கட்டி நுண்ணிய சூழலின் (TME) முக்கிய அம்சமாக இம்யூனோமோடூலேட்டரி மெட்டாபொலைட்டுகள் உள்ளன, ஆனால் ஒரு சில விதிவிலக்குகளுடன், அவற்றின் அடையாளங்கள் பெரும்பாலும் தெரியவில்லை. இங்கு, உயர்-தர சீரியஸ் கார்சினோமா (HGSC) உள்ள நோயாளிகளின் கட்டிகள் மற்றும் ஆஸைட்டுகளிலிருந்து கட்டிகள் மற்றும் T செல்களை பகுப்பாய்வு செய்தோம், இந்த வெவ்வேறு TME பிரிவுகளின் வளர்சிதை மாற்றத்தை வெளிப்படுத்தினோம். ஆஸைட்டுகள் மற்றும் கட்டி செல்கள் விரிவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளைக் கொண்டுள்ளன. ஆஸைட்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​கட்டி-ஊடுருவக்கூடிய T செல்கள் 1-மெத்தில்நிகோடினமைடு (MNA) இல் கணிசமாக செறிவூட்டப்படுகின்றன. T செல்களில் MNA அளவு உயர்ந்திருந்தாலும், நிகோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸின் வெளிப்பாடு (S-adenosylmethionine இலிருந்து நிகோடினமைடுக்கு மீதில் குழுக்களின் பரிமாற்றத்தை ஊக்குவிக்கும் ஒரு நொதி) ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் மற்றும் கட்டி செல்களுக்கு மட்டுமே. செயல்பாட்டு ரீதியாக, கட்டியை ஊக்குவிக்கும் சைட்டோகைன் கட்டி நெக்ரோசிஸ் காரணி ஆல்பாவை சுரக்க MNA T செல்களைத் தூண்டுகிறது. எனவே, TME-பெறப்பட்ட MNA T செல்களின் நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குமுறைக்கு பங்களிக்கிறது மற்றும் மனித புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்கைக் குறிக்கிறது.
கட்டியிலிருந்து பெறப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்கள் கட்டி எதிர்ப்பு நோய் எதிர்ப்பு சக்தியில் ஆழமான தடுப்பு விளைவை ஏற்படுத்தக்கூடும், மேலும் அவை நோய் முன்னேற்றத்திற்கான முக்கிய உந்து சக்தியாகவும் செயல்படக்கூடும் என்பதற்கான சான்றுகள் மேலும் மேலும் காட்டுகின்றன (1). வார்பர்க் விளைவுக்கு கூடுதலாக, கட்டி செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற நிலை மற்றும் கட்டி நுண்ணிய சூழலின் (TME) நோயெதிர்ப்பு நிலையுடனான அதன் உறவை வகைப்படுத்த சமீபத்திய பணிகள் தொடங்கியுள்ளன. எலி மாதிரிகள் மற்றும் மனித டி செல்கள் மீதான ஆய்வுகள் குளுட்டமைன் வளர்சிதை மாற்றம் (2), ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் (3) மற்றும் குளுக்கோஸ் வளர்சிதை மாற்றம் (4) ஆகியவை பல்வேறு நோயெதிர்ப்பு செல் துணைக்குழுக்களில் சுயாதீனமாக செயல்பட முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. இந்த பாதைகளில் உள்ள பல வளர்சிதை மாற்றங்கள் டி செல்களின் கட்டி எதிர்ப்பு செயல்பாட்டைத் தடுக்கின்றன. டெட்ராஹைட்ரோபயோப்டெரின் (BH4) என்ற கோஎன்சைமின் முற்றுகை T செல்களின் பெருக்கத்தை சேதப்படுத்தும் என்பதும், உடலில் BH4 இன் அதிகரிப்பு CD4 மற்றும் CD8 ஆல் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படும் கட்டி எதிர்ப்பு நோயெதிர்ப்பு மறுமொழியை மேம்படுத்தும் என்பதும் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. கூடுதலாக, BH4 (5) இன் நிர்வாகத்தால் கைனுரேனைனின் நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு விளைவை மீட்டெடுக்க முடியும். ஐசோசிட்ரேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (IDH) பிறழ்ந்த கிளியோபிளாஸ்டோமாவில், எனன்டியோமெட்டபாலிக் (R)-2-ஹைட்ராக்ஸிகுளுட்டரேட் (R-2-HG) சுரப்பு T செல் செயல்படுத்தல், பெருக்கம் மற்றும் சைட்டோலிசிஸ் செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது (6). சமீபத்தில், கிளைகோலிசிஸின் துணைப் பொருளான மெத்தில்கிளியாக்சல், மைலாய்டு தோற்றத்தின் அடக்கி செல்கள் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது என்றும், மெத்தில்கிளியாக்சலின் T செல் பரிமாற்றம் செயல்திறன் T செல் செயல்பாட்டைத் தடுக்க முடியும் என்றும் காட்டப்பட்டுள்ளது. சிகிச்சையில், மெத்தில்கிளியாக்சலை நடுநிலையாக்குவது மைலாய்டு-பெறப்பட்ட அடக்கி செல்கள் (MDSC) செயல்பாட்டைக் கடக்க முடியும் மற்றும் சுட்டி மாதிரிகளில் சோதனைச் சாவடி தடுப்பு சிகிச்சையை ஒருங்கிணைந்த முறையில் மேம்படுத்த முடியும் (7). இந்த ஆய்வுகள் கூட்டாக T செல் செயல்பாடு மற்றும் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதில் TME-பெறப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களின் முக்கிய பங்கை வலியுறுத்துகின்றன.
கருப்பை புற்றுநோயில் T செல் செயலிழப்பு பரவலாகப் பதிவாகியுள்ளது (8). இது ஓரளவுக்கு ஹைபோக்ஸியா மற்றும் அசாதாரண கட்டி வாஸ்குலேச்சரில் உள்ளார்ந்த வளர்சிதை மாற்ற பண்புகள் காரணமாகும் (9), இதன் விளைவாக குளுக்கோஸ் மற்றும் டிரிப்டோபனை லாக்டிக் அமிலம் மற்றும் கைனுரெனைன் போன்ற துணை தயாரிப்புகளாக மாற்றுகிறது. அதிகப்படியான புற-செல்லுலார் லாக்டேட் இன்டர்ஃபெரான்-γ (IFN-γ) உற்பத்தியைக் குறைக்கிறது மற்றும் மைலோசப்ரசிவ் துணைக்குழுக்களின் வேறுபாட்டை இயக்குகிறது (10, 11). டிரிப்டோபனின் நுகர்வு நேரடியாக T செல் பெருக்கத்தைத் தடுக்கிறது மற்றும் T செல் ஏற்பி சமிக்ஞையைத் தடுக்கிறது (12-14). இந்த அவதானிப்புகள் இருந்தபோதிலும், நோயெதிர்ப்பு வளர்சிதை மாற்றத்தைச் சுற்றியுள்ள நிறைய வேலைகள் உகந்த ஊடகங்களைப் பயன்படுத்தி இன் விட்ரோ டி செல் கலாச்சாரத்தில் மேற்கொள்ளப்பட்டன, அல்லது விவோவில் ஹோமோலோகஸ் எலி மாதிரிகளுக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டன, இவை இரண்டும் மனித புற்றுநோய்களின் பன்முகத்தன்மை மற்றும் உடலியல் மேக்ரோ மற்றும் மைக்ரோ சூழலை முழுமையாக பிரதிபலிக்கவில்லை.
கருப்பை புற்றுநோயின் பொதுவான அம்சம் பெரிட்டோனியல் பரவல் மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகள் தோன்றுவது. ஆஸ்கைட்டுகளில் செல் திரவம் குவிவது மேம்பட்ட நோய் மற்றும் மோசமான முன்கணிப்புடன் தொடர்புடையது (15). அறிக்கைகளின்படி, இந்த தனித்துவமான பகுதி ஹைபோக்சிக் ஆகும், அதிக அளவு வாஸ்குலர் எண்டோடெலியல் வளர்ச்சி காரணி (VEGF) மற்றும் இண்டோலியமைன் 2,3-டைஆக்ஸிஜனேஸ் (IDO) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் T ஒழுங்குமுறை செல்கள் மற்றும் மைலாய்டு தடுப்பு செல்கள் (15-18) ஆகியவற்றால் ஊடுருவுகிறது. ஆஸ்கைட்டுகளின் வளர்சிதை மாற்ற சூழல் கட்டியிலிருந்து வேறுபட்டிருக்கலாம், எனவே பெரிட்டோனியல் இடத்தில் T செல்களை மறு நிரலாக்கம் செய்வது தெளிவாக இல்லை. கூடுதலாக, கட்டி சூழலில் இருக்கும் ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றங்களுக்கு இடையிலான முக்கிய வேறுபாடுகள் மற்றும் பன்முகத்தன்மை நோயெதிர்ப்பு செல்கள் ஊடுருவுவதையும் கட்டிகளில் அவற்றின் செயல்பாட்டையும் தடுக்கலாம், மேலும் மேலும் ஆராய்ச்சி தேவை.
இந்த சிக்கல்களைத் தீர்க்க, பல்வேறு செல் வகைகளை (CD4 + மற்றும் CD8 + T செல்கள் உட்பட) மற்றும் கட்டிகளுக்குள்ளும் இடையிலும் ஆய்வு செய்ய ஒரு உணர்திறன் வாய்ந்த செல் பிரிப்பு மற்றும் திரவ குரோமடோகிராபி டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS/MS) முறையை நாங்கள் வடிவமைத்தோம். அதன் வளர்சிதை மாற்றங்கள் நோயாளியின் அதே ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி சூழலில் செல்களை பரப்புகின்றன. இந்த முக்கிய மக்கள்தொகையின் வளர்சிதை மாற்ற நிலையின் மிகவும் தீர்க்கப்பட்ட உருவப்படத்தை வழங்க உயர் பரிமாண ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மற்றும் ஒற்றை-செல் RNA வரிசைமுறை (scRNA-seq) ஆகியவற்றுடன் இணைந்து இந்த முறையைப் பயன்படுத்துகிறோம். இந்த முறை கட்டி T செல்களில் 1-மெத்தில்னிகோடினமைடு (MNA) அளவில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பை வெளிப்படுத்தியது, மேலும் இன் விட்ரோ சோதனைகள் T செல் செயல்பாட்டில் MNA இன் இம்யூனோமோடூலேட்டரி விளைவு முன்னர் அறியப்படவில்லை என்பதைக் காட்டியது. பொதுவாக, இந்த முறை கட்டிகள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்களுக்கு இடையிலான பரஸ்பர வளர்சிதை மாற்ற தொடர்புகளை வெளிப்படுத்துகிறது, மேலும் நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குமுறை வளர்சிதை மாற்றங்கள் பற்றிய தனித்துவமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது, இது T செல் அடிப்படையிலான கருப்பை புற்றுநோய் நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை சிகிச்சை வாய்ப்புகளுக்கு பயனுள்ளதாக இருக்கும்.
குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலை [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ஆகியவை ஒரே நேரத்தில் அளவிட உயர் பரிமாண ஓட்ட சைட்டோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தினோம், அவை நோயெதிர்ப்பு செல்கள் மற்றும் கட்டி செல் எண்ணிக்கையை வேறுபடுத்தும் பக்கவாட்டு பொதுவான குறிப்பான்கள் (அட்டவணை S2 மற்றும் படம் S1A). இந்த பகுப்பாய்வு T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி செல்கள் அதிக குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் அளவைக் கொண்டுள்ளன, ஆனால் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் சிறிய வேறுபாடுகளைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் காட்டுகிறது. கட்டி செல்களின் சராசரி குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T செல்களை விட மூன்று முதல் நான்கு மடங்கு அதிகம், மேலும் CD4 + T செல்களின் சராசரி குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் CD8 + T செல்களை விட 1.2 மடங்கு அதிகம், இது கட்டி ஊடுருவும் லிம்போசைட்டுகள் (TIL) ஒரே TME இல் கூட வெவ்வேறு வளர்சிதை மாற்றத் தேவைகளைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 1A). இதற்கு நேர்மாறாக, கட்டி செல்களில் உள்ள மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD4 + T செல்களைப் போலவே உள்ளது, மேலும் இரண்டு செல் வகைகளின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD8 + T செல்களை விட அதிகமாக உள்ளது (படம் 1B). பொதுவாக, இந்த முடிவுகள் வளர்சிதை மாற்ற அளவை வெளிப்படுத்துகின்றன. கட்டி செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு CD4 + T செல்களை விட அதிகமாக உள்ளது, மேலும் CD4 + T செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு CD8 + T செல்களை விட அதிகமாக உள்ளது. செல் வகைகளில் இந்த விளைவுகள் இருந்தபோதிலும், கட்டிகளுடன் ஒப்பிடும்போது CD4 + மற்றும் CD8 + T செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற நிலையிலோ அல்லது ஆஸ்கைட்டுகளில் அவற்றின் ஒப்பீட்டு விகிதத்திலோ நிலையான வேறுபாடு இல்லை (படம் 1C). இதற்கு நேர்மாறாக, CD45-செல் பின்னத்தில், கட்டியில் உள்ள EpCAM+ செல்களின் விகிதம் ஆஸ்கைட்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது அதிகரித்துள்ளது (படம் 1D). EpCAM+ மற்றும் EpCAM- செல் கூறுகளுக்கு இடையே தெளிவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாட்டையும் நாங்கள் கவனித்தோம். EpCAM+ (கட்டி) செல்கள் EpCAM- செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன, இது TME இல் உள்ள கட்டி செல்களில் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களின் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாட்டை விட மிக அதிகம் (படம் 1, E மற்றும் F).
