோபீனைல் பாஸ்பேட் (pNPP; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. வினை இடையகத்தில் 25 mM Tris, 50 mM அசிட்டிக் அமிலம், 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, மற்றும் 1 mM DTT ஆகியவை இருந்தன. வினை இடையகத்தில் திசு ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டது மற்றும் மையவிலக்கு மூலம் செல் குப்பைகள் அகற்றப்பட்டன. 2.5 mg ml-1 pNPP கொண்ட வினை இடையகத்தில் நொதி அல்லது திசு சாற்றைச் சேர்ப்பதன் மூலம் வினையைத் தொடங்கவும். வினை கலவை இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது, மேலும் pNPP இலிருந்து மாற்றப்பட்ட pNP இன் அளவு பல்வேறு நேரங்களில் 405 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் அளவிடப்பட்டது.
இன் விட்ரோ EcK செயல்பாட்டிற்கு, புரதம் 27 °C இல் 2 மணிநேரத்திற்கு 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP மற்றும் 10 mM MgCl2 ஆகியவற்றைக் கொண்ட 200 µl பஃபரில் (pH 7.5) 0.2 mg 20E அல்லது 3D20E உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. 800 µl மெத்தனால் சேர்ப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டது, பின்னர் -20 °C இல் 1 மணி நேரம் குளிர்விக்கப்பட்டது, பின்னர் 4 °C இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 20,000 கிராம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. பின்னர் சூப்பர்நேட்டண்ட் HPLC-MS/MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டு குழுவில் பயன்படுத்தப்படும் புரதங்களை வெப்ப-செயலிழக்கச் செய்ய, புரதங்கள் PBS இல் 50% கிளிசராலில் 20 நிமிடங்களுக்கு 95 °C இல் அடைகாக்கப்பட்டன.
இன் விட்ரோ EPP செயல்பாட்டிற்காக, புரதம் 27 °C இல் 3 மணி நேரம் 25 mM Tris, 50 mM அசிட்டிக் அமிலம், 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, மற்றும் 1 mM DTT ஆகியவற்றைக் கொண்ட 100 µl பஃபரில் (pH 7.5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS ஆல் சுத்திகரிக்கப்பட்ட 18 ஜோடி MAG இல் காணப்படும் அளவிற்கு சமம்) உடன் அடைக்கப்பட்டது. 400 µl மெத்தனால் சேர்ப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டு -20 °C இல் 1 மணி நேரம் குளிர்விக்கப்பட்டது, பின்னர் 20,000 கிராம் இல் 10 நிமிடங்கள் 4 °C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. சூப்பர்நேட்டண்ட் HPLC-MS/MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
கலப்பு பாலின தலையில்லாத கொசு சடலங்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட cDNA இலிருந்து EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) மற்றும் EcK2 (556 bp) க்கான PCR துண்டுகள் பெருக்கப்பட்டன. eGFP கட்டுப்பாட்டின் PCR துண்டு (495 bp) முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட pCR2.1-eGFP இலிருந்து பெருக்கப்பட்டது; PCR ப்ரைமர்கள் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. PCR துண்டு pL4440 பிளாஸ்மிட்டில் தலைகீழ் T7 ஊக்குவிப்பாளர்களுக்கு இடையில் செருகப்பட்டது. பிளாஸ்மிட் கட்டமைப்புகள் NEB 5-α திறமையான E. coli (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) இலிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்டு, பயன்படுத்துவதற்கு முன்பு DNA வரிசைமுறையால் சரிபார்க்கப்பட்டன (செருகு வரிசைக்கு துணைத் தரவு 1 ஐப் பார்க்கவும்). T7 ஊக்குவிப்பாளருடன் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2) பொருந்திய ப்ரைமர்கள் pL4440-அடிப்படையிலான பிளாஸ்மிட்டிலிருந்து செருகலைப் பெருக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன. PCR தயாரிப்பு அளவு அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. மெகாஸ்கிரிப்ட் T7 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கிட் (தெர்மோ ஃபிஷர்) ஐப் பயன்படுத்தி PCR டெம்ப்ளேட்களிலிருந்து dsRNA படியெடுக்கப்பட்டது மற்றும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட மாற்றங்களுடன் உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி சுத்திகரிக்கப்பட்டது.