(A மற்றும் B) குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலின் சராசரி ஒளிரும் தீவிரம் (MFI) (2-NBDG) (A) மற்றும் CD4 + T செல்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு (MitoTracker அடர் சிவப்பு) (B) ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டியிலிருந்து பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணைப்படுத்தப்பட்ட தரவு (வலது), CD8 + T செல்கள் மற்றும் EpCAM + CD45-கட்டி செல்கள். (C) ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டியில் CD4 + மற்றும் CD8 + செல்கள் (CD3 + T செல்கள்) விகிதம். (D) ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டியில் EpCAM + கட்டி செல்களின் விகிதம் (CD45−). (E மற்றும் F) EpCAM + CD45-கட்டி மற்றும் EpCAM-CD45-மேட்ரிக்ஸ் குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் (2-NBDG) (E) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு (MitoTracker அடர் சிவப்பு) (F) பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணைப்படுத்தப்பட்ட தரவு (வலது) ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி செல்கள். (G) ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் CD25, CD137 மற்றும் PD1 வெளிப்பாட்டின் பிரதிநிதித்துவ வரைபடங்கள். (H மற்றும் I) CD4 + T செல்கள் (H) மற்றும் CD8 + T செல்கள் (I) ஆகியவற்றில் CD25, CD137 மற்றும் PD1 வெளிப்பாடு. (J மற்றும் K) CCR7 மற்றும் CD45RO இன் வெளிப்பாட்டை அடிப்படையாகக் கொண்ட Naive, மைய நினைவகம் (Tcm), செயல்திறன் (Teff) மற்றும் செயல்திறன் நினைவகம் (Tem) பினோடைப்கள். ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளில் CD4 + T செல்கள் (J) மற்றும் CD8 + T செல்கள் (K) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அட்டவணை தரவு (வலது). ஜோடி செய்யப்பட்ட t-சோதனையால் தீர்மானிக்கப்படும் P மதிப்புகள் (*P<0.05, **P<0.01 மற்றும் ***P<0.001). கோடு பொருந்திய நோயாளிகளைக் குறிக்கிறது (n = 6). FMO, ஃப்ளோரசன்ஸ் மைனஸ் ஒன்; MFI, சராசரி ஃப்ளோரசன்ஸ் தீவிரம்.
மேலும் பகுப்பாய்வு மிகவும் தீர்க்கப்பட்ட T செல் பினோடைபிக் நிலைக்கு இடையிலான பிற குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கட்டிகளில் செயல்படுத்தப்பட்ட (படம் 1, G முதல் I வரை) மற்றும் விளைவு நினைவகம் (படம் 1, J மற்றும் K) ஆஸ்கைட்டுகளை விட (CD3 + T செல்களின் விகிதம்) மிகவும் அடிக்கடி நிகழ்கின்றன. இதேபோல், செயல்படுத்தும் குறிப்பான்கள் (CD25 மற்றும் CD137) மற்றும் குறைப்பு குறிப்பான்கள் [திட்டமிடப்பட்ட செல் இறப்பு புரதம் 1 (PD1)] ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு மூலம் பினோடைப்பை பகுப்பாய்வு செய்ததில், இந்த மக்கள்தொகையின் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகள் வேறுபட்டிருந்தாலும் (படம் S1, B முதல் E வரை), ஆனால் நேவ், விளைவு அல்லது நினைவக துணைக்குழுக்களுக்கு இடையில் குறிப்பிடத்தக்க வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகள் எதுவும் தொடர்ந்து காணப்படவில்லை என்பதைக் காட்டியது (படம் S1, F முதல் I வரை). செல் பினோடைப்களை தானாக ஒதுக்க இயந்திர கற்றல் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் இந்த முடிவுகள் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (21), இது நோயாளியின் ஆஸ்கைட்டுகளில் அதிக எண்ணிக்கையிலான எலும்பு மஜ்ஜை செல்கள் (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) இருப்பதை மேலும் வெளிப்படுத்தியது (படம் S2A). அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து செல் வகைகளிலும், இந்த மைலாய்டு செல் மக்கள் தொகை மிக உயர்ந்த குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைக் காட்டியது (படம் S2, B முதல் G வரை). இந்த முடிவுகள் HGSC நோயாளிகளில் ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளில் காணப்படும் பல செல் வகைகளுக்கு இடையிலான வலுவான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளை எடுத்துக்காட்டுகின்றன.
TIL இன் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகளைப் புரிந்துகொள்வதில் உள்ள முக்கிய சவால், கட்டிகளிலிருந்து போதுமான தூய்மை, தரம் மற்றும் அளவு கொண்ட T செல் மாதிரிகளை தனிமைப்படுத்த வேண்டியதன் அவசியமாகும். சமீபத்திய ஆய்வுகள், ஓட்ட சைட்டோமெட்ரியை அடிப்படையாகக் கொண்ட வரிசைப்படுத்துதல் மற்றும் மணி செறிவூட்டல் முறைகள் செல்லுலார் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரங்களில் மாற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கும் என்பதைக் காட்டுகின்றன (22-24). இந்த சிக்கலைச் சமாளிக்க, LC-MS/MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு முன்பு, அறுவை சிகிச்சை மூலம் அகற்றப்பட்ட மனித கருப்பை புற்றுநோயிலிருந்து TIL ஐ தனிமைப்படுத்தி தனிமைப்படுத்த மணி செறிவூட்டல் முறையை நாங்கள் மேம்படுத்தினோம் (பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்; படம் 2A). வளர்சிதை மாற்ற மாற்றங்களில் இந்த நெறிமுறையின் ஒட்டுமொத்த தாக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்காக, மேலே உள்ள மணி பிரிப்பு படிக்குப் பிறகு ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்களால் செயல்படுத்தப்பட்ட T செல்களின் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரங்களை மணி பிரிக்கப்படாத ஆனால் பனியில் இருந்த செல்களுடன் ஒப்பிட்டோம். இந்த தரக் கட்டுப்பாட்டு பகுப்பாய்வு இந்த இரண்டு நிலைகளுக்கும் (r = 0.77) இடையே அதிக தொடர்பு இருப்பதைக் கண்டறிந்தது, மேலும் 86 வளர்சிதை மாற்றங்களின் குழுவின் தொழில்நுட்ப மறுபயன்பாடு அதிக மறுபயன்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது (படம் 2B). எனவே, இந்த முறைகள் செல் வகை செறிவூட்டலுக்கு உட்படும் செல்களில் துல்லியமான வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்வைச் செய்ய முடியும், இதனால் HGSC இல் குறிப்பிட்ட வளர்சிதை மாற்றங்களை அடையாளம் காண்பதற்கான முதல் உயர் தெளிவுத்திறன் தளத்தை வழங்குகிறது, இதன் மூலம் மக்கள் செல் தனித்தன்மை பாலியல் வளர்சிதை மாற்றத் திட்டத்தைப் பற்றிய ஆழமான புரிதலைப் பெற உதவுகிறது.
(A) காந்த மணி செறிவூட்டலின் திட்ட வரைபடம். LC-MS/MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு முன், செல்கள் தொடர்ச்சியான மூன்று சுற்று காந்த மணி செறிவூட்டலுக்கு உட்படும் அல்லது பனியில் இருக்கும். (B) வளர்சிதை மாற்றங்களின் மிகுதியில் செறிவூட்டல் வகையின் விளைவு. ஒவ்வொரு செறிவூட்டல் வகைக்கும் சராசரியாக மூன்று அளவீடுகள் ± SE. சாம்பல் கோடு 1:1 உறவைக் குறிக்கிறது. அச்சு லேபிளில் காட்டப்பட்டுள்ள தொடர்ச்சியான அளவீடுகளின் உள்-வகுப்பு தொடர்பு (ICC). NAD, நிகோடினமைடு அடினைன் டைனுக்ளியோடைடு. (C) நோயாளி வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்வின் பணிப்பாய்வின் திட்ட வரைபடம். ஆஸ்கைட்டுகள் அல்லது கட்டிகள் நோயாளிகளிடமிருந்து சேகரிக்கப்பட்டு கிரையோபிரேசர்வ் செய்யப்படுகின்றன. ஒவ்வொரு மாதிரியின் ஒரு சிறிய பகுதியும் ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மீதமுள்ள மாதிரிகள் CD4+, CD8+ மற்றும் CD45- செல்களுக்கு மூன்று சுற்று செறிவூட்டலுக்கு உட்பட்டன. இந்த செல் பின்னங்கள் LC-MS/MS ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. (D) தரப்படுத்தப்பட்ட வளர்சிதை மாற்ற மிகுதியின் வெப்ப வரைபடம். டென்ட்ரோகிராம் மாதிரிகளுக்கு இடையிலான யூக்ளிடியன் தூரங்களின் வார்டின் கிளஸ்டரிங்கைக் குறிக்கிறது. (E) மாதிரி வளர்சிதை மாற்ற வரைபடத்தின் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA), ஒவ்வொரு மாதிரியின் மூன்று பிரதிகளைக் காட்டுகிறது, ஒரே நோயாளியிடமிருந்து மாதிரிகள் ஒரு கோட்டால் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. (F) நோயாளியின் மீது நிபந்தனைக்குட்பட்ட மாதிரியின் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரத்தின் PCA (அதாவது, பகுதி மிகைப்படுத்தலைப் பயன்படுத்தி); மாதிரி வகை குவிந்த மேலோட்டத்தால் வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. PC1, முக்கிய கூறு 1; PC2, முக்கிய கூறு 2.
அடுத்து, ஆறு HGSC நோயாளிகளின் முதன்மை ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள CD4 +, CD8 + மற்றும் CD45-செல் பின்னங்களில் உள்ள 99 வளர்சிதை மாற்றங்களை பகுப்பாய்வு செய்ய இந்த செறிவூட்டல் முறையைப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 2C, படம் S3A மற்றும் அட்டவணை S3 மற்றும் S4). ஆர்வமுள்ள மக்கள் தொகை, அசல் பெரிய மாதிரி உயிருள்ள செல்களில் 2% முதல் 70% வரை உள்ளது, மேலும் செல்களின் விகிதம் நோயாளிகளுக்கு இடையே பெரிதும் வேறுபடுகிறது. மணிகளைப் பிரித்த பிறகு, ஆர்வமுள்ள செறிவூட்டப்பட்ட பின்னம் (CD4+, CD8+ அல்லது CD45-) மாதிரியில் உள்ள அனைத்து உயிருள்ள செல்களிலும் சராசரியாக 85% க்கும் அதிகமாக உள்ளது. இந்த செறிவூட்டல் முறை மனித கட்டி திசு வளர்சிதை மாற்றத்திலிருந்து செல் மக்கள்தொகையை பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது, இது பெரிய மாதிரிகளிலிருந்து செய்ய இயலாது. இந்த நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி, எல்-கைனுரேனைன் மற்றும் அடினோசின், இந்த இரண்டு நன்கு வகைப்படுத்தப்பட்ட நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு வளர்சிதை மாற்றங்கள் கட்டி T செல்கள் அல்லது கட்டி செல்களில் உயர்த்தப்பட்டுள்ளன என்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (படம் S3, B மற்றும் C). எனவே, இந்த முடிவுகள், நோயாளி திசுக்களில் உயிரியல் ரீதியாக முக்கியமான வளர்சிதை மாற்றங்களைக் கண்டறிய நமது செல் பிரிப்பு மற்றும் நிறை நிறமாலை தொழில்நுட்பத்தின் நம்பகத்தன்மை மற்றும் திறனை நிரூபிக்கின்றன.
எங்கள் பகுப்பாய்வு நோயாளிகளுக்குள்ளும் நோயாளிகளுக்கு இடையிலும் செல் வகைகளின் வலுவான வளர்சிதை மாற்றப் பிரிப்பையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் 2D மற்றும் படம் S4A). குறிப்பாக, மற்ற நோயாளிகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​நோயாளி 70 வெவ்வேறு வளர்சிதை மாற்ற பண்புகளைக் காட்டினார் (படம் 2E மற்றும் படம் S4B), இது நோயாளிகளுக்கு இடையே கணிசமான வளர்சிதை மாற்ற பன்முகத்தன்மை இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது. மற்ற நோயாளிகளுடன் ஒப்பிடும்போது (1.2 முதல் 2 லிட்டர்; அட்டவணை S1), நோயாளி 70 (80 மிலி) இல் சேகரிக்கப்பட்ட ஆஸ்கைட்டுகளின் மொத்த அளவு குறைவாக இருந்தது என்பது கவனிக்கத்தக்கது. முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வின் போது (எடுத்துக்காட்டாக, பகுதி பணிநீக்க பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி) நோயாளிகளுக்கிடையேயான பன்முகத்தன்மையின் கட்டுப்பாடு செல் வகைகளுக்கு இடையில் நிலையான மாற்றங்களைக் காட்டுகிறது, மேலும் செல் வகைகள் மற்றும்/அல்லது நுண்ணிய சூழல் வளர்சிதை மாற்ற சுயவிவரத்தின் படி தெளிவாகத் தொகுக்கப்படுகின்றன (படம் 2F). ஒற்றை வளர்சிதை மாற்றங்களின் பகுப்பாய்வு இந்த விளைவுகளை வலியுறுத்தியது மற்றும் செல் வகைகள் மற்றும் நுண்ணிய சூழலுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கவனிக்கப்பட்ட மிகவும் தீவிரமான வேறுபாடு MNA ஆகும், இது பொதுவாக CD45- செல்கள் மற்றும் கட்டியை ஊடுருவிச் செல்லும் CD4+ மற்றும் CD8+ செல்களில் செறிவூட்டப்படுகிறது (படம் 3A). CD4 + செல்களைப் பொறுத்தவரை, இந்த விளைவு மிகவும் வெளிப்படையானது, மேலும் CD8 + செல்களில் உள்ள MNA சுற்றுச்சூழலால் கடுமையாக பாதிக்கப்படுவதாகத் தெரிகிறது. இருப்பினும், இது முக்கியமல்ல, ஏனெனில் ஆறு நோயாளிகளில் மூன்று பேருக்கு மட்டுமே கட்டி CD8+ மதிப்பெண்களை மதிப்பீடு செய்ய முடியும். MNA உடன் கூடுதலாக, ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள பல்வேறு வகையான செல்களில், TIL இல் மோசமாக வகைப்படுத்தப்படும் பிற வளர்சிதை மாற்றங்களும் வேறுபட்ட அளவில் நிறைந்துள்ளன (படங்கள் S3 மற்றும் S4). எனவே, இந்தத் தரவுகள் மேலும் ஆராய்ச்சிக்காக நோயெதிர்ப்புத் திறன் கொண்ட வளர்சிதை மாற்றங்களின் நம்பிக்கைக்குரிய தொகுப்பை வெளிப்படுத்துகின்றன.
(A) ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டியிலிருந்து CD4+, CD8+ மற்றும் CD45- செல்களில் MNA இன் இயல்பாக்கப்பட்ட உள்ளடக்கம். பெட்டி வரைபடம் இடைநிலை (கோடு), இடைக்கால வரம்பு (சட்டக கீல்) மற்றும் தரவு வரம்பைக் காட்டுகிறது, இடைக்கால வரம்பை விட 1.5 மடங்கு வரை (சட்டக விஸ்கர்). நோயாளி பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, P மதிப்பை தீர்மானிக்க நோயாளியின் லிம்மா மதிப்பைப் பயன்படுத்தவும் (*P<0.05 மற்றும் **P<0.01). (B) MNA வளர்சிதை மாற்றத்தின் திட்ட வரைபடம் (60). வளர்சிதை மாற்றங்கள்: S-adenosyl-1-மெத்தியோனைன்; SAH, S-adenosine-1-ஹோமோசிஸ்டீன்; NA, நிகோடினமைடு; MNA, 1-மெத்தில்நிகோடினமைடு; 2-PY, 1-மெத்தில்- 2-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு; 4-PY, 1-மெத்தில்-4-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு; NR, நிகோடினமைடு ரைபோஸ்; NMN, நிகோடினமைடு மோனோநியூக்ளியோடைடு. நொதிகள் (பச்சை): NNMT, நிகோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; SIRT, சர்டுயின்கள்; NAMPT, நிகோடினமைடு பாஸ்போரிபோசில் டிரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; AOX1, ஆல்டிஹைட் ஆக்சிடேஸ் 1; NRK, நிகோடினமைடு ரைபோசைடு கைனேஸ்; NMNAT, நிகோடினமைடு மோனோ நியூக்ளியோடைடு அடினிலேட் டிரான்ஸ்ஃபெரேஸ்; Pnp1, பியூரின் நியூக்ளியோசைடு பாஸ்போரிலேஸ். (C) ஆஸ்கைட்டுகள் (சாம்பல்) மற்றும் கட்டி (சிவப்பு; n = 3 நோயாளிகள்) ஆகியவற்றின் scRNA-seq இன் t-SNE. (D) scRNA-seq ஐப் பயன்படுத்தி அடையாளம் காணப்பட்ட வெவ்வேறு செல் மக்கள்தொகைகளில் NNMT வெளிப்பாடு. (E) SK-OV-3, மனித கரு சிறுநீரகம் (HEK) 293T, T செல்கள் மற்றும் MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் NNMT மற்றும் AOX1 இன் வெளிப்பாடு. மடிந்த வெளிப்பாடு SK-OV-3 உடன் தொடர்புடையது. SEM உடன் வெளிப்பாடு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 6 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்). 35 க்கும் அதிகமான Ct மதிப்புகள் கண்டறிய முடியாதவை (UD) எனக் கருதப்படுகின்றன. (F) SK-OV-3, HEK293T, T செல்கள் மற்றும் 8mM MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் SLC22A1 மற்றும் SLC22A2 இன் வெளிப்பாடு. மடிந்த வெளிப்பாடு SK-OV-3 உடன் ஒப்பிடும்போது காட்டப்பட்டுள்ளது. SEM உடன் வெளிப்பாடு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 6 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்). 35 க்கும் அதிகமான Ct மதிப்புகள் கண்டறிய முடியாதவை (UD) எனக் கருதப்படுகின்றன. (G) MNA உடன் 72 மணிநேர அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு செயல்படுத்தப்பட்ட ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்களில் செல் MNA உள்ளடக்கம். SEM உடன் வெளிப்பாடு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 4 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்).
நிக்கோடினமைடு N-மெத்தில்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் (NNMT; படம் 3B) மூலம் S-adenosyl-1-methionine (SAM) இலிருந்து மீதில் குழுவை நிக்கோடினமைடு (NA) க்கு மாற்றுவதன் மூலம் MNA தயாரிக்கப்படுகிறது. பல்வேறு வகையான மனித புற்றுநோய்களில் NNMT அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் பெருக்கம், படையெடுப்பு மற்றும் மெட்டாஸ்டாஸிஸ் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையது (25-27). TME இல் உள்ள T செல்களில் MNA இன் மூலத்தை நன்கு புரிந்துகொள்ள, மூன்று HGSC நோயாளிகளின் ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளில் உள்ள செல் வகைகளில் NNMT இன் வெளிப்பாட்டை வகைப்படுத்த scRNA-seq ஐப் பயன்படுத்தினோம் (அட்டவணை S5). தோராயமாக 6,500 செல்களின் பகுப்பாய்வு, ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி சூழல்களில், NNMT வெளிப்பாடு ஊகிக்கப்பட்ட ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் மற்றும் கட்டி செல் மக்கள்தொகைக்கு மட்டுமே என்று காட்டியது (படம் 3, C மற்றும் D). PTPRC (CD45 +) ஐ வெளிப்படுத்தும் எந்த மக்கள்தொகையிலும் வெளிப்படையான NNMT வெளிப்பாடு இல்லை என்பது குறிப்பிடத்தக்கது (படம் 3D மற்றும் படம் S5A), இது வளர்சிதை மாற்ற நிறமாலையில் கண்டறியப்பட்ட MNA T செல்களில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. ஆல்டிஹைட் ஆக்சிடேஸ் 1 (AOX1) இன் வெளிப்பாடு MNA ஐ 1-மெத்தில்-2-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு (2-PYR) அல்லது 1-மெத்தில்-4-பைரிடோன்-5-கார்பாக்சமைடு (4-PYR) ஆக மாற்றுகிறது; படம் 3B) COL1A1 (படம் S5A) ஐ வெளிப்படுத்தும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களின் எண்ணிக்கையிலும் கட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, இது T செல்கள் வழக்கமான MNA வளர்சிதை மாற்றத்தின் திறனைக் கொண்டிருக்கவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த MNA தொடர்பான மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு முறை HGSC நோயாளிகளிடமிருந்து ஆஸ்கைட்டுகளிலிருந்து அமைக்கப்பட்ட இரண்டாவது சுயாதீன செல் தரவைப் பயன்படுத்தி சரிபார்க்கப்பட்டது (படம் S5B; n = 6) (16). கூடுதலாக, MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்களின் அளவு பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (qPCR) பகுப்பாய்வு கட்டுப்பாட்டு SK-OV-3 கருப்பை கட்டி செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​NNMT அல்லது AOX1 கிட்டத்தட்ட வெளிப்படுத்தப்படவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 3E). இந்த எதிர்பாராத முடிவுகள் MNA ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் அல்லது கட்டிகளிலிருந்து TME இல் அருகிலுள்ள T செல்களில் சுரக்கப்படலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.
கரையக்கூடிய கேரியர் 22 (SLC22) குடும்பத்தால் (SLC22A1, SLC22A2 மற்றும் SLC22A3) குறியிடப்பட்ட கரிம கேஷன் டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் 1 முதல் 3 (OCT1, OCT2 மற்றும் OCT3) குடும்பத்தை வேட்பாளர்கள் உள்ளடக்கியிருந்தாலும், MNA இன் சாத்தியமான டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் இன்னும் வரையறுக்கப்படவில்லை (28). ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்களிலிருந்து mRNA இன் QPCR SLC22A1 இன் குறைந்த வெளிப்பாடு நிலைகளைக் காட்டியது, ஆனால் SLC22A2 இன் கண்டறிய முடியாத அளவுகளைக் காட்டியது, இது முன்னர் இலக்கியத்தில் பதிவாகியிருந்தது என்பதை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 3F) (29). இதற்கு நேர்மாறாக, SK-OV-3 கருப்பை கட்டி செல் வரிசை இரண்டு டிரான்ஸ்போர்ட்டர்களின் உயர் நிலைகளை வெளிப்படுத்தியது (படம் 3F).
T செல்கள் வெளிநாட்டு MNA ஐ உறிஞ்சும் திறனைக் கொண்டிருப்பதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை சோதிக்க, ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்கள் MNA இன் வெவ்வேறு செறிவுகளின் முன்னிலையில் 72 மணிநேரம் வளர்க்கப்பட்டன. வெளிப்புற MNA இல்லாத நிலையில், MNA இன் செல்லுலார் உள்ளடக்கத்தைக் கண்டறிய முடியாது (படம் 3G). இருப்பினும், வெளிப்புற MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செயல்படுத்தப்பட்ட T செல்கள், செல்களில் MNA உள்ளடக்கத்தில் டோஸ்-சார்ந்த அதிகரிப்பைக் காட்டின, 6 mM MNA வரை (படம் 3G). இந்த முடிவு, குறைந்த அளவிலான டிரான்ஸ்போர்ட்டர் வெளிப்பாடு மற்றும் உள்செல்லுலார் MNA வளர்சிதை மாற்றத்திற்கு காரணமான முக்கிய நொதி இல்லாத போதிலும், TIL இன்னும் MNA ஐ எடுத்துக்கொள்ள முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
நோயாளிகளின் T செல்களில் உள்ள வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களின் நிறமாலை மற்றும் இன் விட்ரோ MNA உறிஞ்சுதல் சோதனைகள், புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் (CAF) MNA ஐ சுரக்கும் சாத்தியத்தை அதிகரிக்கின்றன மற்றும் கட்டி செல்கள் TIL இன் பினோடைப் மற்றும் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்தக்கூடும். T செல்களில் MNA இன் விளைவைத் தீர்மானிக்க, ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்கள் MNA முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில் விட்ரோவில் செயல்படுத்தப்பட்டன, மேலும் அவற்றின் பெருக்கம் மற்றும் சைட்டோகைன் உற்பத்தி மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன. அதிகபட்ச அளவில் MNA ஐச் சேர்த்த 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, மக்கள் தொகை இரட்டிப்பு எண்ணிக்கை மிதமாகக் குறைக்கப்பட்டது, அதே நேரத்தில் அனைத்து அளவுகளிலும் வீரியம் பராமரிக்கப்பட்டது (படம் 4A). கூடுதலாக, வெளிப்புற MNA சிகிச்சையானது கட்டி நெக்ரோசிஸ் காரணி-α ஐ வெளிப்படுத்தும் CD4 + மற்றும் CD8 + T செல்களின் விகிதத்தில் அதிகரிப்புக்கு வழிவகுத்தது (TNFα; படம் 4B). இதற்கு நேர்மாறாக, IFN-γ இன் உள்செல்லுலார் உற்பத்தி CD4 + T செல்களில் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது, ஆனால் CD8 + T செல்களில் அல்ல, மேலும் இன்டர்லூகின் 2 இல் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றம் எதுவும் இல்லை (IL-2; படம் 4, C மற்றும் D). எனவே, இந்த MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல் கலாச்சாரங்களிலிருந்து சூப்பர்நேட்டண்டுகளின் நொதி-இணைக்கப்பட்ட இம்யூனோசார்பன்ட் மதிப்பீடு (ELISA) TNFα இல் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு, IFN-γ இல் குறைவு மற்றும் IL-2 இல் எந்த மாற்றமும் இல்லை என்பதைக் காட்டியது (படம் 4, E முதல் G வரை). . IFN-γ இன் குறைவு, T செல்களின் கட்டி எதிர்ப்பு செயல்பாட்டைத் தடுப்பதில் MNA ஒரு பங்கை வகிக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. T செல்-மத்தியஸ்த சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியில் MNA இன் விளைவை உருவகப்படுத்த, ஃபோலேட் ஏற்பி α மற்றும் பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதம் (GFP) -CAR-T) செல்களால் கட்டுப்படுத்தப்படும் CAR-T (GFP) செல்களை இலக்காகக் கொண்ட சைமெரிக் ஆன்டிஜென் ஏற்பி T (FRα-CAR-T) செல்கள் ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் புற இரத்த மோனோநியூக்ளியர் செல்கள் (PBMC) மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன. CAR-T செல்கள் MNA முன்னிலையில் 24 மணி நேரம் வளர்க்கப்பட்டன, பின்னர் 10:1 என்ற இலக்கு விகிதத்தில் ஃபோலேட் ஏற்பியை α வெளிப்படுத்தும் மனித SK-OV-3 கருப்பை கட்டி செல்களுடன் இணைந்து வளர்க்கப்பட்டன. MNA சிகிச்சையானது FRα-CAR-T செல்களின் கொல்லும் செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பை ஏற்படுத்தியது, இது அடினோசினுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட FRα-CAR-T செல்களைப் போன்றது (படம் 4H).