dsRNA ஊசிக்கு, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 செறிவில் வயது வந்த ஆண்கள் அல்லது பெண்களின் (Nanoject III, Drummond) மார்பில் வெளியேற்றத்திற்குப் பிறகு 1 நாளுக்குள் செலுத்தப்பட்டது. RNA பிரித்தெடுத்தல், cDNA தொகுப்பு மற்றும் RT-qPCR மூலம் குறைந்தது மூன்று உயிரியல் பிரதிகளில் மரபணு நாக் டவுன் அளவுகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன. எக்டிசோன் ஊசிக்கு, 4 நாள் கன்னி அல்லது 6 நாள் கன்னி இரத்தம் குடிக்கும் பெண்களுக்கு முறையே 1.3, 2.1 செறிவுகளில் 0.13, 0.21, அல்லது 0.63 µg 20E அல்லது 3D20E (Nanoject III, Drummond) செலுத்தப்பட்டது, சோதனை வடிவமைப்பு அல்லது 6.3 ng nl-1 ஐப் பொறுத்து. 10% இல் 100 nl ஐ செலுத்தவும். (vol/vol) தண்ணீரில் எத்தனால்; 10% எத்தனாலில் 3D20E22P இன் 100 nl (ஒரு ஜோடி MAG களில் காணப்படும் அளவின் 75% க்கு சமம்). கொசுக்கள் சீரற்ற முறையில் ஊசி குழுவிற்கு ஒதுக்கப்பட்டன.
முட்டையிடும் பரிசோதனைகளுக்கு, 3 நாள் வயதுடைய பெண் கொசுக்களுக்கு மனித இரத்தத்தில் இருந்து விருப்பப்படி உணவளிக்கப்பட்டது. பகுதியளவு உணவளிக்கப்பட்ட அல்லது உணவளிக்கப்படாத கொசுக்களை அகற்றவும். சிகிச்சையைப் பொறுத்து, இரத்த உணவுக்குப் பிறகு குறைந்தது 48 மணிநேரங்களுக்கு நான்கு இரவுகளுக்கு தனித்தனி முட்டையிடும் கோப்பைகளில் பெண் கொசுக்கள் வைக்கப்பட்டன. முட்டைகள் ஸ்டீரியோஸ்கோப்பின் கீழ் எண்ணப்பட்டன (ஸ்டெமி 508, ஜெய்ஸ்); இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண் கொசுக்களுக்கு, லார்வாக்களாக குஞ்சு பொரித்த முட்டைகள் வளமானதாகக் கருதப்பட்டன.
இனச்சேர்க்கை சோதனைகளுக்கு, இனச்சேர்க்கைக்கு எதிர்ப்பை உருவாக்க சிகிச்சையைப் பொறுத்து பெண்களுக்கு குறைந்தது 2 நாட்கள் அனுமதிக்கப்பட்டன, மேலும் காட்டு வகை வயதுக்கு ஏற்ற ஆண்களும் பின்னர் அதே கூண்டில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன. இரண்டு இரவுகளுக்குப் பிறகு, பெண் கருவுற்ற வெசிகிள்கள் துண்டிக்கப்பட்டு, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, மற்றும் 25 mM NaCl (pH 8.2) ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு இடையகத்தில் உறைதல்-உருகுதல் மற்றும் சொனிகேஷன் மூலம் மரபணு DNA வெளியிடப்பட்டது. மாதிரிகள் 55 °C இல் 15 நிமிடங்கள் புரோட்டினேஸ் K (0.86 µg µl-1) உடன் அடைகாக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து 95 °C இல் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன. கச்சா மரபணு DNA தயாரிப்புகள் 10 மடங்கு நீர்த்தப்பட்டு Y குரோமோசோம் வரிசைகளின் qPCR கண்டறிதலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன; ப்ரைமர்கள் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. Y குரோமோசோம் வரிசை இல்லாதது இனச்சேர்க்கை இல்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.
மறு இனச்சேர்க்கை மதிப்பீடுகளுக்கு, கட்டாய-இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்கள் இனச்சேர்க்கை நிலையை உறுதிப்படுத்த இனச்சேர்க்கை பிளக்குகள் உள்ளதா என பரிசோதிக்கப்பட்டனர், மேலும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ஆண்கள் இல்லாத நிலையில் இனச்சேர்க்கைக்கு ஒளிவிலகல் தன்மையை உருவாக்க 2 நாட்கள் அனுமதிக்கப்பட்டனர். 36. DsRed டிரான்ஸ்ஜெனிக் விந்தணுவைச் சுமக்கும் ஆண் விலங்குகள் பின்னர் பெண் கூண்டுகளில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன. இரண்டு இரவுகளுக்குப் பிறகு, கருவுறும் வெசிகிள்கள் பெண் விலங்குகளிடமிருந்து பிரிக்கப்பட்டன, மேலும் மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி மரபணு டிஎன்ஏ தயாரிக்கப்பட்டு டிஎஸ்ஆர்இடி டிரான்ஸ்ஜீனின் qPCR கண்டறிதலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது; ப்ரைமர்கள் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு அட்டவணை 2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. DsRed டிரான்ஸ்ஜீன் இல்லாதது மறு இனச்சேர்க்கை ஏற்படவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.