(A) 7 ஆம் நாளில் கலாச்சாரத்திலிருந்து நேரடியாக மொத்த சாத்தியமான செல் எண்ணிக்கை மற்றும் மக்கள் தொகை இரட்டிப்பு (PD). பார் வரைபடம் ஆறு ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்களின் சராசரி + SEM ஐக் குறிக்கிறது. குறைந்தபட்சம் n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தரவைக் குறிக்கிறது. (B முதல் D வரை) CD3/CD28 மற்றும் IL-2 ஆகியவை 7 நாட்களுக்கு அந்தந்த MNA செறிவுகளில் T செல்களைச் செயல்படுத்தப் பயன்படுத்தப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்கு முன், செல்கள் 4 மணி நேரம் கோல்கிஸ்டாப்புடன் PMA/ionomycin உடன் தூண்டப்பட்டன. T செல்களில் TNFα (B) வெளிப்பாடு. உயிருள்ள செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டின் எடுத்துக்காட்டு படம் (இடது) மற்றும் அட்டவணை தரவு (வலது). T செல்களில் IFN-γ (C) மற்றும் IL-2 (D) வெளிப்பாடு. சைட்டோகைன்களின் வெளிப்பாடு ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் அளவிடப்பட்டது. பார் வரைபடம் சராசரி (n = 6 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்) + SEM ஐக் குறிக்கிறது. P மதிப்பைத் தீர்மானிக்க மாறுபாடு மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகளின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தவும் (*P<0.05 மற்றும் **P<0.01). குறைந்தபட்சம் n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தரவைக் குறிக்கிறது. (E முதல் G வரை) CD3/CD28 மற்றும் IL-2 ஆகியவை 7 நாட்களுக்கு அந்தந்த MNA செறிவுகளில் T செல்களைச் செயல்படுத்தப் பயன்படுத்தப்பட்டன. PMA/ionomycin தூண்டுதலுக்கு 4 மணி நேரத்திற்கு முன்னும் பின்னும் இந்த ஊடகம் சேகரிக்கப்பட்டது. TNFα (E), IFN-γ (F) மற்றும் IL-2 (G) ஆகியவற்றின் செறிவுகள் ELISA ஆல் அளவிடப்பட்டன. பார் வரைபடம் சராசரி (n = 5 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்) + SEM ஐக் குறிக்கிறது. மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகளைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்படும் P மதிப்பு (*P<0.05). புள்ளியிடப்பட்ட கோடு கண்டறிதலின் கண்டறிதல் வரம்பைக் குறிக்கிறது. (H) செல் சிதைவு மதிப்பீடு. FRα-CAR-T அல்லது GFP-CAR-T செல்கள் அடினோசின் (250μM) அல்லது MNA (10 mM) உடன் 24 மணி நேரம் சரிசெய்யப்பட்டன, அல்லது சிகிச்சையளிக்கப்படாமல் விடப்பட்டன (Ctrl). SK-OV-3 செல்களின் சதவீதக் கொல்லல் அளவிடப்பட்டது. P மதிப்பு வெல்ச் t சோதனையால் தீர்மானிக்கப்பட்டது (*P<0.5 மற்றும் **P<0.01).
MNA-சார்ந்த TNFα வெளிப்பாடு ஒழுங்குமுறை பற்றிய இயந்திர புரிதலைப் பெறுவதற்காக, MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களின் TNFα mRNA இல் ஏற்பட்ட மாற்றங்கள் மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன (படம் 5A). MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் T செல்கள் TNFα டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அளவுகளில் இரு மடங்கு அதிகரிப்பைக் காட்டின, இது MNA TNFα டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையைச் சார்ந்தது என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த சாத்தியமான ஒழுங்குமுறை பொறிமுறையை ஆராய, TNFα ஐ ஒழுங்குபடுத்தும் இரண்டு அறியப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள், அதாவது செயல்படுத்தப்பட்ட T செல் அணுக்கரு காரணி (NFAT) மற்றும் குறிப்பிட்ட புரதம் 1 (Sp1), அருகிலுள்ள TNFα ஊக்குவிப்பாளருடன் MNA பிணைப்புக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன (30). TNFα ஊக்குவிப்பாளரில் 6 அடையாளம் காணப்பட்ட NFAT பிணைப்பு தளங்கள் மற்றும் 2 Sp1 பிணைப்பு தளங்கள் உள்ளன, அவை ஒரு தளத்தில் [-5'cap இலிருந்து 55 அடிப்படை ஜோடிகள் (bp)] (30) ஒன்றுடன் ஒன்று இணைகின்றன. குரோமாடின் இம்யூனோபிரசிபிட்டேஷன் (ChIP) MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்படும்போது, ​​TNFα ஊக்குவிப்பாளருடன் Sp1 இன் பிணைப்பு மூன்று மடங்கு அதிகரித்ததைக் காட்டியது. NFAT இன் ஒருங்கிணைப்பும் அதிகரித்து முக்கியத்துவத்தை நெருங்குகிறது (படம் 5B). இந்தத் தரவுகள், MNA, Sp1 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மூலம் TNFα இன் வெளிப்பாட்டையும், குறைந்த அளவிற்கு NFAT இன் வெளிப்பாட்டையும் ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
(A) MNA இல்லாமல் வளர்க்கப்பட்ட T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டின் மடிப்பு மாற்றம். SEM உடன் வெளிப்பாடு முறை காட்டப்பட்டுள்ளது (n = 5 ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர்கள்). குறைந்தது n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தரவைக் குறிக்கிறது. (B) NFAT மற்றும் Sp1 க்குப் பிறகு 8 mM MNA உடன் அல்லது இல்லாமல் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட T செல்களின் TNFα ஊக்குவிப்பாளர் 4 மணி நேரத்திற்கு (Ctrl) மற்றும் PMA/ionomycin தூண்டுதலுடன் இணைக்கப்பட்டார். இம்யூனோகுளோபுலின் G (IgG) மற்றும் H3 ஆகியவை முறையே நோயெதிர்ப்புத் தடுப்புக்கு எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ChIP இன் அளவீடு, MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களில் TNFα ஊக்குவிப்பாளருடன் Sp1 மற்றும் NFAT இன் பிணைப்பு கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது பல மடங்கு அதிகரித்ததைக் காட்டியது. குறைந்தது n = 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தரவைக் குறிக்கிறது. பல t-சோதனைகளால் தீர்மானிக்கப்படும் P மதிப்பு (*** P <0.01). (C) HGSC இன் ஆஸ்கைட்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​T செல்கள் (சைட்டோடாக்ஸிக் அல்லாதவை) கட்டியில் TNF இன் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டின. நிறங்கள் வெவ்வேறு நோயாளிகளைக் குறிக்கின்றன. காட்டப்படும் செல்கள் சீரற்ற முறையில் 300 ஆக மாதிரியாக எடுக்கப்பட்டு, அதிகப்படியான இழுவை கட்டுப்படுத்த நடுங்கியுள்ளன (** Padj = 0.0076). (D) கருப்பை புற்றுநோய்க்கான முன்மொழியப்பட்ட MNA மாதிரி. TME இல் உள்ள கட்டி செல்கள் மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களில் MNA உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது மற்றும் T செல்களால் எடுத்துக்கொள்ளப்படுகிறது. MNA, TNFα ஊக்குவிப்பாளருடன் Sp1 இன் பிணைப்பை அதிகரிக்கிறது, இது TNFα டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் TNFα சைட்டோகைன் உற்பத்தியை அதிகரிக்க வழிவகுக்கிறது. MNA IFN-γ இல் குறைவையும் ஏற்படுத்துகிறது. T செல் செயல்பாட்டைத் தடுப்பது கொல்லும் திறனைக் குறைத்து கட்டி வளர்ச்சியை துரிதப்படுத்துகிறது.
அறிக்கைகளின்படி, TNFα முன் மற்றும் பின் சார்ந்த கட்டி எதிர்ப்பு மற்றும் கட்டி எதிர்ப்பு விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் கருப்பை புற்றுநோயின் வளர்ச்சி மற்றும் மெட்டாஸ்டாசிஸை ஊக்குவிப்பதில் இது நன்கு அறியப்பட்ட பங்கைக் கொண்டுள்ளது (31-33). அறிக்கைகளின்படி, கருப்பை புற்றுநோயால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளில் ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி திசுக்களில் TNFα இன் செறிவு தீங்கற்ற திசுக்களை விட அதிகமாக உள்ளது (34-36). பொறிமுறையைப் பொறுத்தவரை, TNFα வெள்ளை இரத்த அணுக்களின் செயல்படுத்தல், செயல்பாடு மற்றும் பெருக்கத்தை ஒழுங்குபடுத்துகிறது மற்றும் புற்றுநோய் செல்களின் பினோடைப்பை மாற்றுகிறது (37, 38). இந்த கண்டுபிடிப்புகளுக்கு இணங்க, வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, ஆஸ்கைட்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது கட்டி திசுக்களில் உள்ள T செல்களில் TNF கணிசமாக அதிகமாகக் கட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 5C). TNF வெளிப்பாட்டின் அதிகரிப்பு சைட்டோடாக்ஸிக் அல்லாத பினோடைப்பைக் கொண்ட T செல் மக்கள்தொகையில் மட்டுமே தெளிவாகத் தெரிந்தது (படம் S5A). சுருக்கமாக, இந்த தரவுகள் HGSC இல் MNA இரட்டை நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு மற்றும் கட்டி ஊக்குவிக்கும் விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளது என்ற கருத்தை ஆதரிக்கின்றன.
ஓட்ட சைட்டோமெட்ரியை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிங், TIL வளர்சிதை மாற்றத்தைப் படிப்பதற்கான முக்கிய முறையாக மாறியுள்ளது. இந்த ஆய்வுகள், புற இரத்த லிம்போசைட்டுகள் அல்லது இரண்டாம் நிலை லிம்பாய்டு உறுப்புகளிலிருந்து வரும் T செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​முரைன் மற்றும் மனித TIL குளுக்கோஸை உறிஞ்சும் அதிக போக்கைக் கொண்டுள்ளன (4, 39) மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டின் படிப்படியான இழப்பு (19, 40) என்பதைக் காட்டுகின்றன. இந்த ஆய்வில் இதே போன்ற முடிவுகளை நாங்கள் கவனித்திருந்தாலும், முக்கிய வளர்ச்சி என்னவென்றால், கட்டி செல்கள் மற்றும் அதே பிரிக்கப்பட்ட கட்டி திசுக்களில் இருந்து TIL இன் வளர்சிதை மாற்றத்தை ஒப்பிடுவதாகும். இந்த முந்தைய அறிக்கைகளில் சிலவற்றிற்கு இணங்க, ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டிகளிலிருந்து வரும் கட்டி (CD45-EpCAM +) செல்கள் CD8 + மற்றும் CD4 + T செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலைக் கொண்டுள்ளன, இது கட்டி செல்களின் அதிக குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலை T செல்களுடன் ஒப்பிடலாம் என்பதை ஆதரிக்கிறது. T செல் போட்டியின் கருத்து. TME. இருப்பினும், கட்டி செல்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD8 + T செல்களை விட அதிகமாக உள்ளது, ஆனால் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாடு CD4 + T செல்களைப் போன்றது. இந்த முடிவுகள் கட்டி செல்களுக்கு ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றம் முக்கியமானது என்ற வளர்ந்து வரும் கருப்பொருளை வலுப்படுத்துகின்றன (41, 42). CD8 + T செல்கள் CD4 + T செல்களை விட ஆக்ஸிஜனேற்ற செயலிழப்புக்கு ஆளாகக்கூடும் என்றும், அல்லது CD4 + T செல்கள் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டை பராமரிக்க குளுக்கோஸைத் தவிர வேறு கார்பன் மூலங்களைப் பயன்படுத்தக்கூடும் என்றும் அவர்கள் பரிந்துரைக்கின்றனர் (43, 44). CD4 + T விளைவுக் கருவிகள், T விளைவுக் கருவி நினைவகம் மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகளில் T மைய நினைவக செல்கள் ஆகியவற்றுக்கு இடையே குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் எந்த வித்தியாசத்தையும் நாங்கள் கவனிக்கவில்லை என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். இதேபோல், கட்டிகளில் உள்ள CD8 + T செல்களின் வேறுபாடு நிலை குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதலில் ஏற்படும் மாற்றங்களுடன் எந்த தொடர்பும் இல்லை, இது விட்ரோவில் வளர்க்கப்பட்ட T செல்கள் மற்றும் விவோவில் மனித TIL (22) ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாட்டை எடுத்துக்காட்டுகிறது. இந்த அவதானிப்புகள் பாரபட்சமற்ற தானியங்கி செல் மக்கள்தொகை ஒதுக்கீட்டைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன, இது கட்டி செல்களை விட அதிக குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டைக் கொண்ட CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + செல்கள் பரவலாக உள்ளன, ஆனால் வளர்சிதை மாற்ற செயலில் உள்ள செல் மக்கள்தொகையைக் கொண்டுள்ளன என்பதை மேலும் வெளிப்படுத்தியது. இந்த மக்கள்தொகை scRNA-seq பகுப்பாய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட மைலோயிட் அடக்கி செல்கள் அல்லது பிளாஸ்மாசைட்டோயிட் டென்ட்ரிடிக் செல்களின் உத்வேக துணை மக்கள்தொகையைக் குறிக்கலாம். இவை இரண்டும் மனித கருப்பைக் கட்டிகளில் [45] பதிவாகியிருந்தாலும், அவற்றுக்கு இன்னும் தேவை இந்த மைலாய்டு துணை மக்கள்தொகையை விவரிப்பதே மேலும் பணி.
செல் வகைகளுக்கு இடையே குளுக்கோஸ் மற்றும் ஆக்ஸிஜனேற்ற வளர்சிதை மாற்றத்தில் உள்ள பொதுவான வேறுபாடுகளை ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி அடிப்படையிலான முறைகள் தெளிவுபடுத்த முடியும் என்றாலும், TME இல் மைட்டோகாண்ட்ரியல் வளர்சிதை மாற்றத்திற்கான குளுக்கோஸ் அல்லது பிற கார்பன் மூலங்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் துல்லியமான வளர்சிதை மாற்றங்கள் இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை. கொடுக்கப்பட்ட TIL துணைக்குழுவிற்கு வளர்சிதை மாற்றங்களின் இருப்பு அல்லது இல்லாமையை ஒதுக்குவதற்கு, வெளியேற்றப்பட்ட திசுக்களில் இருந்து செல் மக்கள்தொகையை சுத்திகரிக்க வேண்டும். எனவே, வெகுஜன நிறமாலை அளவோடு இணைந்து, எங்கள் செல் செறிவூட்டல் முறையானது, நோயாளி மாதிரிகளைப் பொருத்துவதில் T செல்கள் மற்றும் கட்டி செல் மக்கள்தொகையில் வேறுபட்ட முறையில் செறிவூட்டப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றங்கள் பற்றிய நுண்ணறிவுகளை வழங்க முடியும். இந்த முறை ஃப்ளோரசன்ஸ்-செயல்படுத்தப்பட்ட செல் வரிசையாக்கத்தை விட நன்மைகளைக் கொண்டிருந்தாலும், உள்ளார்ந்த நிலைத்தன்மை மற்றும்/அல்லது விரைவான வருவாய் விகிதம் காரணமாக சில வளர்சிதை மாற்ற நூலகங்கள் பாதிக்கப்படலாம் (22). இருப்பினும், எங்கள் முறை இரண்டு அங்கீகரிக்கப்பட்ட நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு வளர்சிதை மாற்றங்களான அடினோசின் மற்றும் கைனுரைனை அடையாளம் காண முடிந்தது, ஏனெனில் அவை மாதிரி வகைகளுக்கு இடையில் பெரிதும் வேறுபடுகின்றன.
கட்டிகள் மற்றும் TIL துணை வகைகளின் எங்கள் வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்வு, கருப்பை TME இல் வளர்சிதை மாற்றங்களின் பங்கு பற்றிய கூடுதல் நுண்ணறிவுகளை வழங்குகிறது. முதலாவதாக, ஓட்ட சைட்டோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி, கட்டிகள் மற்றும் CD4 + T செல்களுக்கு இடையில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் எந்த வித்தியாசமும் இல்லை என்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம். இருப்பினும், LC-MS/MS பகுப்பாய்வு இந்த மக்கள்தொகையில் வளர்சிதை மாற்றங்களின் மிகுதியில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களை வெளிப்படுத்தியது, இது TIL வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் அதன் ஒட்டுமொத்த வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு பற்றிய முடிவுகளுக்கு கவனமாக விளக்கம் தேவை என்பதைக் குறிக்கிறது. இரண்டாவதாக, MNA என்பது கட்டிகள் அல்ல, ஆஸ்கைட்டுகளில் CD45-செல்கள் மற்றும் T செல்களுக்கு இடையில் மிகப்பெரிய வேறுபாட்டைக் கொண்ட வளர்சிதை மாற்றமாகும். எனவே, பிரிவுப்படுத்தல் மற்றும் கட்டி இருப்பிடம் TIL வளர்சிதை மாற்றத்தில் வெவ்வேறு விளைவுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும், இது கொடுக்கப்பட்ட நுண்ணிய சூழலில் சாத்தியமான பன்முகத்தன்மையை எடுத்துக்காட்டுகிறது. மூன்றாவதாக, MNA-உற்பத்தி செய்யும் நொதி NNMT இன் வெளிப்பாடு முக்கியமாக CAF க்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது, இது குறைந்த அளவிற்கு கட்டி செல்கள், ஆனால் கண்டறியக்கூடிய MNA அளவுகள் கட்டியிலிருந்து பெறப்பட்ட T செல்களில் காணப்படுகின்றன. கருப்பை CAF இல் NNMT இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு புற்றுநோயை ஊக்குவிக்கும் விளைவைக் கொண்டுள்ளது, ஓரளவுக்கு CAF வளர்சிதை மாற்றம், கட்டி படையெடுப்பு மற்றும் மெட்டாஸ்டாஸிஸ் (27) ஆகியவற்றின் ஊக்குவிப்பு காரணமாக. TIL இன் ஒட்டுமொத்த நிலை மிதமானதாக இருந்தாலும், CAF இல் NNMT இன் வெளிப்பாடு புற்றுநோய் ஜீனோம் அட்லஸ் (TCGA) மெசன்கிமல் துணை வகையுடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது, இது மோசமான முன்கணிப்புடன் தொடர்புடையது (27, 46, 47). இறுதியாக, MNA சிதைவுக்கு காரணமான AOX1 நொதியின் வெளிப்பாடு CAF மக்கள்தொகைக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது, இது T செல்கள் MNA ஐ வளர்சிதைமாற்றம் செய்யும் திறனைக் கொண்டிருக்கவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த கண்டுபிடிப்பைச் சரிபார்க்க மேலும் வேலை தேவைப்பட்டாலும், T செல்களில் அதிக அளவு MNA நோயெதிர்ப்புத் தடுப்பு CAF நுண்ணிய சூழலின் இருப்பைக் குறிக்கலாம் என்ற கருத்தை இந்த முடிவுகள் ஆதரிக்கின்றன.
MNA டிரான்ஸ்போர்ட்டர்களின் குறைந்த வெளிப்பாடு நிலை மற்றும் MNA வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஈடுபட்டுள்ள முக்கிய புரதங்களின் கண்டறிய முடியாத அளவுகளைக் கருத்தில் கொண்டு, T செல்களில் MNA இருப்பது எதிர்பாராதது. NNMT அல்லது AOX1 இரண்டையும் scRNA-seq பகுப்பாய்வு மற்றும் இரண்டு சுயாதீன குழுமங்களின் இலக்கு qPCR மூலம் கண்டறிய முடியவில்லை. இந்த முடிவுகள் MNA T செல்களால் ஒருங்கிணைக்கப்படவில்லை, ஆனால் சுற்றியுள்ள TME இலிருந்து உறிஞ்சப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. இன் விட்ரோ சோதனைகள் T செல்கள் வெளிப்புற MNA ஐ குவிக்கும் போக்கைக் காட்டுகின்றன.
எங்கள் இன் விட்ரோ ஆய்வுகள், வெளிப்புற MNA, T செல்களில் TNFα வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது மற்றும் TNFα ஊக்குவிப்பாளருடன் Sp1 இன் பிணைப்பை மேம்படுத்துகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. TNFα, கட்டி எதிர்ப்பு மற்றும் கட்டி எதிர்ப்பு செயல்பாடுகளைக் கொண்டிருந்தாலும், கருப்பை புற்றுநோயில், TNFα கருப்பை புற்றுநோயின் வளர்ச்சியை ஊக்குவிக்கும் (31-33). கருப்பை கட்டி செல் வளர்ப்பில் TNFα ஐ நடுநிலையாக்குவது அல்லது சுண்டெலி மாதிரிகளில் TNFα சமிக்ஞையை நீக்குவது TNFα- மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட அழற்சி சைட்டோகைன் உற்பத்தியை மேம்படுத்தி கட்டி வளர்ச்சியைத் தடுக்கும் (32, 35). எனவே, இந்த விஷயத்தில், TME- பெறப்பட்ட MNA, ஆட்டோக்ரைன் லூப் மூலம் TNFα- சார்ந்த பொறிமுறையின் மூலம் அழற்சிக்கு எதிரான வளர்சிதை மாற்றமாக செயல்பட முடியும், இதன் மூலம் கருப்பை புற்றுநோய் ஏற்படுவதையும் பரவுவதையும் ஊக்குவிக்கிறது (31). இந்த சாத்தியக்கூற்றின் அடிப்படையில், கருப்பை புற்றுநோய்க்கான சாத்தியமான சிகிச்சை முகவராக TNFα முற்றுகை ஆய்வு செய்யப்படுகிறது (37, 48, 49). கூடுதலாக, MNA, கருப்பை கட்டி செல்களுக்கு CAR-T செல்களின் சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியை பாதிக்கிறது, இது MNA- மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட நோயெதிர்ப்பு ஒடுக்கத்திற்கு மேலும் ஆதாரங்களை வழங்குகிறது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் கட்டிகள் மற்றும் CAF செல்கள் MNA ஐ புற-செல் TME இல் சுரக்கும் ஒரு மாதிரியைக் குறிக்கின்றன. (i) TNF- தூண்டப்பட்ட கருப்பை புற்றுநோய் வளர்ச்சி தூண்டுதல் மற்றும் (ii) MNA- தூண்டப்பட்ட T செல் சைட்டோடாக்ஸிக் செயல்பாட்டுத் தடுப்பு மூலம், இது இரட்டை கட்டி விளைவைக் கொண்டிருக்கலாம் (படம் 5D).
முடிவில், விரைவான செல் செறிவூட்டல், ஒற்றை செல் வரிசைமுறை மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற விவரக்குறிப்பு ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், இந்த ஆய்வு HGSC நோயாளிகளில் கட்டிகள் மற்றும் ஆஸ்கைட்ஸ் செல்களுக்கு இடையே உள்ள மிகப்பெரிய நோயெதிர்ப்பு வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. இந்த விரிவான பகுப்பாய்வு, T செல்களுக்கு இடையில் குளுக்கோஸ் உறிஞ்சுதல் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் செயல்பாட்டில் வேறுபாடுகள் இருப்பதைக் காட்டியது, மேலும் MNA ஐ ஒரு செல் அல்லாத தன்னாட்சி நோயெதிர்ப்பு ஒழுங்குமுறை வளர்சிதை மாற்றமாக அடையாளம் கண்டுள்ளது. மனித புற்றுநோய்களில் TME எவ்வாறு T செல் வளர்சிதை மாற்றத்தை பாதிக்கிறது என்பதில் இந்தத் தரவு தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. T செல்கள் மற்றும் புற்றுநோய் செல்களுக்கு இடையே ஊட்டச்சத்துக்களுக்கான நேரடி போட்டி பதிவாகியிருந்தாலும், வளர்சிதை மாற்றங்கள் கட்டி வளர்ச்சியை ஊக்குவிக்கவும், எண்டோஜெனஸ் நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகளை அடக்கவும் மறைமுக கட்டுப்பாட்டாளர்களாகவும் செயல்படலாம். இந்த ஒழுங்குமுறை வளர்சிதை மாற்றங்களின் செயல்பாட்டுப் பங்கின் மேலும் விளக்கம், கட்டி எதிர்ப்பு நோயெதிர்ப்பு மறுமொழியை மேம்படுத்துவதற்கான மாற்று உத்திகளைத் திறக்கக்கூடும்.
நோயாளி மாதிரிகள் மற்றும் மருத்துவத் தரவுகள் கனடிய திசு களஞ்சிய வலையமைப்பால் சான்றளிக்கப்பட்ட BC புற்றுநோய் கட்டி திசு களஞ்சியத்தின் மூலம் பெறப்பட்டன. BC புற்றுநோய் ஆராய்ச்சி நெறிமுறைகள் குழு மற்றும் பிரிட்டிஷ் கொலம்பியா பல்கலைக்கழகம் (H07-00463) அங்கீகரித்த நெறிமுறையின்படி, அனைத்து நோயாளிகளின் மாதிரிகள் மற்றும் மருத்துவத் தரவுகளும் தகவலறிந்த எழுத்துப்பூர்வ ஒப்புதலைப் பெற்றன அல்லது முறையாக அவர்களின் ஒப்புதலைத் தள்ளுபடி செய்தன. மாதிரிகள் சான்றளிக்கப்பட்ட பயோபேங்கில் (BRC-00290) சேமிக்கப்படுகின்றன. விரிவான நோயாளி பண்புகள் அட்டவணைகள் S1 மற்றும் S5 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. கிரையோபிரெசர்வேஷனுக்காக, நோயாளியின் கட்டி மாதிரியை இயந்திரத்தனமாக சிதைத்து, பின்னர் ஒரு ஒற்றை செல் இடைநீக்கத்தைப் பெற 100-மைக்ரான் வடிகட்டி வழியாக தள்ள ஒரு ஸ்கால்பெல் பயன்படுத்தப்படுகிறது. நோயாளியின் ஆஸ்கைட்டுகள் 1500 rpm இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 4°C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு செல்களைத் துளைத்து சூப்பர்நேட்டண்டை அகற்றின. கட்டி மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட செல்கள் 50% வெப்ப-செயல்படுத்தப்படாத மனித AB சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்), 40% RPMI-1640 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 10% டைமெத்தில் சல்பாக்சைடு ஆகியவற்றில் கிரையோபிரீசர்வ் செய்யப்பட்டன. இந்த பாதுகாக்கப்பட்ட ஒற்றை செல் இடைநீக்கங்கள் உருக்கப்பட்டு, கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ள வளர்சிதை மாற்ற மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற தீர்மானத்திற்கு பயன்படுத்தப்பட்டன.