3D20E முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது 37. சுருக்கமாக, 10 மி.கி 20E (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) 10 மி.கி தண்ணீரில் கரைக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 30 மி.கி பிளாட்டினம் கருப்பு (பொடி வடிவத்தில், சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) சேர்க்கப்பட்டது. வினையூக்கி கலவையில் O2 இன் மென்மையான நீரோடை தொடர்ந்து குமிழியிடப்பட்டது, இது அறை வெப்பநிலையில் கிளறப்பட்டது. 6 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, வினையை நிறுத்த 30 மி.லி மெத்தனால் சேர்க்கப்பட்டது. வினையூக்கி துகள்களை அகற்ற கலவை மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. அறை வெப்பநிலையில் வெற்றிடத்தில் உலர் நிலைக்கு சூப்பர்நேட்டண்ட் ஆவியாகியது. HPLC-MS/MS பகுப்பாய்விற்கான ஊசிக்காக உலர்ந்த எதிர்வினை தயாரிப்பு 10% எத்தனால் மற்றும் மெத்தனாலில் கரைக்கப்பட்டது. மாற்ற விகிதம் (20E முதல் 3D20E வரை) தோராயமாக 97% (படம் 4b), மற்றும் தொகுக்கப்பட்ட 3D20E இன் MS நிறமாலை இனச்சேர்க்கை செய்யப்பட்ட பெண்களில் காணப்பட்டதைப் பொருத்தியது (படம் 4c).
புள்ளிவிவர சோதனைகளின் குறிப்பிட்ட விவரங்கள் லெஜெண்டில் உள்ளன. ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனை, மாண்டல்-காக்ஸ் சோதனை மற்றும் மாணவரின் டி-சோதனையைச் செய்ய கிராஃப்பேட் (பதிப்பு 9.0) பயன்படுத்தப்பட்டது. கோக்ரான்-மாண்டல்-ஹேன்செல் சோதனைகள் தனிப்பயன் R ஸ்கிரிப்டைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test இல் கிடைக்கிறது). 0.05 என்ற முக்கியத்துவ வரம்புடன் ஷாபிரோ-வில்க் சோதனையைப் பயன்படுத்தி தரவு விநியோகம் இயல்புநிலைக்கு சோதிக்கப்பட்டது. தரவு இயல்பான சோதனையில் தோல்வியடைந்தபோது, ​​மான்-விட்னி சோதனை செய்யப்பட்டது. மாண்டல்-காக்ஸ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி உயிர்வாழும் தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. RNA-seq மரபணு-நிலை வேறுபாடு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வைச் செய்ய DESeq2 தொகுப்பு (பதிப்பு 1.28.1) பயன்படுத்தப்பட்டது. வரைபடத்தில் உள்ள கிடைமட்டப் பட்டை சராசரியைக் குறிக்கிறது. அனைத்து சோதனைகளுக்கும் P = 0.05 என்ற முக்கியத்துவ மதிப்பு வாசலாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
ஆய்வு வடிவமைப்பு பற்றிய கூடுதல் தகவலுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள இயற்கை ஆராய்ச்சி அறிக்கை சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
MS புரோட்டியோமிக் தரவு, PRIDE கூட்டாளர் களஞ்சியம் (https://www.ebi.ac.uk/pride/) மூலம் PXD032157 என்ற தரவுத்தொகுப்பு அடையாளங்காட்டியுடன் ProteomeXchange கூட்டமைப்பில் (http://proteomecentral.proteomexchange.org) டெபாசிட் செய்யப்பட்டது.
RNA-seq தரவுத்தொகுப்பு GSE198665 என்ற தொடர் பதிவின் கீழ் மரபணு வெளிப்பாடு விரிவான நூலகத்தில் (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) டெபாசிட் செய்யப்பட்டுள்ளது.
தற்போதைய ஆய்வின் போது உருவாக்கப்பட்ட மற்றும்/அல்லது பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட கூடுதல் தரவுத்தொகுப்புகளை நியாயமான கோரிக்கையின் பேரில் தொடர்புடைய ஆசிரியர்களிடமிருந்து பெறலாம். இந்தக் கட்டுரை மூலத் தரவை வழங்குகிறது.
டி லூஃப், ஏ. எக்டிஸ்டீராய்டுகள்: புறக்கணிக்கப்பட்ட பூச்சி பாலியல் ஸ்டீராய்டுகள்? ஆண்: கருப்புப் பெட்டி. பூச்சி அறிவியல்.13, 325–338 (2006).
அனோபிலிஸ் ஸ்டீபன்ஸ்.ஜே. பூச்சி உடலியல்.28, 97–109 (1982) இல் ரெட்ஃபெர்ன், சிபிஎஃப் 20-ஹைட்ராக்ஸிஎக்டிசோன் மற்றும் கருப்பை வளர்ச்சி.