முழுமையான ஊடகம் 0.22 μm வடிகட்டப்பட்ட 50:50 துணை RPMI 1640: AimV ஐக் கொண்டுள்ளது. RPMI 1640 + 2.05 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) 10% வெப்ப-செயல்படுத்தப்படாத மனித AB சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்), 12.5 mM ஹெப்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்), 2 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், 1 x பென்சிலின் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (பென்ஸ்ட்ரெப்) கரைசல் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 50 μMB-மெர்காப்டோஎத்தனால் ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது. AimV (இன்விட்ரஜன்) 20 mM ஹெப்ஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் 2 mM l-குளுட்டமைன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது. ஓட்ட சைட்டோமீட்டர் கறை தாங்கல் 0.22μm வடிகட்டப்பட்ட பாஸ்பேட் பஃபர் செய்யப்பட்ட உப்பு (PBS; இன்விட்ரஜன்) 3% வெப்ப-செயல்படுத்தப்படாத AB மனித சீரம் (சிக்மா) உடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது. செல் செறிவூட்டல் இடையகம் 0.22μm வடிகட்டப்பட்ட PBS ஐக் கொண்டுள்ளது மற்றும் 0.5% வெப்ப-செயலிழக்கச் செய்யப்பட்ட மனித AB சீரம் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) உடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது.
37°C முழுமையான ஊடகத்தில், செல்கள் 10 nM MT DR மற்றும் 100 μM 2-NBDG உடன் 30 நிமிடங்களுக்கு கறை படிந்தன. அடுத்து, செல்கள் 4°C இல் 15 நிமிடங்களுக்கு விபிலிட்டி சாய eF506 உடன் கறை படிந்தன. FC Block (eBioscience) மற்றும் Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) இல் உள்ள செல்களை மீண்டும் இணைத்து, ஃப்ளோ சைட்டோமீட்டர் ஸ்டெய்னிங் பஃபரில் (உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி) நீர்த்துப்போகச் செய்து, அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். 4°C இல் ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி ஸ்டெய்னிங் பஃபரில் 20 நிமிடங்களுக்கு ஆன்டிபாடிகளின் தொகுப்பைக் கொண்டு (டேபிள் S2) செல்களை கறை படிய வைக்கவும். பகுப்பாய்விற்கு முன் ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி ஸ்டெய்னிங் பஃபரில் (சைடெக் அரோரா; 3L-16V-14B-8R உள்ளமைவு) செல்களை மீண்டும் இணைத்து. செல் எண்ணிக்கை தரவை பகுப்பாய்வு செய்ய ஸ்பெக்ட்ரோஃப்ளோ மற்றும் ஃப்ளோஜோ V10 ஐப் பயன்படுத்தவும், மேலும் தரவை உருவாக்க கிராப்பேட் பிரிசம் 8 ஐப் பயன்படுத்தவும். 2-NBDG மற்றும் MT DR இன் சராசரி ஃப்ளோரசன்ஸ் தீவிரம் (MFI) பதிவு-இயல்பாக்கப்பட்டது, பின்னர் பொருந்தக்கூடிய நோயாளிகளைக் கணக்கிட புள்ளிவிவர பகுப்பாய்விற்கு ஒரு ஜோடி t சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டது. பகுப்பாய்விலிருந்து 40 க்கும் குறைவான நிகழ்வுகளைக் கொண்ட அனைத்து மக்கள்தொகைகளையும் அகற்றவும்; புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு மற்றும் தரவு காட்சிப்படுத்தலைச் செய்வதற்கு முன் ஏதேனும் எதிர்மறை மதிப்புகளுக்கு 1 என்ற MFI மதிப்பை உள்ளிடவும்.
மேலே உள்ள செயல்முறைப் பலகத்தின் கையேடு கேட்டிங் உத்தியை நிரப்ப, FlowJo இல் இறந்த செல்களை நீக்கிய பிறகு, செல்களை தானாகவே மக்கள்தொகைக்கு ஒதுக்க, வடிவக் கட்டுப்பாட்டு மரத்தின் (FAUST) (21) முழு குறிப்பையும் நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். தவறாக ஒதுக்கப்பட்டதாகத் தோன்றும் மக்கள்தொகைகளை (PD1+ ஐ PD1-கட்டி செல்களுடன் இணைத்து) மற்றும் தக்கவைக்கப்பட்ட மக்கள்தொகைகளை ஒன்றிணைக்க வெளியீட்டை நாங்கள் கைமுறையாக நிர்வகிக்கிறோம். ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் மொத்தம் 11 மக்கள்தொகைகளுக்கு சராசரியாக 2% க்கும் அதிகமான செல்கள் உள்ளன.
லுகோசைட் பிரிப்பு தயாரிப்புகளிலிருந்து (STEMCELL டெக்னாலஜிஸ்) PBMC ஐ பிரிக்க ஃபிகால் சாய்வு அடர்த்தி மையவிலக்கு பயன்படுத்தப்பட்டது. CD8 + T செல்கள் CD8 மைக்ரோபீட்ஸ் (மில்டென்யி) ஐப் பயன்படுத்தி PBMC இலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி 2 வாரங்களுக்கு TransAct (மில்டென்யி) ஐப் பயன்படுத்தி முழுமையான ஊடகத்தில் விரிவாக்கப்பட்டன. செல்கள் IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) கொண்ட முழுமையான ஊடகத்தில் 5 நாட்கள் நிற்க அனுமதிக்கப்பட்டன, பின்னர் TransAct உடன் மீண்டும் தூண்டப்பட்டன. 7 ஆம் நாள், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, மனித CD45 மைக்ரோபீட்ஸ் (மில்டென்யி) தொடர்ச்சியான மூன்று சுற்றுகளில் செல்களை வளப்படுத்த பயன்படுத்தப்பட்டன. ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி பகுப்பாய்விற்காக செல்கள் அலிகோட் செய்யப்பட்டன (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி), மேலும் LC-MS/MS பகுப்பாய்விற்காக ஒரு மில்லியன் செல்கள் மூன்று முறை அலிகோட் செய்யப்பட்டன. கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி மாதிரிகள் LC-MS/MS ஆல் செயலாக்கப்பட்டன. காணாமல் போன வளர்சிதை மாற்ற மதிப்பை 1,000 அயன் எண்ணுடன் மதிப்பிட்டோம். ஒவ்வொரு மாதிரியும் மொத்த அயனி எண்ணால் (TIC) இயல்பாக்கப்படுகிறது, மடக்கை ரீதியாக மாற்றப்பட்டு பகுப்பாய்விற்கு முன் MetaboAnalystR இல் தானாகவே இயல்பாக்கப்படுகிறது.
ஒவ்வொரு நோயாளியின் ஒற்றை செல் இடைநீக்கமும் உருகி, 40 μm வடிகட்டி மூலம் முழுமையான ஊடகத்தில் வடிகட்டப்பட்டது (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி). உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, மைக்ரோபீட்ஸ் (மில்டென்யி) ஐப் பயன்படுத்தி காந்த மணி பிரிப்பு மூலம் தொடர்ச்சியான மூன்று சுற்று நேர்மறை தேர்வு CD8+, CD4+ மற்றும் CD45- செல்களுக்கான மாதிரிகளை (பனியில்) வளப்படுத்த பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, செல்கள் செல் செறிவூட்டல் இடையகத்தில் (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி) மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு எண்ணப்படுகின்றன. செல்கள் 4°C இல் 15 நிமிடங்களுக்கு மனித CD8 மணிகள், மனித CD4 மணிகள் அல்லது மனித CD45 மணிகள் (மில்டென்யி) மூலம் அடைகாக்கப்பட்டன, பின்னர் செல் செறிவூட்டல் இடையகத்தால் கழுவப்பட்டன. மாதிரி LS நெடுவரிசை (மில்டென்யி) வழியாக அனுப்பப்படுகிறது, மேலும் நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறை பின்னங்கள் சேகரிக்கப்படுகின்றன. கால அளவைக் குறைத்து செல் மீட்பு படியை அதிகரிக்க, CD8- பின்னம் பின்னர் CD4+ செறிவூட்டலின் இரண்டாவது சுற்றுக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் CD4- பின்னம் அடுத்தடுத்த CD45-செறிவூட்டலுக்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. பிரிப்பு செயல்முறை முழுவதும் கரைசலை பனியில் வைத்திருங்கள்.
வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்விற்கான மாதிரிகளைத் தயாரிக்க, செல்கள் ஒரு முறை ஐஸ்-குளிர் உப்பு கரைசலில் கழுவப்பட்டு, ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் 1 மில்லி 80% மெத்தனால் சேர்க்கப்பட்டு, பின்னர் சுழல் செய்யப்பட்டு திரவ நைட்ரஜனில் உறைந்தன. மாதிரிகள் மூன்று முறை உறைதல்-உருகும் சுழற்சிகளுக்கு உட்படுத்தப்பட்டு, 14,000 rpm இல் 15 நிமிடங்களுக்கு 4°C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன. வளர்சிதை மாற்றங்களைக் கொண்ட சூப்பர்நேட்டண்ட் உலரும் வரை ஆவியாகிறது. வளர்சிதை மாற்றங்கள் 50 μl 0.03% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, கலக்க சுழல் செய்யப்பட்டு, பின்னர் குப்பைகளை அகற்ற மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி வளர்சிதை மாற்றங்களை பிரித்தெடுக்கவும். வளர்சிதை மாற்ற ஆராய்ச்சிக்காக சூப்பர்நேட்டண்டை உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ குரோமடோகிராபி பாட்டிலுக்கு மாற்றவும். தொகுதி விளைவுகளைத் தடுக்க ஒவ்வொரு மாதிரியையும் ஒரே எண்ணிக்கையிலான செல்களுடன் சிகிச்சையளிக்க ஒரு சீரற்ற சிகிச்சை நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தவும். AB SCIEX QTRAP 5500 டிரிபிள் குவாட்ரூபோல் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (50) முன்னர் வெளியிடப்பட்ட உலகளாவிய வளர்சிதை மாற்றங்களின் தரமான மதிப்பீட்டை நாங்கள் செய்தோம். குரோமடோகிராஃபிக் பகுப்பாய்வு மற்றும் உச்ச பகுதி ஒருங்கிணைப்பு மல்டிகுவாண்ட் பதிப்பு 2.1 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் SCIEX) செய்யப்பட்டது.
காணாமல் போன வளர்சிதை மாற்ற மதிப்பை மதிப்பிடுவதற்கு 1000 அயனி எண்ணிக்கை பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் ஒவ்வொரு மாதிரியின் TIC, மாதிரி செயலாக்கத்திலிருந்து கருவி பகுப்பாய்வால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட மாற்றங்களை சரிசெய்ய ஒவ்வொரு கண்டறியப்பட்ட வளர்சிதை மாற்றத்தின் இயல்பாக்கப்பட்ட உச்ச பகுதியைக் கணக்கிடப் பயன்படுத்தப்பட்டது. TIC இயல்பாக்கப்பட்ட பிறகு, மெட்டாபோஅனலிஸ்ட்ஆர்(51) (இயல்புநிலை அளவுரு) மடக்கை மாற்றம் மற்றும் தானியங்கி விதிமுறை வரி அளவிடுதலுக்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. மாதிரி வகைகளுக்கு இடையிலான வளர்சிதை மாற்ற வேறுபாடுகளின் ஆய்வு பகுப்பாய்வைச் செய்ய வீகன் ஆர் தொகுப்புடன் கூடிய PCA ஐப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் நோயாளிகளை பகுப்பாய்வு செய்ய பகுதியளவு பணிநீக்க பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தினோம். மாதிரிகளுக்கு இடையேயான யூக்ளிடியன் தூரத்தை தொகுக்க வெப்ப வரைபட டென்ட்ரோகிராமை உருவாக்க வார்டு முறையைப் பயன்படுத்தவும். முழு செல் வகை மற்றும் நுண்ணிய சூழலிலும் வேறுபட்ட முறையில் ஏராளமான வளர்சிதை மாற்றங்களை அடையாளம் காண தரப்படுத்தப்பட்ட வளர்சிதை மாற்ற மிகுதியில் லிம்மா (52) ஐப் பயன்படுத்தினோம். விளக்கத்தை எளிமைப்படுத்த, மாதிரியைக் குறிப்பிட குழு சராசரி அளவுருவைப் பயன்படுத்துகிறோம், மேலும் நுண்ணிய சூழலில் உள்ள செல் வகைகளை ஒவ்வொரு குழுவாகவும் கருதுகிறோம் (n = 6 குழுக்கள்); முக்கியத்துவ சோதனைக்காக, ஒவ்வொரு வளர்சிதை மாற்றத்திற்கும் மூன்று முறை மீண்டும் மீண்டும் அளவீடுகளைச் செய்தோம். தவறான நகலெடுப்பைத் தவிர்ப்பதற்காக, நோயாளி லிம்மா வடிவமைப்பில் ஒரு தடையாக சேர்க்கப்பட்டார். வெவ்வேறு நோயாளிகளுக்கு இடையிலான வளர்சிதை மாற்றங்களில் உள்ள வேறுபாடுகளைச் சரிபார்க்க, நோயாளிகள் உட்பட லிம்மா மாதிரியை ஒரு நிலையான வழியில் சரிசெய்தோம். செல் வகைக்கும் Padj <0.05 (பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் திருத்தம்) இன் நுண்ணிய சூழலுக்கும் இடையிலான முன்னரே குறிப்பிடப்பட்ட வேறுபாட்டின் முக்கியத்துவத்தை நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம்.
மில்டென்யி டெட் செல் ரிமூவல் கிட் (> 80% நம்பகத்தன்மை) பயன்படுத்தி வீரியம் செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு, 10x 5′ மரபணு வெளிப்பாடு நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி மொத்த நேரடி உறைந்த ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி மாதிரிகளில் ஒற்றை செல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் வரிசைமுறை செய்யப்பட்டது. பொருந்தக்கூடிய கட்டிகள் மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகள் கொண்ட ஐந்து வழக்குகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, இருப்பினும் ஒரு கட்டி மாதிரியிலிருந்து குறைந்த நம்பகத்தன்மை அதன் சேர்க்கையைத் தடுத்தது. நோயாளிகளின் பல தேர்வுகளை அடைவதற்காக, 10x குரோமியம் கட்டுப்படுத்தியின் பாதைகளில் ஒவ்வொரு நோயாளியின் மாதிரிகளையும் இணைத்து, ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி தளங்களை தனித்தனியாக பகுப்பாய்வு செய்தோம். வரிசைப்படுத்திய பிறகு [இல்லுமினா ஹைசெக் 4000 28×98 பிபி ஜோடி முனை (PE), கியூபெக் மரபணு; கட்டி மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகளுக்கு முறையே ஒரு செல்லுக்கு சராசரியாக 73,488 மற்றும் 41,378 வாசிப்புகள்]], நாங்கள் CellSNP மற்றும் Vireo (53) ஐப் பயன்படுத்தினோம் (CellSNP ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டது GRCh38 ஆல் வழங்கப்படும் பொதுவான மனித SNP (VCF) ஒரு நன்கொடையாளர் அடையாளம் ஒதுக்கப்பட்டுள்ளது. நோயாளியின் மரபணு வகை நிலையின் (IBS) மிக நெருக்கமான அடையாளத்தை (IBS) ஊகிக்க SNPRelate ஐப் பயன்படுத்துகிறோம், டூப்ளெக்ஸ்களாக அடையாளம் காணப்படாத செல்கள் மற்றும் செல்கள் மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகள் மற்றும் கட்டி மாதிரிகளுக்கு இடையில் பொருந்தக்கூடிய நன்கொடையாளர்களைத் தவிர்த்து (54). இந்தப் பணியின் அடிப்படையில், டவுன்ஸ்ட்ரீம் பகுப்பாய்விற்காக கட்டி மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகளில் ஏராளமான செல் பிரதிநிதித்துவத்துடன் மூன்று நிகழ்வுகளை நாங்கள் தக்க வைத்துக் கொண்டோம். ஸ்கேட்டர் (55) மற்றும் ஸ்க்ரான் (56) பயோகண்டக்டர் பேக்கேஜிங்கில் ஒரு வெகுஜன வடிகட்டுதல் படியைச் செய்த பிறகு, இது பகுப்பாய்விற்காக 6975 செல்களை (முறையே கட்டி மற்றும் ஆஸ்கைட்டுகளிலிருந்து 2792 மற்றும் 4183 செல்கள்) வழங்கியது. பகிரப்பட்ட அருகிலுள்ள அண்டை நெட்வொர்க்கின் (SNN) இகிராஃப்பின் (57) லூவைன் கிளஸ்டரிங்கைப் பயன்படுத்துகிறோம். வெளிப்பாடு மூலம் கிளஸ்டர் செல்களுக்கு ஜாகார்டு தூரத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது. மார்க்கர் மரபணு வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் உத்தேச செல் வகைகளுக்கு கொத்துகள் கைமுறையாகக் குறிப்பிடப்பட்டு t-SNE உடன் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. சைட்டோடாக்ஸிக் T செல்கள் CD8A மற்றும் GZMA இன் வெளிப்பாட்டால் வரையறுக்கப்படுகின்றன, குறைந்த ரைபோசோமால் புரத வெளிப்பாடு கொண்ட துணைக் கொத்துகளைத் தவிர்த்து. இசார் மற்றும் பலரின் வெளியிடப்பட்ட தரவை நாங்கள் அணுகினோம். (16), அவற்றின் t-SNE உட்பொதித்தல் உட்பட, நோயெதிர்ப்பு செல் குறிப்பான்கள் மற்றும் NNMT வெளிப்பாட்டிற்கு இடையிலான வெளிப்பாடு மேலெழுதலைக் கட்டுப்படுத்த முடியும்.
ஃபிகால் சாய்வு அடர்த்தி மையவிலக்கு மூலம் லுகோசைட் பிரிப்பு தயாரிப்புகளிலிருந்து (STEMCELL டெக்னாலஜிஸ்) PBMC பிரிக்கப்பட்டது. CD3 மணிகள் (மில்டென்யி) பயன்படுத்தி CD3 + செல்கள் PBMC இலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. MNA முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில், CD3+ செல்கள் தட்டு-கட்டப்பட்ட CD3 (5μg/ml), கரையக்கூடிய CD28 (3μg/ml) மற்றும் IL-2 (300 U/ml; Proleukin) மூலம் செயல்படுத்தப்பட்டன. விரிவாக்கத்தின் கடைசி நாளில், நம்பகத்தன்மை (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) மற்றும் பெருக்கம் (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ஆகியவை ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி மூலம் மதிப்பிடப்பட்டன. கோல்கிஸ்டாப்பைப் பயன்படுத்தி PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1μg/ml) கொண்ட செல்களைத் தூண்டுவதன் மூலம் விளைவு செயல்பாட்டை மதிப்பிடுங்கள், மேலும் CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) மற்றும் TNFα-ஃப்ளோரசெசின் ஐசோதியோசயனேட் (FITC) (MAb11, BD) ஆகியவற்றை 4 மணி நேரம் கண்காணிக்கவும். PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1μg/ml) உடன் qPCR மற்றும் ChIP செல்களை 4 மணி நேரம் தூண்டவும். PMA (20 ng/ml) மற்றும் அயனோமைசின் (1 μg/ml) உடன் தூண்டுதலுக்கு முன்னும் பின்னும் ELISA சூப்பர்நேட்டண்ட் 4 மணி நேரம் சேகரிக்கப்பட்டது.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தி RNA ஐ தனிமைப்படுத்த உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையைப் பின்பற்றவும். மாதிரியை ஒரே மாதிரியாக மாற்ற QIAshredder (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தவும். நிரப்பு DNA (cDNA) ஐ ஒருங்கிணைக்க அதிக திறன் கொண்ட RNA ஐ cDNA கிட் (Thermo Fisher Scientific) க்கு பயன்படுத்தவும். பின்வரும் ஆய்வுகளுடன் மரபணு வெளிப்பாட்டை (உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி) அளவிட TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ஐப் பயன்படுத்தவும்: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ஹைட்ரஜனில் இருந்து கிளைசெரால்டிஹைட்-3-பாஸ்பேட் (GAPDH)] மற்றும் Hs01010726_m1 (SLC22A2). மாதிரிகள் மைக்ரோஆம்ப் ஆப்டிகல் படலத்துடன் மைக்ரோஆம்ப் ஃபாஸ்ட் ஆப்டிகல் 96-கிணறு எதிர்வினைத் தட்டில் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்) ஸ்டெப்ஒன்பிளஸ் நிகழ்நேர PCR அமைப்பில் (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்) (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ்) இயக்கப்பட்டன. 35 ஐத் தாண்டிய எந்த Ct மதிப்பும் கண்டறிதல் வரம்பை விட அதிகமாகக் கருதப்படுகிறது மற்றும் கண்டறிய முடியாததாகக் குறிக்கப்படுகிறது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ChIP ஐச் செய்யவும் (58). சுருக்கமாக, செல்கள் ஃபார்மால்டிஹைடுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டு (இறுதி செறிவு 1.42%) அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன. 10 நிமிடங்களுக்கு பனியில் கூடுதல் வீக்க இடையகத்தை (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl மற்றும் 0.1% NP-40) பயன்படுத்தவும், பின்னர் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி இம்யூனோபிரசிபிட்டேஷன் பஃபரில் மீண்டும் இணைக்கவும் (58). பின்னர் மாதிரி பின்வரும் சுழற்சிகளுடன் ஒலியமைக்கப்பட்டது: 10 சுழற்சிகள் (20 1-வினாடி துடிப்புகள்) மற்றும் 40 வினாடிகள் நிலையான நேரம். ChIP-தர இம்யூனோகுளோபுலின் G (செல் சிக்னலிங் தொழில்நுட்பம்; 1μl), ஹிஸ்டோன் H3 (செல் சிக்னலிங் தொழில்நுட்பம்; 3μl), NFAT (இன்விட்ரஜன்; 3μl) மற்றும் SP1 (செல் சிக்னலிங் தொழில்நுட்பம்; 3μl) ஆன்டிபாடிகளை ஒரே இரவில் 4°CC குலுக்கலில் மாதிரியுடன் அடைகாக்கவும். புரதம் A மணிகளை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மாதிரியுடன் 4°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் மெதுவாக குலுக்கி, பின்னர் DNA ஐ வளப்படுத்த செலக்ஸ் மணிகளை (பயோ-ராட்) பயன்படுத்தவும், புரத செரிமானத்திற்கு புரோட்டினேஸ் K (தெர்மோ ஃபிஷர்) பயன்படுத்தவும். TNFα ஊக்கி PCR ஆல் கண்டறியப்பட்டது: முன்னோக்கி, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; மாறாக, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp தயாரிப்பு). படங்கள் இமேஜ் லேப் (பயோ-ராட்) ஆல் தயாரிக்கப்பட்டு இமேஜ்ஜே மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி செல் வளர்ப்பு சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டது. மனித TNFα ELISA கிட் (இன்விட்ரஜன்), மனித IL-2 ELISA கிட் (இன்விட்ரஜன்) மற்றும் மனித IFN-γ ELISA கிட் (அப்கேம்) ஆகியவற்றின் உற்பத்தியாளரின் நடைமுறைகளின்படி இந்த தீர்மானம் மேற்கொள்ளப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, சூப்பர்நேட்டண்ட் TNFα மற்றும் IL-2 ஐக் கண்டறிய 1:100 என்ற விகிதத்திலும், IFN-γ ஐக் கண்டறிய 1:3 என்ற விகிதத்திலும் நீர்த்தப்பட்டது. 450 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிட EnVision 2104 மல்டிலேபிள் ரீடர் (பெர்கின்எல்மர்) ஐப் பயன்படுத்தவும்.
ஃபிகால் சாய்வு அடர்த்தி மையவிலக்கு மூலம் லுகோசைட் பிரிப்பு தயாரிப்புகளிலிருந்து (ஸ்டெம்செல் டெக்னாலஜிஸ்) பிபிஎம்சி பிரிக்கப்பட்டது. சிடி3 மணிகள் (மில்டென்யி) பயன்படுத்தி சிடி3 + செல்கள் பிபிஎம்சியிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. எம்என்ஏ முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில், சிடி3 + செல்கள் தகடு-கட்டப்பட்ட சிடி3 (5μg/மிலி), கரையக்கூடிய சிடி28 (3μg/மிலி) மற்றும் ஐஎல்-2 (300 யு/மிலி; புரோலூகின்) ஆகியவற்றைக் கொண்டு 3 நாட்களுக்கு செயல்படுத்தப்பட்டன. 3 நாட்களுக்குப் பிறகு, செல்கள் சேகரிக்கப்பட்டு 0.9% உப்புநீரில் கழுவப்பட்டு, துகள் உறைந்தன. 123 கவுண்ட் இபீட்களைப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி (சைடெக் அரோரா; 3L-16V-14B-8R உள்ளமைவு) மூலம் செல் எண்ணிக்கை செய்யப்பட்டது.
மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி வளர்சிதை மாற்றங்களைப் பிரித்தெடுக்கவும். உலர்ந்த சாறு 4000 செல் சமமானவை/μl செறிவில் மறுசீரமைக்கப்பட்டது. தலைகீழ்-கட்ட குரோமடோகிராபி (1290 இன்ஃபினிட்டி II, அஜிலன்ட் டெக்னாலஜிஸ், சாண்டா கிளாரா, CA) மற்றும் CORTECS T3 நெடுவரிசை (2.1×150 மிமீ, துகள் அளவு 1.6-μm, துளை அளவு 120-Å; #186008500, வாட்டர்ஸ்) மூலம் மாதிரியை பகுப்பாய்வு செய்யவும். துருவ நிறை நிறமாலை (6470, அஜிலன்ட்), இதில் எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் நேர்மறை பயன்முறையில் செயல்படுகிறது. மொபைல் கட்டம் A 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் (H2O இல்), மொபைல் கட்டம் B 90% அசிட்டோனிட்ரைல், 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம். LC சாய்வு 100% A க்கு 0 முதல் 2 நிமிடங்கள், 99% B க்கு 2 முதல் 7.1 நிமிடங்கள் மற்றும் 99% B க்கு 7.1 முதல் 8 நிமிடங்கள் ஆகும். பின்னர் 0.6 மிலி/நிமிடம் என்ற ஓட்ட விகிதத்தில் 3 நிமிடங்களுக்கு மொபைல் கட்டம் A உடன் நெடுவரிசையை மீண்டும் சமப்படுத்தவும். ஓட்ட விகிதம் 0.4 மிலி/நிமிடம், மேலும் நெடுவரிசை அறை 50°C க்கு வெப்பப்படுத்தப்படுகிறது. தக்கவைப்பு நேரம் (RT) மற்றும் உருமாற்றத்தை நிறுவ MNA இன் தூய வேதியியல் தரநிலையை (M320995, டொராண்டோ ஆராய்ச்சி வேதியியல் நிறுவனம், வடக்கு யார்க், ஒன்டாரியோ, கனடா) பயன்படுத்தவும் (RT = 0.882 நிமிடங்கள், உருமாற்றம் 1 = 137→94.1, உருமாற்றம் 2 = 137→92, உருமாற்றம் 3 = 137→78). மூன்று மாற்றங்களும் சரியான தக்கவைப்பு நேரத்தில் நிகழும்போது, ​​குறிப்பிட்ட தன்மையை உறுதிப்படுத்த அளவீட்டுக்கு மாற்றம் 1 பயன்படுத்தப்படுகிறது. MNA (டொராண்டோ ஆராய்ச்சி வேதியியல் நிறுவனம்) இன் நிலையான வளைவு, ஸ்டாக் கரைசலின் ஆறு தொடர் நீர்த்தல்களால் (1 mg/ml) உருவாக்கப்பட்டது, இது முறையே 0.1, 1.0, 10 மற்றும் 100 ng/ml மற்றும் 1.0 மற்றும் 10μg/ml திரவத்தின் தரங்களைப் பெறுகிறது. கண்டறிதல் வரம்பு 1 ng/ml, மற்றும் நேரியல் பதில் 10 ng/ml மற்றும் 10μg/ml க்கு இடையில் உள்ளது. மாதிரி மற்றும் தரநிலையின் இரண்டு மைக்ரோலிட்டர்களின் ஒவ்வொரு ஊசியும் LC/MS பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் பகுப்பாய்வு தளத்தின் நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக ஒவ்வொரு எட்டு ஊசிகளுக்கும் ஒரு கலப்பு தரக் கட்டுப்பாட்டு மாதிரி இயக்கப்படுகிறது. அனைத்து MNA-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல் மாதிரிகளின் MNA பதில்களும் மதிப்பீட்டின் நேரியல் வரம்பிற்குள் இருந்தன. தரவு பகுப்பாய்வு MassHunter அளவு பகுப்பாய்வு மென்பொருளைப் (v9.0, Agilent) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.
இரண்டாம் தலைமுறை αFR-CAR கட்டமைப்பு சாங் மற்றும் பலரிடமிருந்து எடுக்கப்பட்டது. (59). சுருக்கமாக, இந்த கட்டமைப்பு பின்வரும் உள்ளடக்கங்களைக் கொண்டுள்ளது: CD8a லீடர் வரிசை, மனித αFR-குறிப்பிட்ட ஒற்றை-சங்கிலி மாறி துண்டு, CD8a கீல் மற்றும் டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் பகுதி, CD27 இன்ட்ராசெல்லுலர் டொமைன் மற்றும் CD3z இன்ட்ராசெல்லுலர் டொமைன். முழுமையான CAR வரிசை GenScript ஆல் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது, பின்னர் டிரான்ஸ்டக்ஷன் செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் GFP எக்ஸ்பிரஷன் கேசட்டின் மேல்நோக்கி இரண்டாம் தலைமுறை லென்டிவைரல் எக்ஸ்பிரஷன் வெக்டரில் குளோன் செய்யப்பட்டது.
லென்டிவைரஸ் HEK293T செல்களை டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் செய்வதன் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது [அமெரிக்கன் டைப் கல்ச்சர் கலெக்ஷன் (ATCC); 10% ஃபெடல் போவின் சீரம் (FBS) மற்றும் 1% பென்ஸ்ட்ரெப் கொண்ட டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள் ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படுகிறது, மேலும் CAR-GFP வெக்டரைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் பேக்கேஜிங் பிளாஸ்மிடுகள் (psPAX2 மற்றும் pMD2.G, Addgene) லிபோஃபெக்ஷன் அமீனை (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) பயன்படுத்துகின்றன. வைரஸ் கொண்ட சூப்பர்நேட்டண்ட் டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷனுக்கு 48 மற்றும் 72 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு சேகரிக்கப்பட்டு, வடிகட்டப்பட்டு, அல்ட்ராசென்ட்ரிஃபிகேஷன் மூலம் செறிவூட்டப்பட்டது. செறிவூட்டப்பட்ட வைரஸ் சூப்பர்நேட்டண்டை -80°C இல் டிரான்ஸ்டக்ஷன் வரை சேமிக்கவும்.
ஃபிகோல் சாய்வு அடர்த்தி மையவிலக்கு மூலம் ஆரோக்கியமான நன்கொடையாளர் லுகோசைட் பிரிப்பு தயாரிப்புகளிலிருந்து (STEMCELL டெக்னாலஜிஸ்) PBMC பிரிக்கப்படுகிறது. PBMC இலிருந்து CD8+ செல்களை தனிமைப்படுத்த நேர்மறை தேர்வு CD8 மைக்ரோபீட்களை (Miltenyi) பயன்படுத்தவும். T செல்களை TransAct (Miltenyi) மற்றும் TexMACS ஊடகத்தில் தூண்டவும் [Miltenyi; 3% வெப்ப-செயலிழக்கப்பட்ட மனித சீரம், 1% PenStrep மற்றும் IL-2 (300 U/ml) உடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது]. தூண்டுதலுக்கு இருபத்தி நான்கு மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, T செல்கள் லென்டிவைரஸுடன் (106 செல்களுக்கு 10 μl செறிவூட்டப்பட்ட வைரஸ் சூப்பர்நேட்டண்ட்) கடத்தப்பட்டன. சைடெக் அரோராவில் (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ இல் கடத்தலுக்குப் பிறகு 1 முதல் 3 நாட்கள் வரை), குறைந்தபட்சம் 30% கடத்தும் செயல்திறனை நிரூபிக்க செல்களின் GFP வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடுங்கள்.
CAR-T செல்கள் இம்யூனோகல்ட்டில் (STEMCELL டெக்னாலஜிஸ்; 1% பென்ஸ்ட்ரெப் உடன் கூடுதலாக) 24 மணிநேரம் வளர்க்கப்பட்டன, பின்வரும் நிபந்தனைகளின் கீழ்: சிகிச்சையளிக்கப்படாமல், 250 μM அடினோசின் அல்லது 10 mM MNA உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது. முன் சிகிச்சைக்குப் பிறகு, CAR-T செல்கள் PBS உடன் கழுவப்பட்டு 20,000 SK-OV-3 செல்களுடன் இணைக்கப்பட்டன [ATCC; மெக்காய் 5A ஊடகத்தில் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) 10% FBS மற்றும் 1% பென்ஸ்ட்ரெப் உடன் 10 இல் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது: 1 என்ற இலக்கு விகிதத்திற்கான விளைவு துணை இம்யூனோகல்ட் ஊடகத்தில் மும்மடங்காக பெருக்கப்பட்டது. SK-OV-3 செல்கள் மற்றும் டிஜிட்டல் சபோனின் (0.5mg/ml; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) உடன் லைஸ் செய்யப்பட்ட SK-OV-3 செல்கள் முறையே எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. 24 மணிநேர கூட்டு சாகுபடிக்குப் பிறகு, சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி (LDH குளோ சைட்டோடாக்சிசிட்டி அஸ்ஸே கிட், ப்ரோமேகா) லாக்டேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் (LDH) அளவிடப்பட்டது. LDH சூப்பர்நேட்டண்ட் LDH பஃபரில் 1:50 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தப்பட்டது. கொல்லும் சதவீதம் பின்வரும் சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது: கொல்லும் சதவீதம் = திருத்தத்தின் சதவீதம் / அதிகபட்ச கொல்லும் விகிதம் x 100%, இங்கு திருத்தத்தின் சதவீதம் = இணை வளர்ப்பு-T செல்கள் மட்டும், மற்றும் அதிகபட்ச கொல்லும் விகிதம் = நேர்மறை கட்டுப்பாடு-எதிர்மறை கட்டுப்பாடு.
உரை அல்லது பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, புள்ளிவிவர பகுப்பாய்விற்கு GraphPad Prism 8, Microsoft Excel அல்லது R v3.6.0 ஐப் பயன்படுத்தவும். ஒரே நோயாளியிடமிருந்து பல மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டால் (ஆஸ்கைட்ஸ் மற்றும் கட்டி போன்றவை), நாங்கள் ஒரு ஜோடி t சோதனையைப் பயன்படுத்துகிறோம் அல்லது பொருத்தமான ஒரு நேரியல் அல்லது பொதுமைப்படுத்தப்பட்ட மாதிரியில் நோயாளியை ஒரு சீரற்ற விளைவாகச் சேர்க்கிறோம். வளர்சிதை மாற்ற பகுப்பாய்விற்கு, முக்கியத்துவ சோதனை மூன்று மடங்காக செய்யப்படுகிறது.
இந்தக் கட்டுரைக்கான துணைப் பொருட்களுக்கு, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ஐப் பார்க்கவும்.
இது கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் அட்ரிபியூஷன்-வணிகமற்ற உரிமத்தின் விதிமுறைகளின் கீழ் விநியோகிக்கப்படும் ஒரு திறந்த அணுகல் கட்டுரையாகும், இது எந்தவொரு ஊடகத்திலும் பயன்பாடு, விநியோகம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது, இறுதிப் பயன்பாடு வணிக ஆதாயத்திற்காக அல்ல, மேலும் அசல் படைப்பு சரியானது என்பதே அடிப்படை. குறிப்பு.
குறிப்பு: நீங்கள் பக்கத்திற்கு பரிந்துரைக்கும் நபர் மின்னஞ்சலைப் பார்க்க வேண்டும் என்றும் அது ஸ்பேம் அல்ல என்றும் தெரிந்துகொள்ளும் வகையில் மட்டுமே உங்கள் மின்னஞ்சல் முகவரியை வழங்குமாறு நாங்கள் உங்களிடம் கேட்கிறோம். எந்த மின்னஞ்சல் முகவரிகளையும் நாங்கள் கைப்பற்ற மாட்டோம்.
நீங்கள் ஒரு பார்வையாளரா என்பதை சோதிக்கவும், தானியங்கி ஸ்பேம் சமர்ப்பிப்பைத் தடுக்கவும் இந்தக் கேள்வி பயன்படுத்தப்படுகிறது.
மரிசா கே. கில்கோர் (மரிசா கே. கில்கோர்), சாரா மேக்பெர்சன் (சாரா மேக்பெர்சன்), லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ் (லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ்), அபிகெய்ல் எலி அரிஸ் ஜி. வாட்சன் (எச். வாட்சன்), ஜான் ஸ்டாக் (ஜான் ஸ்டாக்), பிராட் எச். நெல்சன் (டிபிராட் நெல்சன்), ஆர். (ரால்ப் ஜே. டிபெரார்டினிஸ்), ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ் (ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ்), ஃபினாஸ் டி. ஹாமில்டன் (பினியாஸ் டி.
MNA, T செல்களின் நோயெதிர்ப்பு அடக்குதலுக்கு பங்களிக்கிறது மற்றும் மனித புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான ஒரு சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்காகும்.
மரிசா கே. கில்கோர் (மரிசா கே. கில்கோர்), சாரா மேக்பெர்சன் (சாரா மேக்பெர்சன்), லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ் (லாரன் ஜி. ஜக்காரியாஸ்), அபிகெய்ல் எலி அரிஸ் ஜி. வாட்சன் (எச். வாட்சன்), ஜான் ஸ்டாக் (ஜான் ஸ்டாக்), பிராட் எச். நெல்சன் (டிபிராட் நெல்சன்), ஆர். (ரால்ப் ஜே. டிபெரார்டினிஸ்), ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ் (ரஸ்ஸல் ஜி. ஜோன்ஸ்), ஃபினாஸ் டி. ஹாமில்டன் (பினியாஸ் டி.
MNA, T செல்களின் நோயெதிர்ப்பு அடக்குதலுக்கு பங்களிக்கிறது மற்றும் மனித புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான ஒரு சாத்தியமான நோயெதிர்ப்பு சிகிச்சை இலக்காகும்.
©2021 அறிவியல் முன்னேற்றத்திற்கான அமெரிக்க சங்கம். அனைத்து உரிமைகளும் பாதுகாக்கப்பட்டவை. AAAS என்பது HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef மற்றும் COUNTER ஆகியவற்றின் பங்குதாரர். அறிவியல் முன்னேற்றங்கள் ISSN 2375-2548.